Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК

Образование и науки | Эта статья также находится в списках: , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , | Постоянная ссылка

Турчанинова Мария Андреевна

Возможности клинико-иммунологического использования оценки уровня внеклеточных РНК

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2010

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Л. П. Алексеев

доктор биологических наук Д. В. Ребриков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин

доктор медицинских наук, профессор З. Г. Кадагидзе

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. М. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «____»_____________ 2010 г. в ____ часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

Тел/Факс: (495) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «____» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь

Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Л. С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Исследования последних лет показали, что анализ внеклеточных ДНК и РНК, циркулирующих в плазме крови, является многообещающим диагностическим подходом. Качественный и количественный состав внеклеточных нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в плазме крови, является системным показателем, способным охарактеризовать ход патологических процессов, независимо от их локализации в организме. В настоящее время циркулирующие в плазме нуклеиновые кислоты уже используют для диагностики рака, в том числе и на ранних стадиях заболевания, когда опухоль еще не различима инструментальными методами анализа, а также при мониторинге беременности, когда на основе анализа нуклеиновых кислот плода, циркулирующих в крови матери, устанавливают пол и резус-фактор ребенка, диагностируют осложнения течения беременности и генетические заболевания плода [Anker P., et al., 2003; Bianchi D. W., 2004; Bremnes R. M., et al., 2005]. Другие области применения данных о внеклеточных нуклеиновых кислотах включают в себя мониторинг посттравматического и постинсультного состояния (в этих случаях количество циркулирующей ДНК коррелирует с обширностью поражения), а также раннюю диагностику криза отторжения трансплантата [Chang C. P.Y., et al., 2003; Lam N. Y.L., et al., 2003; Gadi V. K., et al., 2006].

К настоящему моменту накоплено значительное количество данных, описывающих природу, функции и клиническую значимость внеклеточных ДНК [Тамкович С. Н. и др., 2008]. При этом в области анализа циркулирующих РНК остается множество недостаточно изученных, противоречивых и спорных вопросов. Особый интерес вызывает тот факт, что в составе внеклеточных РНК обнаруживаются тканеспецифичные транскрипты [Chiu R. W.K., et al., 2006; El-Hefnawy T., et al., 2004; Hamaoui K., et al., 2004]. Это дает основания предположить связь профиля представленности РНК, циркулирующих в плазме, с ходом патологического процесса непосредственно в очаге его развития. А это в свою очередь означает, что оценка качественного и количественного профиля внеклеточных РНК может стать удобным инструментом для малоинвазивной диагностики, мониторинга и прогнозирования самых разных клинических состояний, в том числе и иммунозависимых патологий. В качестве исследуемых заболеваний были выбраны рак молочной железы и ревматоидный артрит – заболевания с различными формами иммунопатологий.

Цель исследования

Оценить возможности анализа качественного и количественного состава внеклеточных РНК плазмы крови в роли инструмента для диагностики иммунозависимых патологий.

Задачи исследования

1.  Разработать методику количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови.

2.  Выбрать модельные гены, уровень представленности внеклеточных РНК которых мог бы отражать функциональное состояние иммунной системы организма.

3.  С помощью разработанной методики охарактеризовать профиль представленности транскриптов анализируемых генов в плазме крови «здоровых» доноров крови.

4.  Выбрать модельные заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие, и оценить возможность использования оценки уровня внеклеточных РНК в качестве диагностического инструмента.

5.  Охарактеризовать профиль представленности транскриптов анализируемых генов в плазме крови при патологии. Сравнить полученные данные с данными, полученными при исследовании контрольной группы.

Научная новизна

Разработан метод количественной оценки в плазме крови внеклеточных РНК генов, участвующих в реализации иммунного ответа.

Охарактеризован качественный и количественный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови здорового контроля, больных ревматоидным артритом (РА) и больных раком молочной железы (РМЖ).

Получены данные о повышении уровня представленности РНК IL8, IL18 (относительно референсных генов) в плазме крови больных РМЖ по сравнению с клеточной фракцией крови больных РМЖ и по сравнению с уровнем представленности РНК данных генов в плазме крови здорового контроля. Показано, что количество транскрипта IL8 в плазме крови больных РМЖ коррелирует со способностью опухоли к метастазированию.

