Контент-платформа Pandia.ru:     2 872 000 материалов , 128 197 пользователей.     Регистрация


Генетическая трансформация. Цитоплазматическая наследственность

 просмотров


ЛЕКЦИЯ 21. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ (незавершенный черновик!)

О. Э. Костерин, ИЦиГ СО РАН и ФЕН НГУ, Новосибирск, 2012 г.

21.1. Генетическая трансформация.

21.1.1. Вводные замечания

Генетической трансформацией называется у эукариот искусственный перенос генов от одного организма другому минуя скрещивания. Определение этого термина для прокариот можно получить опустив последние два слова – регулярное половое размножение им не свойственно, также как четкое разделение на виды, а передача генетической информации посредством редкого полового процесса, зачастую между не очень родственными формами, носит нерегулярный, частичный и в какой-то степени «незаконный» характер. Другое название генетической трансформации – трансгенез. Чужеродный ген, введенный в геном, называется трансгеном. У прокариот генетическая трансформация посредством бактериофагов, переносящих встроенные фрагменты генома, называется трансдукцией. Такое же значение первоначально имел термин трансфекция, применяемый к эукариотам, однако у животных, где термин трансформация слишком широко использовался для обозначения малигнизации клеток, применение термина трансфекция расширилось до любой генетической трансформации. Результатом генетической трансформации является генетическая модификация.

Теоретическое и практическое использование. На практике чаще возникает необходимость такого переноса от одного вида к другому, в генетических исследованиях бывает нужно и в пределах вида – например, добавить “лишние” копии гена, да еще и с определенным образом управляемой экспрессией, или скомпенсировать потерю своего гена его искусственным добавлением – по сути генная терапия.

У бактерий генная транфсормация технически проста. Некоторые из них в норме способны поглащать голую ДНК, у других можно организовать такое поглощение несложными процедурами. Основная проблема у эукариот – вектор. У эукариот вирусы, мобильные элементы и специфические бактериальные векторы. Иногда вектором может служить не биологические, а механические объекты.

21.1.2.

Как вы помните из опытов Гриффитса, у бактерий можно даже смешать убитые нагреванием вирулентные стафилококки с невирулентными, и ДНК первых передавалась вторым через их капсид. Примерно 1% видов бактерий являются естественно компетентными – имеют белковые механизмы для транспорта ДНК через мембрану, например ДНК-транслоказный комплекс. У грамположительных передается одна цепь, тогда как вторая гидролизуется нуклеазами. У грамотрицательных есть дополнительная мембрана, поэтому нужны специальные каналы. Обычно неспецифично к первичной структуре ДНК, но иногда определенные последовательности могут облегчать.

Искусственное создание компетенции.

Химическая: Двухвалентные ионы – например в хлориде кальция - с последующим нагревом и охлаждением. Механизм неясен. Координнация отрицательного заряда клеточной стенки кишечной палочки, эффект насоса при нагревании.

Электропорация полем 10-20 кВ/см. Дыры в мембране, скоро восстанавливающиеся.

Компетентные клетки продаются.

21.1.3. Генетическая трансформация у дрозофилы

У дрозофилы Рубин и Спрадлинг в 1982 г. Р элемент. Два по разному испорченных Р элемента вводится одновременно. У одного на место транспозазы вставлено то, что хотят вставить – до 20 кб; у второго (Р элемент-хелпер) ген транспозазы не поврежден, но поврежден один из концевых повторов, так что он транскрибирует мРНК транспозазы, но сам не может встроиться. Нарабатывается в плазмидах. Вводится микроинъекциями в эмбрион, после чего выживает около 10% или чуть более. Экспрессия трансгена либо легко регистрируется, либо в транспозон вводят репортерный ген, у которого она легко регистрируется, на основе чего судят об успехе трансформации – например ген белка зеленой флюресценции от медузы.

Задачи.

1. Выяснение участков ДНК, достаточных для нормальной экспрессии гена. Вводится в гомозиготу или гемизиготу по аморфной мутации. Должен исправить генетический дефект.

