Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях

Медицина      Постоянная ссылка | Все категории

Семёнов

Александр Васильевич

Характеристика антагонистической активности бактерий

при межмикробных взаимодействиях

03.00.07 – «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оренбург – 2009

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза

Уральского отделения Российской Академии Наук

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор, кафедра микробиологии ОрГМА Усвяцов Борис Яковлевич

Кандидат биологических наук

доцент, лаборатория природных микробиоценозов

ИКВС УрО РАН Яценко-Степанова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится «30» апреля 2009г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460014, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии

Автореферат разослан «27» марта 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Антагонистическая активность бактерий определяет выживание микроорганизмов при их взаимодействии в бактериальных ассоциациях, которые являются частью ассоциативного симбиоза – многокомпонентной системы, где кроме хозяина и доминантного микросимбионта учувствуют ассоциативные симбионты, выполняющие функцию формирования и обеспечении стабильности и продуктивности симбиоза (Бухарин и др., 2007). При этом антагонистическая активность доминантной микрофлоры регулируется ассоциативными бактериями.

Известно, что продукция бактериями различных антимикробных веществ – антибиотиков, бактериоцинов, литических ферментов подвержена микробной регуляции (Егоров, 2004, Barefoot et al., 1994, Bronneke, Fiedler, 1994) и определяет взаимодействие между микроорганизмами в ассоциациях, способствуя стимуляции бактериального антагонизма (Вахитов, 2007, Barefoot et al., 1994, Mearns-Spragg et al., 1998, Yan et al., 2003, Dubuas, Haas, 2007). К сожалению, антагонистические свойства бактерий при межмикробных отношениях недостаточно охарактеризованы, не ясна роль индукторов антагонизма – феромонов, гомосеринлактонов, клеточных стенок – при реализации отношений антагонистического типа на межвидовом уровне, не определено для большого числа антимикробных факторов связь между изменением их продукции и выраженностью антагонистской активности. К малоизученным явлениям следует отнести биотическую регуляцию антагонизма бактерий, обусловленного литическими ферментами – β-гликозидазами, пептидазами, амидазой. Открытым остается вопрос и о практическом использовании регуляторов антагонистической активности бактерий в формировании колонизационной резистентности хозяина.

Изучение этих вопросов открывает перспективы выявления новых механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа, через регуляцию антагонизма автохтонных бактерий ассоциативными микроорганизмами. Исследования по стимуляции антагонизма позволят разработать подходы к созданию новых лечебно-профилактических биопрепаратов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования – изучить влияние микроорганизмов на антагонистическую активность бактерий и продукцию ими антимикробных веществ.

Задачи:

1.  Оценить существующие методы исследования антагонистической активности бактерий и разработать методику для определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий.

2.  Исследовать влияние метаболитов и фрагментов клеточной стенки бактерий на антагонистическую и β-гликозидазную активности исследуемых антагонистов.

3.  Изучить в условиях in vitro влияние микроорганизмов-ассоциантов на антагонистическую активность бактерий-пробиотиков.

НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработан количественный метод исследования антагонистических отношений между бактериями, основанный на сравнительной оценке антагонизма штамма, выросшего в присутствии / отсутствии клеточных компонентов культуры-регулятора, пригодный для изучения межвидовых взаимодействий между различными микроорганизмами (заявка на получение патента РФ 2008100982/13А). Показано, что бактериальный антагонизм подвержен регуляции со стороны микроорганизмов различных таксонов, где модулирующим антагонизм эффектом обладают как метаболиты, так и пептидогликаны бактерий.

Обнаружено неизвестное ранее свойство бактериального пептидогликана – регулировать внутриродовой и межродовой антагонизм прокариот в условиях межмикробных отношений.

При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от чувствительных культур, связанная со стимулирующим действием метаболитов и пептидогликанов чувствительных бактерий.