Показаны диагностические возможности оценки уровня внеклеточных РНК. Установлено, что при развитии РА изменение профиля представленности РНК цитокинов в плазме повторяет изменение профиля представленности РНК цитокинов в клеточной фракции цельной крови. Совпадение профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с цитокиновым профилем клеточной фракции делает количественную оценку внеклеточных РНК альтернативой определению уровня экспрессии генов клетками периферической крови.

Практическая значимость

Разработана простая и эффективная методика количественной оценки внеклеточных РНК плазмы крови, адаптированная к использованию с отечественным оборудованием. Количественное определение уровня представленности транскриптов генов иммунного ответа в плазме может обеспечить новый подход к диагностике и прогнозированию распространенных нарушений в работе иммунной системы. Разработанная система является хорошей моделью для создания диагностических инструментов, основанных на анализе внеклеточных РНК.

Показано, что качественный и количественный профиль представленности внеклеточных РНК цитокинов является диагностически значимым инструментом при оценке и характеристике таких иммунозависимых патологий, как рак молочной железы и ревматоидный артрит.

Полученные результаты создают предпосылки для использования данного подхода как в научно-исследовательских лабораториях, так и в условиях клиники, что позволяет по-новому подойти к решению проблемы ранней диагностики различных нарушений иммунитета.

Полученные данные об особенностях природы внеклеточных РНК генов иммунного ответа в плазме крови имеют общее иммуногенетическое значение и служат вкладом в развитие фундаментальной иммунологии.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: VIII Российском конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, Россия, 2007), V Международной конференции «Циркулирующие нуклеиновые кислоты в плазме и сыворотке» (Москва, Россия, 2007), 12 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биологиянаука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), 6 Международной конференции «Цитокины и воспаление» (Орландо, США, 2008), XX Международном конгрессе по генетике (Берлин, Герипния, 2008), II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, Россия, 2009).

Основные результаты диссертационной работы отражены в 8 публикациях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 107 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 10 рисунками. Список использованной литературы включает 167 источников, из них 10 отечественных и 157 зарубежных.

Материалы и методы

1. Материал для исследования

В исследование были включены три группы людей.

Первую группу больных составили 68 женщин с гистологически подтвержденным раком молочной железы. Степень распространения рака молочной железы: 16 пациенток – ранний рак молочной железы; 37 пациенток – размер первичной опухоли составил более 2см, количество пораженных лимфатических узлов не превышало трех; 12 пациенток – местно-распространенный рак молочной железы с поражением более 3 подмышечных лимфатических узлов; 1 пациентка – диссеминированный рак; 2 пациентки – стадия неизвестна в связи с первичной операцией по поводу предполагаемой узловой мастопатии в анамнезе.

Вторую группу больных составили 85 пациентов клиники института ревматологии РАМН с диагнозом артрит: 49 больных – ревматоидный артрит (женщин – 39 (79,6%), мужчин – 10 (20,4%)); 15 больных – ранний ревматоидный артрит (женщин – 12 (80%), мужчин – 3 (20%)); 21 больной – недифференцированный артрит (женщин – 14 (66,7%), мужчин – 7 (33,3%)).

Группу сравнения составляли 50 клинически здоровых добровольцев (31 женщина, 19 мужчин).

2. Получение плазмы и суммарной клеточной фракции крови

Образцы крови забирали в пробирки с ЭДТА. Все дальнейшие процедуры проводились в течение 2 часов после забора крови. Фракционирование цельной крови проводили путем двукратного центрифугирования на низких оборотах (800g). Плазму, свободную от форменных элементов, а также осадок, полученный в результате первого этапа центрифугирования и образованный суммарной клеточной фракцией крови, сразу использовали для выделения РНК.

3. Выделение РНК

Выделение РНК проводили методом фенольной экстракции по стандартной процедуре [Chomczynski P., et al., 1987]. Полученный препарат РНК сразу использовали для постановки реакции обратной транскрипции.