2. Изучение работы регуляторных участков ДНК отдельно от их генов. Составной трансген, составленный из изучаемого регуляторного участка и репортерного гена, например гена LacZ бета-галактозидазы. (Гидролиз одного из синтетических субстратов, галактозида X-gal, нерастворим и имет синюю окраску, так что обработанные иsм клетки синеют, если бета-галактозидаза работала.) Впервые в Австрии В. Геринг в 1985 г. с регуляторным участком к гену гомеозисному гену ftz. Сокращая регуляторные участки, можно узнать конкретные последовательности, ответственные за включение или выключение в определенных клетках.

3. Изучение компактизации хроматина, эффекта положения. Трансгены с wmini – аллель со слабой экспрессией, сильно зависящей от окружения. Смотрят куда встроился и какой уровень транскрипции. Место узнают грубо по in situ гибридизации на политенных хромосомах, точно – секвенируя окружение.

4. Экспрессировать гены из других организмов. Например, проверена инактивирующая роль Cla-повтора из генома Chironomus thumii в составном трансгене следующего состава: репортерный ген, Cla, и целевой ген, на экспрессию которого предполагалось влияние присутствия Cla в 5’-кодирующей области. Внедрен в в геном мух гомо- или гемизиготных по мутациям обоих генов. Если эксрессия репортерного гена есть, а исследуемого другого – нет, то значит трансген встроился и работает, но второй ген подавлен Cla. В источнике говорилось о том, что целевым геном был w+, Cla действительно подавлял его экспрессию, но мозаичным образом, наподобие эффекта положения. (Там же говорилось, что репортерным геном был ry+, что невозможно на фоне гомозигот w w, поскольку ry гипостатичен w – если глаза белые, то ry не имеет фенотипического проявления и мы не можем по этому гену сделать вывод об успешности трансформации, то есть о присутствии трансгена.)

5. Энхансерная ловушка. Поиск наборов совместно экспрессирующихся генов. В гг. в лаборатории того же Геринга. Взяли Р элемент, имеющий ген lacZ под слабым промотором, в норме почти не работающим. Кроме того, там были репортерный ген ксантингидрогеназы ry+ позволяющий констатировать успешность встраивания транспозона и возможность экспрессии генов под сильным промотором (таковым в случае репортерного ry+ является его собственный промотор), а также элементы, нацеленные на последующее молекулярно-генетическое изучение окрестностей встройки: полилинкеры – участки распознания разными рестриктазами, да еще в придачу и популярная в генной инженерии плазмида Bluescript. (Кроме того, там же присутствовал репортерный ген алкогольдегидрогеназы Adh, позволяющий следить за этой конструкцией в тех бактериях, где он нарабатывается.)

Если P элемент попадал под действие активных энхансеров, транскрипция lacZ усиливалась. Окрашивая нужные клетки в нужное время с помощью X-gal, можно было выбрать трансгенные линии мух, у которых трансген попал в окрестности энхансеров, активных именно в них и в это время. Разрезая геномную ДНК рестриктазами и заново легируя отрезки, можно собрать плазмиду Bluescript, в которую будет встроено геномное окружение трансгена и просеквенировать его, тем самым установив и сам энхансер, и ген, который он активирует.

6. Трансгены, экспрессирующиеся в нужный момент. Промоторы генов теплового шока реагируют на температуру. В трансгене можно объединить такой промотор и исследуемый ген, встроить и поднять температуру в нужное вмеря.

7. Трансгены, экспрессирующиеся желательным образом, в нужных клетках в нужное время. Ограничено лишь существованием соответствующих энхансеров у дрозофилы в норме. Вместо того, чтобы в случае исследования каждого нового гена трансформировать им дрозофил, получать случайным образом встроенные трансгены и отбирать из них те, которые встроились под нужным энхансером, применяют бинарную систему – коллекцию однотипных встроек под разными энхансерами, оказывающими на них cis-влияние, и коллекцию встроек разных генов, которая постоянно пополняется. Дело осталось за малым – функционально связать те и другие. Для этого в дрозофилу фактически встраивается сразу целое звено генной сети. Встройки под разными энхансерами содержат дрожжевой ген Gal4, который кодирует белок, активирующий транскрипцию у дрожжей. Никакого фенотипа экспрессия этого гена у дрозофилы не имеет. Однако он способен активировать дрожжевой промотор UAS. Поэтому в трансгенах второго типа разные гены поставлены под этот самый дрожжевой промотор UAS. В отсутствии белка GAL4 он неактивен, поэтому линии мух из второй коллекции сами по себе также не имеют своего особого фенотипа. Однако если скрестить линию первого типа с линией второго типа, в геноме гибридной мухи будет присутствовать и дрожжевой ген Gal4, встроившийся под cis-регуляцию того или иного энхансера, и trans-регулиремый его продуктом промотор UAS в связке с изучаемым геном. Таким образом, cis-сигнал из одного родительского генома посредством одной из встроек передается дополнительным trans-сигналом в другую встройку, находящуюся во втором родительском геноме. Имея две такие коллекции линий, можно поставить любой ген из второй коллекции под регуляцию любым энхансером из первой коллекции. И тем самым изучать, что будет происходить с мухой вследствие экспрессии трансгена, регулируемой тем или иным образом.