Изучение отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой под воздействием метаболитов и пептидогликанов различных микроорганизмов, выявило индифферентное, стимулирующее и ингибирующее действие бактерий-регуляторов. Обнаружена способность бактерий-регуляторов изменять изначально наблюдаемый антагонизм от полного ингибирования признака до ростстимулирующего эффекта.

Регуляция антагонистической активности осуществляется за счет продукции антимикробных веществ, в частности, литических ферментов. Выявлена связь между изменением антагонистической и β-гликозидазной активностями микроорганизмов под воздействием метаболитов и пептидогликанов бактерий-регуляторов.

На основе стимуляции антагонизма при межмикробных взаимодействиях предложены критерии отбора пробиотических штаммов и предложена модель создания поликомпонентных пробиотиков. В условиях in vitro доказана возможность использования пептидогликанов и/или метаболитов патогенных и пробиотических бактерий в качестве пребиотиков, пригодных для стимуляции антагонистической активности представителей нормальной микрофлоры человека и штаммов-пробиотиков.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработанный метод определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий может быть рекомендован для научно-исследовательской работы лабораторий микробиологического профиля при изучении бактериальных механизмов колонизационной резистентности и поиска новых биопрепаратов – стимуляторов антагонизма.

Разработаны критерии отбора бактерий для создания комбинированных биопрепаратов, состоящих из антагониста и его стимулятора. На основе взаимной стимуляции антагонистических свойств микроорганизмов предложена новая комбинация бактерий из известных пробиотиков, превосходящая по антагонистической активности монопрепараты: E. сoli М-17 и E. faecium.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Антагонистическая активность бактерий в условиях микросимбиоценоза – результат взаимодействий между микроорганизмами, где активный штамм выполняет роль продуцента антимикробных веществ, а ассоциативные бактерии определяют возможность и выраженность проявления антагонизма.

2. Бактериальный пептидогликан – регулятор межмикробных взаимодействий в системе «прокариот-прокариот».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований доложены на международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и эксперименральных системах» (Москва, 2004), V Всероссийской конференции “Персистенция микроорганизмов” (Оренбург, 2006), III Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов «Современные проблемы экологии микроорганизмов» (Пермь, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, три главы собственных исследований, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 35 отечественных и 200 иностранных научных источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами, 18 рисунками и 1 фото.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили штаммы-антагонисты различных таксонов, выделенных из женского репродуктивного тракта: 12 штаммов Enterococcus faecalis, 5 штаммов Lactobacillus casei, 3 штамма Corynebacterium minutissium и 2 штамма Staphylococcus aureus. Также использовали антагонистически активные культуры из коллекции ИКВС УрО РАН – 2 вагинальных изолята L. acidophilus, 10 штаммов Staphylococcus aureus, выделенные из носовой полости, 2 штамма Bacillus subtilis и 6 штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенные из различных биотопов и штаммы-пробиотики Escherichia coli M-17 («Колибактерин»), L. plantarum 8РА-3 («Лактобактерин»), Bifidobacterium longum («Бифиформ»), Enterococcus faecium («Бифиформ»), B. subtilis №534 («Споробактерин»). Для выделения и идентификации микроорганизмов использовали общепринятые методы. Культивирование бактерий проводили на среде Мана-Рогоза-Шарпа (МРС, «HiMedia») и 1,5% пептонной воде (ПВ; НПО «Питательные среды») при 37 0С. Культуральную жидкость и клеточные экстракты бактерий получали традиционными способами, которые обеззараживали хлороформом.

Пептидогликаны бактерий получали по Герхардту (Методы бактериологии…,1984), с дополнительной обработкой микробной биомассы смесью этилового спирта и хлороформа, щелочью и ацетоном. Ацетоновый раствор фрагментов клеточной стенки исследуемой культуры высушивали при комнатной температуре, затем ресуспендировали необходимое количество в жидкой питательной среде (MРС для лактобактерий и ПВ для остальных микроорганизмов) и обеззараживали автоклавированием при 0,5 атм, 30 минут. При получении фрагментов пептидогликана из грамотрицательных бактерий, перед всеми описанными операциями, размороженную биомассу бактерий обрабатывали горячим (65 0С) 10% водным раствором фенола.

Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали методы прямого антагонизма по Murray (1950), в модификации Усвяцова (1967) и отсроченного антагонизма по Frederiq (1957). Для количественной оценки признака использовали метод Бухарина с соавт. (патент РФ № 2175673).

Антагонистическую активность штамма выражали двумя способами – через % угнетения и степень прироста тест-культуры при культивировании её с культуральной жидкостью антагониста.

Определение общей β-гликозидазной активности бактерий проводили с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты (Miller, 1959) по увеличению количества восстанавливающих сахаров при гидролизе субстрата – клеточных стенок микроорганизмов (в работе M. luteus №2665). Определение β-N-ацетилглюкозаминидазной активности бактерий (КФ 3.1.2.52) проводили микрометодом, с использованием хромогенного субстрата N-ацетилглюкозамина, меченого по β-1,4-гликозидной связи паранитрофенолом (Fermor et al., 1991). Наличие у штамма лизоцимной активности (КФ 3.1.2.17) диагностировали в случае положительной реакции на β-гликозидазную активность, на фоне отсутствия активности аминидазы.

Определение активности пептидаз или N-ацетилмурамоиламидазы (КФ 3.1.2.28) бактерий проводили с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола (Ghuysen, 1966) по увеличению количества свободных аминогрупп при гидролизе субстрата – клеточных стенок микроорганизмов (в работе M. luteus №2665).

Ферментную активность выражали в мкмоль/ч*мл – мкмоль продукта, образующегося за 1 час инкубации при 37 0С в 0,025М натрий-калий-фосфатном буфере (рН=6,2) субстрата с культуральной жидкостью исследуемой культуры, в пересчете на 1 мл.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием параметрических методов вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990). Все эксперименты проводили в двух повторностях при трехкратном воспроизведении.

Результаты исследования и их обсуждение

Существующие методы исследования микробной регуляции бактериального антагонизма основаны на принципе сокультивирования взаимодейсвиующих бактерий (Barefoot et al., 1994, Maldonado et al., 2004, Mearns-Spragg et al., 1998, Yan et al., 2003, Dubuas, Haas, 2007). Но эти методы оказались малопригодны для изучения отношений между бактериями с различными требованиями к питанию, между тремя и более видами микроорганизмов. Это обстоятельство определило необходимость разработки нового метода исследования регуляции антагонистических свойств бактерий, с учетом указанных недостатков. Используя известные данные о наличии у бактерий регуляторных молекул (Хохлов, 1988, Brurberg et al., 1997, Taga, Bassler, Whitehead, 2001, Bodman, Willey, Diggle, 2008), нами был разработан количественный метод исследования антагонистических отношений между бактериями, основанный на сравнительной оценке антагонизма штамма, выросшего в присутствии / отсутствии клеточных компонентов культуры-регулятора, пригодный для изучения межвидовых взаимодействий между различными микроорганизмами.

При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от чувствительных культур. Установлено определяющее значение клеточных компонентов тест-культуры M. luteus в проявлении антагонистической активности E.faecalis, C.minutissium и S.aureus в отношении микрококка (рис. 1). Другими словами, выраженная продукция антимикробных веществ активными культурами происходила только при их культивировании с чувствительным штаммом. Для сильных антагонистов, таких как лактобактерии, синегнойная палочка и бациллы характерно конститутивное проявление признака, слабо зависимое от тест-культур.

Схожие данные были получены на чувствительных культурах S.aureus, S.hominis, C.minutissimum и E.cloacae. После обработки антагонистов их клеточными компонентами активные штаммы проявляли к ним антагонизм в большей степени по сравнению с контролем. Данную зависимость оказалось возможным выявить «чашечным» способом, в модификации метода Фредерика путем добавления в среду культивирования антагониста компонентов тест-культуры, но частота выявления и выраженность признака были много ниже, по сравнению с разработанным методом.