4. Проведение обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакции «в реальном времени» (ОТ-ПЦР)

Реакцию ОТ проводили с использованием транскрипт-специфичных олигонуклеотидных праймеров. ПЦР для каждого транскрипта (15 цитокинов и 3 нормировочных гена) ставили в отдельной пробирке. Во всех используемых ПЦР тест-системах для избежания коамплификации геномной ДНК праймеры были расположены на стыках экзонов. Визуализацию накопления продуктов ПЦР проводили с использованием линейных разрушаемых проб. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР применяли «горячий старт», который обеспечивался путем разделения компонентов реакции (праймеров и полимеразы) с помощью парафина. Реакцию амплификации проводили в приборе ДТ-96 (производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология») по следующей программе: 1 цикл – 80º С 30 сек, 94º С 1 мин; 50 циклов – 94º С 10 сек, 62º С 20 сек. Регистрацию флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 62º С.

Спектр исследованных цитокинов: интерлейкин-1b (IL1b), интерлейкин-2 (IL2), интерлейкин-4 (IL4), интерлейкин-5 (IL5), интерлейкин-6 (IL6), интерлейкин-7 (IL7), интерлейкин-8 (IL8), интерлейкин-10 (IL10), интерлейкин-12 α (IL12p35), интерлейкин-12b (IL12p40), интерлейкин-17 (IL17), интерлейкин-18 (IL18), интерферон γ (IFNγ), трансформирующий фактор роста b (TGFβ), фактор некроза опухолей α (TNFα).

Для расчета нормированных значений в эксперимент были введены три референсных гена: ген бета-2-микроглобулина (B2m), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и ген тирозинкиназы (ABL).

5. Статистическая обработка полученных результатов

Уровень экспрессии мРНК цитокинов в образцах считали согласно принципам, предложенным Vandesompele J. Фактор нормировки определяли по экспрессии мРНК генов B2m, HPRT1 и ABL.

NF = ЕRefCpRef/ ЕILCpCyt (1),

где NF – фактор нормировки, ЕRef – эффективность амплификации референсного гена, СpRefзначение индикаторного цикла для референсного гена, СpCyt – значение индикаторного цикла для гена цитокина.

Итоговый нормировочный коэффициент рассчитывали исходя из среднего геометрического значения уровня представленности трех референсных генов:

NFитог = Ср. Геом. (NFB2m, NFHPRT, NFABL) (2),

где NF – фактор нормировки.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа. Для представления исследованных количественных показателей были использованы: Ме – медианы, LQ – 25 процентиль, UQ – 75 процентиль, LD – 10 процентиль, UD – 90 процентиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам был использован U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica 7.0.

Результаты и обсуждение

1. Разработка методики количественного анализа внеклеточных РНК плазмы крови

Плазму крови, свободную от клеточных элементов, было решено получать путем центрифугирования цельной крови на низких оборотах (3000 об/мин, 800g). Центрифугирование крови на высоких оборотах неизбежно ведет к разрушению части клеток и попаданию содержащихся в них нуклеиновых кислот в плазму. Кроме того, высокоскоростное центрифугирование может приводить к искажению качественного и количественного состава внеклеточных нуклеиновых кислот в результате осаждения вместе с форменными элементами и апоптотического клеточного дебриса, который рассматривается в качестве основной формы существования внеклеточных РНК в плазме.

Для определения уровня представленности транскриптов генов цитокинов было решено использовать метод полимеразной цепной реакции «в реальном времени» в комбинации с методом обратной транскрипции. В области количественной оценки экспрессии генов данная технология обладает множеством преимуществ: ОТ-ПЦР способна работать в широком диапазоне начальных концентраций определяемого траскрипта, не требует дополнительных манипуляций с продуктом реакции после амплификации, обладая высокой чувствительностью, дает возможность определять даже единичные копии специфичного транскрипта в исследуемом объеме, позволяет с высокой достоверностью определять различия в уровне экспрессии генов в 20-30% и регистрировать РНК с почти идентичными последовательностями.

Для синтеза кДНК на матрице РНК было решено использовать транскрипт-специфичные олигонуклеотидные затравки (праймеры). Такой подход способен обеспечить обогащение кДНК по интересующим транскриптам и является наиболее чувствительным и точным при количественном определении уровня представленности транскриптов.

Последовательности праймеров и проб для ПЦР были подобраны с учетом структур экзонов и интронов таким образом, чтобы исключить взаимодействие пробы с геномной ДНК цитокинов и нормировочных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой.

Для оценки уровня представленности транскриптов РНК цитокинов решено было решено использовать относительный подход, в котором количество РНК цитокинов выравнивалось между образцами с использованием референсных генов.