Поразительным и ставшим хрестоматийным примером использования этой системы является изучение генов, контролирующих развитие глаз у дрозофилы. В лаборатории Геринга мухам, мутантным по мутации eyeless, блокирующей развитие глаз, при помощи GAL4-UAS системы был введен функциональный аллель eyeless+ под управлением энхансера, активирующего экспрессию в ногах, крыльях и головном отделе. У них развились нормальные глаза, а также небольшие глаза на ногах, крыльях и антеннах. Поразительно, но к такому же эффекту привело встраивание гена Small eye, стимулирующие ранние этапы формирования глаза у мыши – и это при всей разнице в строении камерного глаза мыши и фасеточного глаза дрозофилы!

На основании первичной структуры было ясно, что эти гены являются отдаленными ортологами, но они оказались к тому же и функционально заменимы.

21.1.4. Генетическая трансформация у млекопитающих и прочих животных

Для животных чаще применяется термин «трансфекция»

Для культур клеток:

В суспензии, получаемой от смешивания раствора ДНК и хлорида кальция с фосфатным буфером – образуется тонкий преципитат фосфата кальция, на который сорбирована ДНК, добавляется к культуре клеток, растущих монослоем.

В липосомах с катионными фосфолипидами (липофекция).

В связи ДНК с поликатионами, поглощаемыми эндоцитозом.

Электропорация, сонопорация, порация сфокусированным лазером.

Слияние бактериальных протопластов с клетками.

На нанофибриллах

Гидродинамическая доставка – быстрые, примерно за 10 секунд, инъекции большого объема раствора, содержащего ДНК в плазмидах, в кровь печени, после чего такая ДНК экспрессируется в клетках печени.

Золотая пушка на золотых частицах.

На магнитных частицах под действием поля.

В основном в геном не интергируется, экспрессируется, но теряется в митозе. Для отбора встроек в геном в трансген добавляется устойчивость к токсину. Даже специальный токсин «генетицин» и ген устойчивости к неомицину.

21.1.5. Генетическая трансформация у растений

Agrobacterium. Использует горизонтальный перенос генов для того, чтобы вызывать опухоль – корончатые галлы - у растений и там жить. A. tumifaciens – у перехода стебля в корень A. rhizogenes на корнях. Передают Ti-плазмиду и Ri-плазмиду. Содержат гены биосинтеза опинов – сконденсированных через аминогруппу аномальных аминокислот, которые служат источника углерода и азота, недоступные другим бактериям, а также гормона ауксина и цитокинов. Все гены можно удалить, оставив небольшие фланкирующие повторы в 25 нуклеотидов, чего достаточно для встройки. Вставляют нужные гены плюс ген устойчивости к антибиотику, необходимый для селекции трансформантов (пластиды растения чувствительны). Обрабатывают протопласты, каллус, листовые диски, или прямо капают в цветы.

Или агроинфильтрация - инъекции агробактера с нужной плазмидой в лист, или же в вакууме опустошают устьица, погружают в раствор, а потом восстанавливают давление и он устремляется в полости. При таком методе множественные встройки – не делают селекции на стабильные трансгены, а прямо пользуются выходом продукта.

Не все растения можно так трансформировать.

Золотая пушка – частички золота или. Эффективность меньше, но можно все растения, а также геном пластид.