Рис. 1 – Выраженность антагонистической активности бактерий к M. luteus в зависимости от присутствия его клеточных компонентов в среде культивирования антагониста.

Полученные результаты по зависимости проявления антагонистической активности бактерий от чувствительной культуры позволяют заключить, что антагонизм – результат межмикробных отношений между активной и чувствительной культурами.

Механизм стимулирующего действия тест-культур вероятно связан с индукцией/стимуляцией продукции антимикробных веществ антагонистом. Описаны два типа индукторов антагонизма из чувствительных культур – пептиды индукции бактериоциногении (Barefoot et al., 1994, Maldonado et al., 2004) и клеточные стенки микроорганизмов, стимулирующие синтез литических ферментов у антагонистов в системах «эукариот – эукариот» (Elad, 1996, Haran et al., 1996, Patterson, Boris, 1997) и «эукариот – прокариот» (Ordentlich et al., 1988, Fermor, Wood, 1997, Nelsen et al., 1998, Watanabe et al., 1990, 1999, Fguira et al., 2008).

На следующем этапе работы мы изучили отношения между тремя видами микроорганизмов: штаммом-антагонистом и чувствительной культурой под воздействием различных бактерий-регуляторов. Исследовали антагонизм E.faecalis, S.aureus и L.casei по отношению к различным тест-культурам из числа автохтонной и аллохтонной микрофлоры под воздействием различных микроорганизмов-регулятров. Исследования показали, что антагонистическая активность бактерий при межвидовых отношениях подвержена регуляции со стороны микроорганизмов различных таксонов. Модулирующим антагонизм эффектом обладали как метаболиты, так и фрагменты пептидогликана бактерий, причем без выраженных таксономических особенностей. Регуляцию антагонизма наблюдали по направлениям – индифферентное, стимулирующее, ингибирующее и инвертирующее, т.е. полное ингибирование признака с переключением на стимуляцию роста (табл. 1). Изученные бактерии-регуляторы обладали, в основном, способностью ингибировать и инвертировать проявление антагонизма. Наиболее выражено эти свойства проявлялись у S.hominis и энтеробактеров. Для бактерий-регуляторов было отмечено, что действие их клеточных компонентов проявлялось по-разному в отношении одного и того же антагониста. Так, метаболиты S.aureus и E.agglomerans ингибировали антагонизм E.faecalis в отношении индикаторной культуры S.aureus, в то время как клеточные стенки – стимулировали его (табл. 1). Тип влияния (стимулирование, инверсия и др.) одних и тех же их клеточных компонентов бактерий-регуляторов зависит от вида тест-культур. Так, клеточные компоненты E.agglomerans ингибировали антагонизм S.aureus в отношении L.casei, но усиливали проявление признака в отношении L.acidophilus (табл. 2).

Табл. 1 – Влияние бактерий-регуляторов различных таксонов на

антагонистическую активность E.faecalis.

штамм-антагонист E.faecalis

вид

КК

индикаторные культуры

S.aureus

L.casei

E.cloacae

бактерии-регуляторы

в контроле штамм-антагонист антагонистически активен

S.aureus

М

ПГ

-

+

+

+

+

И

S.hominis

М

ПГ

И

-

-

-

0

И

C.minutissimum

М

ПГ

+

+

0

+

+

И

E.agglomerans

М

ПГ

-

+

И

И

-

-

E.cloacae

М

ПГ

+

И

-

-

-

И

Табл. 2 – Влияние бактерий-регуляторов различных таксонов на

антагонистическую активность S.aureus.

штамм-антагонист S.aureus

вид

КК

индикаторные культуры

L.acidophilus

L.casei

бактерии-регуляторы

в контроле штамм-антагонист антагонистически активен

E.faecalis

М

ПГ

И

-

И

+

S.hominis

М

КС

И

И

И

И

C.minutissimum

М

ПГ

0

+

-

+

E.agglomerans

М

ПГ

0

+

И

-

E.cloacae

М

ПГ

И

0

И

И

Примечание: КК – вид клеточного компонента: метаболиты (М) и пептидогликан (ПГ). Действие на антагонизм штамма-антагониста: «0» – индифферентное, «+» – стимулирующее, «-» – ингибирующее, «И» – инвертирующее.