Разработанная методика количественного анализа внеклеточных РНК включает в себя 5 этапов. Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Этапы количественного анализа внеклеточных РНК.

2 Выбор модельных генов и модельных заболеваний

В качестве генов, уровень представленности внеклеточных РНК которых мог бы адекватно отражать функциональное состояние иммунной системы, а значит и служить ярким примером клинико-иммунологических возможностей предложенного подхода, были выбраны гены основных цитокинов – главных регуляторов иммунологического гомеостаза в организме.

В качестве патологий, способных послужить удобными моделями для отработки метода, были выбраны два заболевания, в патогенезе которых иммунная система принимает непосредственное участие: рак молочной железы и ревматоидный артрит. Ревматоидный артрит – классическое аутоиммунное заболевание, характеризующееся чрезмерной активацией иммунной системы и, как следствие, нарушением толерантности к собственным структурам организма. Рак молочной железы – типичный пример недостаточности функций иммунной системы, проявляющейся в неспособности обеспечить эффективный ответ на развитие опухоли. Эти два заболевания представляют собой противоположные края спектра патологий иммунной системы.

3. Выбор нормировочных генов

Оптимальными для нормировки нами были выбраны три референсных гена: ген бета-2-микроглобулина (B2m), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и ген тирозинкиназы (ABL).

Стабильность экспрессии указанных генов была показана на основе анализа уровня представленности их транскриптов в клеточной фракции цельной крови. Было продемонстрировано, что эти гены экспрессируются на постоянном уровне во всех образцах вне зависимости от группы (табл. 1).

Таблица 1. Показатели Δ Ср между значением индикаторного цикла для референсного гена в образце и минимальным значением индикаторного цикла для референсного гена в выборке.

Группа

B2m

HPRT

ABL

Медиана

SD*

Медиана

SD

Медиана

SD

Контроль

1,1

0,7

1,0

0,9

1,4

0,3

РА

1,2

0,8

1,6

0,4

2,0

0,5

РМЖ

1,7

0,4

1,9

0,8

1,8

0,6

*SD – среднее квадратичное отклонение

4. Расчет эффективности амплификации для использованных систем

Необходимым условием количественного определения уровня представленности мРНК является либо схожая эффективность амплификации сравниваемых фрагментов, либо использование специальных подходов, позволяющих учесть различия в эффективности амплификации (Е). Расчет эффективности амплификации для использованных систем производился с помощью построения стандартных калибровочных кривых для раститровок образцов с известной концентрацией (табл. 2).

Таблица 2. Эффективность амплификации для использованных ПЦР-систем.

Система

E

Система

E

Система

E

HPRT

1,96

IL5

1,91

IL12b

1,92

B2m

1,90

IL6

1,96

IL17

1,97

ABL

1,92

IL7

1,96

IL18

1,95

IL1β

1,96

IL8

1,98

IFNγ

1,98

IL2

1,97

IL10

1,98

TNFα

1,98

IL4

1,94

IL12a

1,96

Tgf β

1,97

5. Анализ стабильности внеклеточных РНК плазмы вне организма

Для оценки скорости деградации внеклеточных РНК определяли уровень представленности транскриптов референсных генов (B2m, HPRT и ABL) в образцах через 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов после забора крови. Юыло установлено, что в течение 6 часов при инкубации образцов плазмы при комнатной температуре достоверного снижения концентрации внеклеточной фракции РНК не наблюдалось. По всей видимости, этот факт свидетельствует о защищенности внеклеточных РНК от деградации (например, посредством упаковки в апоптотические тельца).

Для проверки влияния на концентрацию внеклеточных РНК циклов размораживания-замораживания образцов определяли уровень представленности транскриптов референсных генов (B2m, HPRT и ABL) в образцах до замораживания плазмы при -70° С и после размораживания. Замораживание плазмы сразу после этапа фракционирования крови вело к снижению концентрации внеклеточных РНК приблизительно в 5 раз. В связи с этим хранение исследуемого материала допустимо только после этапа выделения РНК.

6. Оценка уровня экспрессии мРНК генов цитокинов при нормальном физиологическом состоянии организма

Для определения характерного профиля внеклеточных РНК в норме, профиль представленности РНК 15 генов цитокинов и 3 нормировочных генов был описан нами для группы контроля.