Электропорация, как у бактерий.

Трансдукция – вставка в вирус. Однако большинство растительных вирусов несут одноцепочечную РНК и размножаются в цитоплазме, поэтому речь может идти о введении РНК, с которой может транслироваться нужный белок, но с которой ничего не встраивается в геном. Такая инфекция сохраняется во всем растении, но не передается потомкам от его полового размножения. Часто предпочитается поскольку формально сам организм не является генно модифицированным, ничто не встраивается в геном. В частности, так передают устойчивость к грибковым болезням.

21.1.3. Последствия генетической транфсормации и связанные с ними проблемы.

21.1.3.1. Замолкание трансгенов.

21.1.3.2. Безопасность генетически модифицированных организмов.

Будучи гетеротрофами, питающимися целыми живыми организмами, мы приспособлены к тому, чтобы питаться в том числе чужими геномами со всеми без исключения чужими генами, вирусами, транспозонами и пр. Сколько чужеродных генов мы съедаем за обедом? Полные геномы коровы (окологенов), пшеницы, картофеля, лука, петрушки, укропа, какао, чего-нибудь плодового (погенов каждый) = разных чужеродных генов, плюс неимоверное количество мусорной ДНК и неизвестное количество геномов бактерий. И наш груз мутаций определяется не этим, а таким химическим параметром, как мутабильность ДНК, общей протяженностью важной генетической информции - генов, структура которых для нас небезразлична, и нашими собственными мобильными элементами и вирусами.

ГМО могли бы быть опасными в двух случаях:

- опасность самого трансгена, например, вследствие аллергии именно на него как на специфический антиген. Недостаточно съесть «белок индейки» при «аллергии на индейку», нужно чтобы именно продукт трансгена был бы тем антигеном, к которому сенсибилизирован организм. Вероятность ничуть не выше, чем случайно съесть такой антиген в немодифицированных продуктах

- сохранение вектором трансформирущей способности при поедании, включая проникновение в клетки человека и встройку в геном. В принципе, показана способность бактерии встраивать Ti-ДНК в некоторые клетки человека в культуре и в эмбрионы морских ежей. Исключено для тех усеченных Ti-плазмид, которыми трансформируются растения. Но чем это отличается от активности наших собственных транспозонов, которые составляют до половины генома?!

Реальная «опасность» – вытеснение традиционных сортов коммерчески успешными сортами (как модифицированными, так и немодифицированными), имеющими невысокую вкусовую ценность вследствие отбора по другим показателям.

21.2. Цитоплазматическая наследственность.

21.2.1. Геном пластид и митохондрий.

21.2.2. Наследование мтохондрий и пластид.

21.2.3. Конфликт ядра и цитоплазмы.

21.2.4. Цитоплазматическая мужская стерильность.

Мы в соцсетях:


Подпишитесь на рассылку:
Посмотрите по Вашей теме:

Наследственность


Генетика

Проекты по теме:

Направления медицины
АкушерствоАлгологияАллергологияАнгиологияАндрологияАнестезиологияБариатрическая хирургияБариатрияВенерологияВертеброневрологияВетеринарияВнутренние болезниГастроэнтерологияГематологияГенетикаГинекологияГистологияГомеопатияДерматологияДесмургияДефектологияДиетологияИммунологияИнфекционияКардиологияКолопроктологияКосметологияЛогопедияЛучевая диагностикаМаммологияНаркологияНеврологияНеонатологияНефрологияОдонтологияОнкогематологияОнкогинекологияОнкологияОнкореабилитацияОториноларингологияОфтальмологияПедиатрияПерфузиологияПластика лицаПластическая ортопедияПластическая хирургияПодиатрияПодростковая медицинаПроктологияПсихиатрияПсихологияПсихотерапияПульмонологияРегенеративная медицинаСексопатологияСомнологияСосудистая хирургияСтоматологияТравматологияУрологияФизиатрияФизиотерапияФтизиатрияХирургияХрономедицинаЧелюстная хирургияЭметологияЭндокринология
Основные порталы, построенные редакторами