При изучении антагонистических отношений между грамположительными бактериями, пептидогликаны бактерий-регуляторов стимулировали антагонизм активных штаммов, тогда как при исследовании взаимодействий с участием грамотрицательных бактерий отмечено, в основном, ингибирование признака.

Исследование антагонистической активности L.casei показало, что низкие значения рН нивелируют отличия в опытных и контрольных пробах, что следует учитывать при изучении регуляции признака у молочнокислых бактерий. В условиях нейтрализации рН культуральной жидкости антагониста было выявлено, что S.hominis, E.cloacae и C.minutissimum ингибировали активность L.casei, E.agglomerans – стимулировал, а S.aureus и E.faecalis оказывали индифферентное влияние. При исследовании антагонистических отношений между близкородственными микроорганизмами установлено, что микробной регуляции подвержен не только межродовой, но и внутриродовой антагонизм. На примере отношений между L.casei и L.acidophilus показано, что антагонистическая активность L.casei возрастает после её обработки клеточными компонентами изученных бактерий-регуляторов, особенно их клеточными стенками. При изучении отношений между S.aureus и S.hominis наблюдали снижение активности золотистого стафилококка под влиянием изученных бактерий-регуляторов, особенно их метаболитов.

Механизмы микробной регуляции антагонистической активности бактерий могут быть разнообразными. К усилению антагонистических свойств культуры могут приводить как условия улучшения её метаболитических и ростовых характеристик (Егоров, 2004, Вахитов, 2005, 2007, Lauret et al., 1996) так и действие специфических индукторов (Черныш и др., 2008, Barefoot et al., 1994, Bronneke, Fiedler, 1994, Kleerebezem et al., 1997, Maldonado et al., 2004). Ингибирование антагонистической активности может быть связано с инактивацией бактерией-регулятором антимикробных факторов (Сидоренко, Тишков, 2004), с негативным действием на активность генов продуктов обмена, например, формиата (Kirkpatrick et al., 2001), а также с отрицательным влиянием на метаболизм антагониста бактерии-регулятора, например, за счет её антимикробных веществ. В случае микробной регуляции внутриродового антагонизма, обусловленного, вероятно, бактериоцинами, ингибирование признака можно объяснить интерферирующим действием фосфолипидов мембран (Henning, 1986), регуляторных молекул (Hauge et al., 1998) или действием протеаз бактерий-регуляторов, разрушающих антибиотики (Vandenbergh, 1993) или индукторы их синтеза (Roche et al., 2004, Rasmussen, Givskov, 2006). Повышение близкородственного антагонизма под действием метаболитов микроорганизмов может быть связано с перекрестным действием кворум молекул, опосредующих проявление бактериоциногении (Barefoot et al, 1994, Brurberg et al., 1997, Maldonado et al., 2004, Sturme et al., 2007). Стимулирующее действие пептидогликанов бактерий-регуляторов можно объяснить активацией автолитических ферментов антагониста, способных разрушать клеточные стенки родственных микроорганизмов (Захарова, 1985).

Отличия в типах влияния метаболитов от пептидогликанов бактерий-регуляторов в отношении одного антагониста, вероятно, объясняются разными мишенями и силой действия регуляторных молекул, вследствие чего, антагонисты образуют разное количество и состав активных веществ.

Учитывая, что все изученные антагонисты реагировали на фрагменты пептидогликанов бактерий-регуляторов, мы посчитали целесообразным изучить, параллельно регуляции антагонизма, и регуляцию продукции литических ферментов. В нашем исследовании E.faecalis и S.aureus обладали только β-гликозидазной активностью, причем у энтерококка достоверно выявляли только аминидазную активность, а у стафилококка только общую β-гликозидазную, что позволило у последнего диагностировать наличие лизоцима. Результаты представлены на рис. 2-4.