В ходе исследования было установлено, что количество РНК исследованных генов в плазме приблизительно в 1000 раз ниже количества тех же транскриптов в клетках крови. Количество РНК наиболее представленного из исследованных цитокинов (TGFβ) в плазме составляет около 20 000 молекул на 1 мл.

На рисунке 2 приведен профиль представленности РНК цитокинов и трех нормировочных генов (B2m, HPRT и ABL) в клеточной фракции крови здоровых людей (данные приведены только для транскриптов, обнаруживаемых в клетках крови более чем у 50% испытуемых, транскрипты IL5, IL12b, IL17 выявлялись в клеточной фракции крови менее половины обследуемых).

Рисунок 2. Профиль представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Все приведенные на рисунке гены можно разделить на три группы: гены с относительно высоким уровнем экспрессии (IL1β, IL8, TGFβ), гены с низким уровнем экспрессии (IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12α) и гены, занимающие промежуточное положение (IL18, IFNγ, TNFα). Гендерных различий в экспрессии генов цитокинов в клетках крови выявлено не было (для p≤0,05). Полученные нами результаты согласуются с литературными данными об уровне экспрессии цитокинов клетками периферической крови в норме [Molina M. A., 2006].

На рисунке 3 приведен профиль представленности РНК цитокинов и нормировочных генов в плазме крови здоровых людей.

Рисунок 3. Профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Из представленных на рисунках 2 и 3 данных видно, что РНК цитокинов, для которых установлена низкая продукции РНК в клетках крови, в плазме практически не выявляется (IL2, IL4, IL6, IL7, IL10). Исключение составляет IL12α, транскрипты которого обнаруживаются в плазме более 50% обследуемых. Однако и этот цитокин детектируется в плазме крови на пределе аналитической чувствительности метода.

Профили относительной представленности РНК большинства остальных цитокинов (IL18, IFNγ, TNFα, TGFβ) в плазме крови и в клетках крови совпадают. Но для двух транскриптов обнаружено существенное изменение уровня РНК в плазме по сравнению с клеточной фракцией крови: IL1 и IL8. Относительное количество транскриптов IL1 и IL8 в плазме крови по сравнению с клеточной фракцией снижено приблизительно в 100 раз. Гендерных различий в уровне представленности РНК цитокинов в плазме крови выявлено не было (для p≤0,05).

Обнаруженные различия профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови и клетках крови могут объясняться несколькими причинами. Во-первых, относительные количества РНК цитокинов в гибнущих клетках крови, а, следовательно, и обнаруживаемых в плазме свободных РНК, могут отличаться от цитокинового профиля, демонстрируемого пулом живых клеток. Во-вторых, не только клетки крови могут являться источником внеклеточных РНК в плазме. В этом случае изменение относительного количества транскриптов отдельных генов в плазме по сравнению с клетками крови может отражать уровень общей продукции цитокинов клетками различной локализации.

7. Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных раком молочной железы

На рисунках 4 и 5 приведены результаты сравнительного анализа представленности транскриптов цитокинов в суммарной клеточной фракции крови и плазме крови онкологических больных и здорового контроля.

Рисунок 4. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в клетках крови больных РМЖ и здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Рисунок 5. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ и здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Для 10 из 15 проанализированных генов (IL1b, IL2, IL4, IL5, IL7, IL10, IL17, IFNg, TGFb, TNFa) различий между исследуемой и контрольной группами не было выявлено ни в уровне экспрессии клетками суммарной клеточной фракции, ни в уровне представленности транскриптов в плазме крови.

Для 3 генов (IL6, IL12a, IL12b) показано увеличение как уровня экспрессии клетками цельной крови, так и уровня представленности транскрипта в плазме у больных с РМЖ. Повышение уровня IL12a в плазме крови при анализе статистической значимости обнаруженных отличий оказалось недостоверным. Полученные результаты согласуются с литературными данными об уровне экспрессии этих цитокинов при развитии РМЖ. IL6 – мощный провоспалительный цитокин, который, с одной стороны, является элементом противоопухолевого иммунного ответа, с другой – успешно используется опухолевыми клетками в качестве фактора роста. Его синтезируют клетки самой опухоли, клетки окружения опухоли и, по всей видимости, клетки периферической крови. IL12 – один из главных активаторов клеточного звена противоопухолевого иммунитета (NK, CD4+, CD8+ клеток) и индукторов синтеза противоопухолевых цитокинов (IL2, IFNg).