Бизнес и финансы

Бизнес: • БанкиБогатство и благосостояниеКоррупция(Преступность)МаркетингМенеджментИнвестицииЦенные бумагиНедвижимость(Аренда)ПрофессииРаботаТорговляУслугиФинансыБюджетФинансовые услугиКредитыКомпанииЭкономикаМакроэкономикаМикроэкономикаНалоги
Промышленность: • МеталлургияНефтьСельское хозяйствоЭнергетика
СтроительствоАрхитектураИнтерьерПолы и перекрытияПроцесс строительстваСтроительные материалыТеплоизоляцияЭкстерьер

Домашний очаг

ДомДачаСадоводствоДетиАктивность ребенкаИгрыКрасотаЖенщины(Беременность)СемьяХобби
Здоровье: АнатомияБолезниВредные привычкиДиагностикаНародная медицинаПервая помощьПитаниеФармацевтика

Мир

Регионы: АзияАмерикаАфрикаЕвропаПрибалтикаЕвропейская политикаОкеанияГорода мира
Россия: • МоскваКавказЭкономикаРегионы РоссииПрограммы регионов
История: СССРИстория РоссииРоссийская ИмперияВремя2016 год
Окружающий мир: Животные • (Домашние животные) • НасекомыеРастенияПриродаКатаклизмыКосмосКлиматСтихийные бедствия

Образование и наука

Наука: Контрольные работыНаучно-технический прогрессПедагогикаРабочие программыФакультетыМетодические рекомендацииШкола
Предметы: БиологияГеографияГеологияИсторияЛитератураЛитературные жанрыЛитературные героиМатематикаМедицинаМузыкаПравоЖилищное правоЗемельное правоУголовное правоКодексыПсихология (Логика) • Русский языкСоциологияФизикаФилологияФилософияХимияЮриспруденция

Общество

БезопасностьГражданские права и свободыИскусство(Музыка)Культура(Этика)Мировые именаПолитика(Геополитика)(Идеологические конфликты)ВластьЗаговоры и переворотыГражданская позицияМиграцияРелигии и верования(Конфессии)ХристианствоМифологияРазвлеченияМасс МедиаСпорт (Боевые искусства)ТранспортТуризм
Войны и конфликты: АрмияВоенная техникаЗвания и награды

Справочная информация

ДокументыЗаконыИзвещенияУтверждения документовДоговораЗапросы предложенийТехнические заданияПланы развитияДокументоведениеАналитикаМероприятияКонкурсыИтогиАдминистрации городовМуниципалитетыМуниципальные районыМуниципальные образованияМуниципальные программыБюджетные организацииОтчетыПоложенияПостановленияРегламентыТермины(Научная терминология)

Техника

АвиацияАвтоВычислительная техникаОборудование(Электрооборудование)РадиоТехнологии(Аудио-видео)(Компьютеры)

Каталог авторов (частные аккаунты)

Авто

АвтосервисАвтозапчастиТовары для автоАвтотехцентрыАвтоаксессуарыавтозапчасти для иномарокКузовной ремонтАвторемонт и техобслуживаниеРемонт ходовой части автомобиляАвтохимиямаслатехцентрыРемонт бензиновых двигателейремонт автоэлектрикиремонт АКППШиномонтаж

Бизнес

Автоматизация бизнес-процессовИнтернет-магазиныСтроительствоТелефонная связьОптовые компании

Досуг

ДосугРазвлеченияТворчествоОбщественное питаниеРестораныБарыКафеКофейниНочные клубыЛитература

Технологии

Автоматизация производственных процессовИнтернетИнтернет-провайдерыСвязьИнформационные технологииIT-компанииWEB-студииПродвижение web-сайтовПродажа программного обеспеченияКоммутационное оборудованиеIP-телефония

Инфраструктура

ГородВластьАдминистрации районовСудыКоммунальные услугиПодростковые клубыОбщественные организацииГородские информационные сайты

Наука

ПедагогикаОбразованиеШколыОбучениеУчителя

Товары

Торговые компанииТоргово-сервисные компанииМобильные телефоныАксессуары к мобильным телефонамНавигационное оборудование

Услуги

Бытовые услугиТелекоммуникационные компанииДоставка готовых блюдОрганизация и проведение праздниковРемонт мобильных устройствАтелье швейныеХимчистки одеждыСервисные центрыФотоуслугиПраздничные агентства