Исследование влияние чувствительных культур на выраженность антагонизма и активность литических ферментов E.faecalis выявило прямую связь между повышением антагонистической и β-гликозидазной активностями антагониста. Отмечено, что антагонизм в отношении грамположительных тест-культур появляется при значении аминидазной активности выше 800 мкмоль/ч*мл, в то время как при значении менее 700 мкмоль/ч*мл наблюдали стимуляцию роста тест-культур (рис.2).

Для энтеробактера, наоборот, чем выше аминидзная активность, тем ниже антагонистическая. Вероятно антагонизм E.faecalis в отношении E.cloacae не связан с литичсекими ферментами.

- контроль антагонистической активности

- антагонизм при влиянии метаболитов

- антагонизм при влиянии

пептидогликана

 

- контроль аминидазной активности

- аминидазная активность при влиянии метаболитов

- аминидазная активность при влиянии пептидогликана

 

Рис. 2 – Влияние клеточных компонентов чувствительных культур на аминидазную и антагонистическую активности E.faecalis.

Полученные данные по микробной стимуляции антагонистической и β-гликозидазной активностей бактерий в системе «штамм-антагонист – чувствительная культура» позволяют заключить, что антагонизм – результат межмикробных отношений между активной и чувствительной культурами, где эффекторами явления выступают антимикробные вещества и их регуляторы.

При исследовании связи между изменением антагонистической и β-гликозидазной активностей E.faecalis и S.aureus под действием различных микроорганизмов было установлено следующее.

У E.faecalis наблюдали увеличение аминидазной активности под действием пептидогликанов грамположительных бактерий-регуляторов и E.agglomerans, что сопровождалось увеличением антагонистической активности (рис. 3). Механизм повышения аминидазной активности при действии клеточных стенок микроорганизмов, вероятно, связан с индукцией или стимуляцией продукции или экспрессии генов синтеза литических ферментов (Головина, 1972, Haran et al. 1996, Watanabe, 1990, 1999, Zeilinger et al., 1999, Mach et al., 1999, Brunner et al., 2003).

Рис. 3 – Микробная регуляция аминидазной и антагонистической активностей E.faecalis. Индикаторная культура – S.aureus.

Различия в силе стимулирующего действия можно объяснить видовыми особенностями строения пептидогликанов бактерий-регуляторов (Schleifer, Kandler, 1972, Bronneke, Fiedler, 1994). Следует отметить, что снижение антагонистической активности энтерококка под действием метаболитов стафилококков и энтеробактеров не сопровождалось снижением аминидазной активности, что, вероятно, свидетельствует о наличии других механизмов регуляции антагонизма, не связанных с синтезом и активностью литических ферментов.

S.aureus реагировал почти на все клеточные компоненты уменьшением лизоцимной активности (рис. 4). Наименьшие значения активности наблюдали после обработки S.aureus метаболитами S.hominis, C.minutissimum и E.agglomerans что совпадало с уменьшением антагонистической активности. Механизм снижения лизоцимной активности возможно связан с репрессией генов синтеза β-гликозидаз (Lutz et al., 2003) или инактивацией фермента метаболитами бактерий-регуляторов (Бухарин, 1982, 1999, Monchois et al., 2001, Callewaert et al., 2005, Nakimbugwe et al., 2006) и/или фосфолипидами их мембран (Holtje, Tomasz, 1975, Захарова, 1985).

Рис. 4 – Микробная регуляция лизоцимной и антагонистической активностей S.aureus. Индикаторная культура – S.hominis.

В итоге, установлена прямая связь между изменением антагонистической и β-гликозидазной активностей исследуемых антагонистов под воздействием клеточных компонентов бактерий-регуляторов.