Два гена (IL8, IL18) продемонстрировали одинаковый уровень представленности транскрипта в клеточной фракции крови в исследуемой и контрольной группах, однако разный уровень представленности транскрипта в плазме крови для этих же групп. В плазме больных с РМЖ относительное количество РНК IL8 и IL18 существенно превышало относительное количество РНК этих генов в плазме здоровых людей. Результаты оценки статистической значимости полученных различий приведены в таблице 4. Отличия считались достоверными при p ≤ 0,05.

Таблица 3. Анализ статистической значимости отличий, полученных при сравнении уровня представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови и плазме крови больных РМЖ и здорового контроля.

Различия между группами

IL6

IL8

IL12a

IL12b

IL18

Уровень экспресии гена в клеточной фракции крови (РМЖ/здоровые)

0,0259*

(достоверно)

0,6305

(не достоверно)

0,0157

(достоверно)

0,0043

(достоверно)

0,8749

(не достоверно)

Уровень представленности транскрипта в плазме крови (РМЖ/здоровые)

0,0171

(достоверно)

0,0012

(достоверно)

0,3676

(не достоверно)

0,0132

(достоверно)

0,0054

(достоверно)

*- значения p при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни

Интересно, что, несмотря на меняющийся при патологии профиль представленности РНК цитокинов в клетках, ни для одного из исследованных транскриптов не было показано такой значительной разницы даже в клеточной фракции, как для IL8 и IL18 в плазме.

Оба этих интерлейкина непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ. IL18 – один из основных иммунорегуляторных цитокинов, принимающих участие в местном ответе организма на процесс опухолеобразования. Влияя на продукцию IFNg и активируя клетки моноцитарно-макрофагальной системы, этот цитокин является индуктором противоопухолевой реакции. Возрастание уровня локальной продукции этого цитокина в окружении опухоли свидетельствует о развитии противоопухолевого иммунного ответа.

Провоспалительный цитокин IL8 в больших количествах синтезируется клетками самой опухоли и привлеченными в зону роста опухоли клетками иммунной системы. Действуя аутокринно и паракринно, этот цитокин ингибирует апоптоз опухолевых клеток и стимулирует ангиогенез в очаге опухолеобразования, тем самым способствуя росту опухоли. Кроме того, будучи мощным хемоаттрактантом, IL8 обеспечивает формирование воспалительного инфильтрата, представленного в основном нейтрофилами, и высвобождению факторов роста, продуцируемых этими клетками.

Согласно литературе провоспалительные цитокины не только способствуют росту опухоли, но и стимулируют ее метастазирование. В связи с этим, был проведен сравнительный анализ уровня представленности РНК IL8 и IL18 в плазме для двух групп больных РМЖ с крайними проявлениями заболевания. Одну группу составили 16 пациенток с ранним раком молочной железы, другую – 12 пациенток с местно-распространенным раком молочной железы с поражением более 3 подмышечных лимфатических узлов. Результаты сравнительного анализа приведены на рисунке 6.

Рисунок 6. Профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РМЖ с крайними проявлениями заболевания.

Различий в уровне представленности РНК IL18 между двумя группами больных РМЖ не обнаружено. Относительные количества РНК IL8 в плазме больных РМЖ с метастазами достоверно превышали относительные количества РНК этого цитокина в плазме больных с опухолью небольшого размера (для р≤0,05). Известно, что у больных с метастазирующей опухолью молочной железы усиливается продукция IL8 раковыми клетками и клетками стромы. Способность продуцировать IL8 показана даже для метастазирующих опухолевых клеток. Стимулируя ангиогенез и увеличивая количество кровеносных сосудов в зоне роста опухоли, IL 8 способствует распространению метастаз и дистантному распространению самого IL8. Эндотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности оба рецептора к IL8 – CXCR1 and CXCR2. Действуя на эти рецепторы, IL8 повышает экспрессию молекул адгезии, необходимых для взаимодействия с опухолевыми клетками.