Основываясь на данных по стимуляции антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях, мы предприняли попытку анализа антагонистических характеристик пробиотических препаратов для разработки подходов к получению новых пре- и пробиотиков, отличающихся от известных стимулирующим действием на антагонизм доминантной флоры или других пробиотических бактерий. В связи с этим было оценено влияние ассоциативных бактерий на антагонизм доминантной флоры и пробиотиков (рис. 5). Оказалось, что все исследуемые культуры обладали конститутивным антагонизмом, на выраженность которого оказывал влияние ассоциативный штамм S.aureus. Метаболиты стафилококка ингибировали антагонизм L. plantarum и E. coli, но стимулировали активность E. faecium. Также стимулирующим антагонизм действием обладали фрагменты пептидогликана S.aureus в отношении B. subtilis, B. longum и L. casei.

Таким образом, было установлено, что ассоциативные микроорганизмы способны стимулировать по отношению к себе антагонизм доминантных бактерий и штаммов-пробиотиков. Причем, в качестве стимуляторов антагонизма могут быть использованы отдельные клеточные компоненты ассоциативных бактерий, в частности, пептидогликан.

- контроль антагонистической активности

- антагонизм при влиянии

метаболитов

- антагонизм при влиянии

пептидогликана

 

- контроль роста МРС

- контроль роста ПВ

 

Рис. 5 – Характеристика антагонистической активности штаммов-пробиотиков и представителей доминантной микрофлоры человека по отношению к S.aureus под влиянием его клеточных компонентов.

В дальнейшем, нами было исследовано усиление антагонистической активности при взаимодействии пробиотических штаммов в поликомпонентных препаратах. При изучении влияния E. faecium («Бифиформ») на антагонистические свойства B. longum («Бифиформ») обнаружено, что метаболиты пробиотического энтерококка значительно стимулировали антагонизм бифидобактерии, а фрагменты пептидогликана стимулировали рост B. longum (рис. 6).

Рис. 6 – Характеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии.

По оси абсцисс – тип клеточного компонента бактерии-регулятора: метаболиты (М) и пептидогликан (ПГ). * – р<0.05, «ср» – стимуляция роста. Индикаторная культура – S.aureus.

Клеточные компоненты B. longum обладали индифферентным действием в отношении антагонистических свойств E. faecium. По аналогии с «Бифиформ» были изучены другие сочетания пробиотических бактерий. Обнаружено, что E. faecium («Бифиформ») и E. coli М-17 («Колибактерин») стимулируют антимикробные и ростовые свойства друг друга, что нашло отражение в повышении антагонистической активности всей композиции, превосходящей по активности монопрепараты (рис. 6).

В итоге, установлено влияние различных бактерий на антагонистическую активность штаммов-пробиотиков. В условиях in vitro доказана возможность использования пептидогликанов и/или метаболитов патогенных и пробиотических бактерий в качестве пребиотиков, для стимуляции антагонизма представителей нормальной микрофлоры человека и штаммов-пробиотиков.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно выделить три основных момента:

1. Антагонистическая активность бактерий в условиях микросимбиоценоза – результат взаимодействий между микроорганизмами, где активный штамм выполняет роль продуцента антимикробных веществ, а ассоциативные бактерии определяют возможность и выраженность проявления антагонизма.

2. Бактериальный пептидогликан – регулятор взаимоотношений в системе «прокариот-прокариот».

3. Микробные стимуляторы бактериального антагонизма – перспективные препараты пребиотического назначения.

ВЫВОДЫ

1. Разработан количественный метод исследования антагонистических отношений между бактериями, основанный на сравнительной оценке антагонизма штамма, выросшего в присутствии / отсутствии клеточных компонентов культуры-регулятора, пригодный для изучения межвидовых взаимодействий между различными микроорганизмами.

2. Бактериальный антагонизм подвержен регуляции со стороны микроорганизмов различных таксонов. Модулирующим антагонизм эффектом обладают как метаболиты, так и пептидогликаны микроорганизмов.

3. При исследовании отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой обнаружена зависимость проявления антагонизма от чувствительных культур, связанная со стимулирующим действием их метаболитов и пептидогликанов. После обработки антагонистов клеточными компонентами чувствительных культур M.luteus, S.aureus, S.hominis, C.minutissimum и E.cloacae активные штаммы проявляли к ним антагонизм в большей степени по сравнению с контролем.