Увеличение относительного количества транскриптов генов IL8 и IL18 в плазме крови онкологических больных свидетельствует, во-первых, о вовлеченности этих цитокинов в патогенез РМЖ, а, во-вторых, говорит в пользу гипотезы о связи профиля представленности РНК цитокинов в плазме с уровнем продукции цитокинов в зоне роста опухоли.

Обнаруженные отличия в уровне представленности РНК IL8 и IL18 в плазме крови больных РМЖ и здоровых людей позволяют использовать эти цитокины в дальнейшем в качестве маркеров, ассоциированных с развитием РМЖ. На данном этапе работы говорить о количественной оценке представленности внеклеточных РНК маркерных цитокинов как о самостоятельном инструменте диагностики РМЖ нельзя. Однако полученные нами результаты могут быть использованы в качестве дополнительно исследуемого параметра при диагностике заболевания, мониторинге его течения, оценке степени прогрессии. Для клинической диагностики можно рекомендовать следующие варианты сравнительного анализа: сравнение уровня представленности РНК IL8 и IL18 с уровнем представленности РНК референсных генов (например, HPRT) в плазме пациентов; сравнение уровней представленности РНК IL8, IL18 и РНК цитокина, для которого никаких изменений в случае развития заболевания показано не было (например, IL1b).

8. Оценка уровня представленности мРНК генов цитокинов в плазме больных ревматоидным артритом

На рисунках 7 и 8 приведены результаты сравнительного анализа представленности транскриптов цитокинов в суммарной клеточной фракции и плазме крови больных РА и здоровых людей.

Рисунок 7. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в клетках крови больных РА и здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Рисунок 8. Сравнение профилей представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РА и здорового контроля (о. е. – относительные единицы).

Для 11 из 15 анализируемых генов (IL2, IL4, IL5, IL7, IL10, IL12α, IL12β, IL17, IL18, IFNg, TGFb) различий в уровне экспрессии клетками суммарной клеточной фракции крови между исследуемой и контрольной группами выявлено не было. Уровень представленности транскриптов 4 генов (IL1 β, IL6, IL8, TNFα) в клетках крови больных РА оказался выше, чем в клетках крови здорового контроля, что согласуется с литературными данными об уровне экспрессии цитокинов клетками периферической крови при развитии РА [Firestein GS., 2003].

Между уровнями представленности транскриптов 6 из 10 детектируемых в плазме генов (IL12α, IL12β, IL17, IL18, IFNg, TGFb) у больных и здоровых различий выявлено не было. 4 гена (IL1 β, IL6, IL8, TNFα) продемонстрировали более высокий уровень представленности РНК в плазме больных РА по сравнению со здоровым контролем. Результаты оценки статистической значимости полученных различий приведены в таблице 3. Отличия считались достоверными при p ≤ 0,05.

Таблица 4. Анализ статистической значимости отличий, полученных при сравнении уровня представленности РНК цитокинов в клеточной фракции крови и плазме крови больных РА и здорового контроля.

Различия между группами

IL1b

IL6

IL8

TNFa

Уровень экспресии гена в клеточной фракции крови (РА/здоровые)

0,0482*

(достоверно)

0,2829

(не достоверно)

0,0178

(достоверно)

0,0045

(достоверно)

Уровень представленности транскрипта в плазме крови (РА/здоровые)

0,0293

(достоверно)

0,0349

(достоверно)

0,0193

(достоверно)

0,0576

(не достоверно)

*- значения p при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни

Для двух из исследованных показателей (уровень IL6 в клетках крови и уровень TNFα в плазме крови) отличия оказались недостоверными. Тем не менее, в целом профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови больных РА повторяет цитокиновый профиль клеточной фракции. Возможно, это объясняется тем, что характер и особенности патогенеза заболевания, выбранного нами для отработки метода, препятствуют свободному попаданию внеклеточных РНК из очага воспаления в циркуляцию. Одним из вероятных факторов ограничения попадания в кровоток генетического материала клеток-участников патологического процесса при РА являются гематоартикулярные барьеры суставов. Кроме того, на элиминацию внеклеточных РНК в значительной степени влияет активность фагоцитов. В случае развития РА в замкнутой полости суставной сумки развивается воспалительная реакция, сопровождающаяся, во-первых, увеличением количества способных к фагоцитозу клеток, а, во-вторых, возрастанием их активности. По-видимому, описанные процессы лимитируют использование предложенного подхода в случае развития РА.

Тем не менее, результаты, полученные с применением разработанного метода, свидетельствуют о том, что использование данного подхода позволяет выявлять изменения циитокинового профиля, характерные для развития РА. Совпадение профиля представленности РНК цитокинов в плазме крови с профилем клеточной фракции делает количественную оценку внеклеточных РНК при данной патологии альтернативой определению уровня экспрессии цитокинов клетками периферической крови. Кроме того, представляется целесообразным исследовать возможность применения разработанного метода при других аутоиммунных заболеваниях, в частности при сахарном диабете I и II типов. При этом, оценивая перспективы использования данного подхода, необходимо принимать во внимание особенности анатомической организации и патогенеза заболеваний, выбранных для отработки модели.

4. ВЫВОДЫ

1.  Разработана методика количественного анализа внеклеточных РНК генов, участвующих в реализации иммунного ответа, в плазме крови. Подход удобен, прост в применении и может быть рекомендован для использования в области анализа циркулирующих нуклеиновых кислот.

2.  Определенный профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови при нормальном физиологическом состоянии организма существует и отличается от цитокинового профиля клеточной фракции.

3.  При развитии РМЖ в плазме крови больных возрастают уровни представленности IL12, IL6, IL8 и IL18. В клеточной фракции больных РМЖ возрастает относительное количество только IL12 и IL6. Уровень РНК IL8 повышен в плазме крови больных с метастазирующим заболеванием по сравнению с больными с минимальными проявлениями заболевания.

4.  При развитии РА уровни представленности РНК основных провоспалительных цитокинов возрастают как в плазме крови, так и в клетках крови больных.

5.  Количественная оценка внеклеточных РНК цитокинов при развитии рака молочной железы может быть использована в качестве дополнительного инструмента при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания.

6.  Количественная оценка внеклеточных РНК цитокинов при развитии ревматоидного артрита может быть использована в качестве альтернативы определению уровня экспрессии цитокинов клетками периферической крови.

7.  Полученные данные говорят в поддержку гипотезы о связи профиля представленности внеклеточных РНК плазмы крови с ходом патологического процесса и служат предпосылкой для изучения возможности применения разработанной методики для анализа особенностей течения и разработки методов диагностики других иммунозависимых заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Турчанинова М. А., Ребриков Д. В. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. – №2. – С. 22-24.

2. Турчанинова М. А., Ребриков Д. В, Алексеев Л. П. // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2010. №10. Том 13. С. 3-8.

3. Турчанинова М. А. // Российский аллергологический журнал. 2007. №3. С. 12.

4. Turchaninova M., Rebrikov D. // V International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. 2007. Books of abstracts. P. 28.

5. Turchaninova M., Rebrikov D. // 6th Cytokines and Inflammation Conference. 2008. Books of abstracts. P. 324.

6. Turchaninova M., Rebrikov D. // XX International Congress of Genetics. 2008. Books of Abstracts. P. 430.

7. Турчанинова М. А. // Материалы 12й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». 2008. С. 154.

8. Турчанинова М. А., Ребриков Д. В. // Материалы II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». 2009. С. 31.



Архивы pandia.ru
Алфавит: АБВГДЕЗИКЛМНОПРСТУФЦЧШЭ Я

Новости и разделы


Авто
История · Термины
Бытовая техника
Климатическая · Кухонная
Бизнес и финансы
Инвестиции · Недвижимость
Все для дома и дачи
Дача, сад, огород · Интерьер · Кулинария
Дети
Беременность · Прочие материалы
Животные и растения
Компьютеры
Интернет · IP-телефония · Webmasters
Красота и здоровье
Народные рецепты
Новости и события
Общество · Политика · Финансы
Образование и науки
Право · Математика · Экономика
Техника и технологии
Авиация · Военное дело · Металлургия
Производство и промышленность
Cвязь · Машиностроение · Транспорт
Страны мира
Азия · Америка · Африка · Европа
Религия и духовные практики
Секты · Сонники
Словари и справочники
Бизнес · БСЕ · Этимологические · Языковые
Строительство и ремонт
Материалы · Ремонт · Сантехника