4. При исследовании межмикробных отношений между штаммом-антагонистом и чувствительной культурой под воздействием различных микроорганизмов, выявлено индифферентное, стимулирующее, ингибирующее и инвертирующее действие микроорагнизмов-регуляторов в отношении антагонизма бактерий. Способностью повышать антагонистическую активность бактерий обладали бактерии-регуляторы S.aureus, S.hominis, E.faecalis, C.minutissimum, E. agglomerans и E.cloacae.

5. Бактериальный пептидогликан является регулятором внутриродового и межродового антагонизма в условиях межмикробных взаимодействий.

6. Установлена прямая связь между изменением антагонистической и β-гликозидазной активностями исследуемых антагонистов под воздействием клеточных компонентов бактерий-регуляторов. У E.faecalis наблюдали увеличение антагонистической активности под действием пептидогликанов грамположительных бактерий-регуляторов, что сопровождалось увеличением аминидазной активности. S.aureus реагировал на метаболиты и фрагменты пептидогликана бактерий уменьшением как антагонистической, так и лизоцимной активности.

7. Разработаны подходы к усилению эффективности пробиотических штаммов in vitro. Стимуляторы антагонизма, на основе метаболитов и пептидогликанов патогенных и пробиотических микроорганизмов, перспективны для получения новых биопрепаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семёнов А.В. Изучение изменения антагонистической активности бактерий под воздействием чувствительного штамма / А.В. Семёнов // Материалы региональной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Оренбургской области. Ч. 1. Оренбург. 2004. с. 21-22.

2. Семёнов А.В. Характеристика антагонистической активности Staphylococcus aureus / А.В. Семёнов // Физиология микроорганизмов в природных и эксперименральных системах: Материалы международной научной конференции. Москва. 2004. с.37.

3. Семёнов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях / А.В. Семёнов // Материалы региональной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Екатеринбург-Пермь. 2007. с. 90.

4. Семёнов А.В. Способ повышения антагонистической активности бактерий / А.В. Семёнов // Вестник ОГУ. 2007. №6. с. 100-103.

5. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий / А.В. Семёнов, А.В.Сгибнев, С.В.Черкасов, О.В. Бухарин // Бюллетень эксп. биол. и мед. 2007. №11. с. 545-548.

6. Семёнов А.В. Влияние клеточных стенок бактерий на антагонизм Enterococcus faecalis / А.В.Семёнов, С.В.Черкасов // Мат. четв. междунар. конф., «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», С.-Петербург, 2008. с.161.

Семёнов

Александр Васильевич

Характеристика антагонистической активности бактерий

при межмикробных взаимодействиях

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора

MICROSOFT WORD 2003 for Windows

Подписано в печать 2.02.2009 г. Формат 60*84/16. Усл. печ. – 1 п.л.

Печать оперативная. Гарнитура Times.

Тираж ___ экз.

Медицина      Постоянная ссылка | Все категории
Мы в соцсетях:




Архивы pandia.ru
Алфавит: АБВГДЕЗИКЛМНОПРСТУФЦЧШЭ Я

Новости и разделы


Авто
История · Термины
Бытовая техника
Климатическая · Кухонная
Бизнес и финансы
Инвестиции · Недвижимость
Все для дома и дачи
Дача, сад, огород · Интерьер · Кулинария
Дети
Беременность · Прочие материалы
Животные и растения
Компьютеры
Интернет · IP-телефония · Webmasters
Красота и здоровье
Народные рецепты
Новости и события
Общество · Политика · Финансы
Образование и науки
Право · Математика · Экономика
Техника и технологии
Авиация · Военное дело · Металлургия
Производство и промышленность
Cвязь · Машиностроение · Транспорт
Страны мира
Азия · Америка · Африка · Европа
Религия и духовные практики
Секты · Сонники
Словари и справочники
Бизнес · БСЕ · Этимологические · Языковые
Строительство и ремонт
Материалы · Ремонт · Сантехника