Изучение полиморфизма RAGE-гена как фактора предрасположенности к развитию псориаза

Медицина | Эта статья также находится в списках: , , | Постоянная ссылка

2-й этап – отжиг (омелинг) праймеров который осуществлялся при температуре 64° С (длительность шага 10 секунд); При проведении ПЦР были использованы специально подобранные праймеры (1RAGE2184 (GGCCTCAGGACCAGGGAACCTACA), 8551-8574 п. о., и 2RAGE2184 (TTGGTCAGGCTGGTCTCGAACTCC), 8929-8952 п. о.), которые позволяли фланкировать участок ДНК, содержащий RAGE-ген и провести его амплификацию для последующего изучения методом рестрикции.

3-й этап – элонгация происходила при повышении температуры до 72° С (длительность шага 10 секунд).

Определение полиморфизма RAGE-гена на основе последовательности гена представленной в GenBank – D28769 проводилось с помощью метода рестрикционного анализа нуклеотидных последовательностей согласно методике, описанной V. Vasku со соавторами (2002).

Сайт RAGE 2184A/G: рестрикцию продуктов амплификации мы проводили в присутствии эндонуклеазы BsmF1 из Bacillus stearothermophilus F (New England Biolabs) с целью получения фрагментов длиной 266 и 136 п. о. для

аллели А и 174, 136 и 92 п. о. для аллели G.

Продукты амплификации инкубировали при температуре 65°С в течение 4 часов, после чего осуществляли инактивация фермента в течение 20 минут при температуре 80° С.

Сайт RAGE 1704G/Т: рестрикцию проводили в присутствии эндонуклеазы ВfaI из Bacteroides fragilis (New England Biolabs). Продуктами рестрикции для аллеля G явились участки ДНК длиной 240, 143 и 42 п. о.; для аллеля Т: 240 и 185 п. о.

Продукты амплификации инкубировали в течении 5 часов при 37° С. Инактивацию фермента осуществляли в течение 20 минут при температуре 80° С.

Сайт G82S: рестрикцию продуктов амплификации проводили в присутствии эндонуклеазы Аlu I из Arthrobacter luteus (New England Biolabs). При диком (немутантном) типе (GG) данного аллеля продуктами рестрикции были фрагменты ДНК длиной 123, 26, 248 п. о.; при мутантном типе (АG): 123, 26, 67 и 181 п. о.

Продукты амплификации инкубировали при температуре 37°С в течение 4 часов, после чего осуществляли инактивацию фермента в течение 20 минут при температуре 65° С.

Анализ полиморфизма длины полученных рестрикционных фрагментов осуществляли с помощью горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных масс («CибЭнзим», Новосибирск) от 100 до 1000 п. о. (таблица 2)

Таблица 2

Условия проведения рестрикции и продукты рестрикции RAGE-гена

Сайт RAGE-гена

Эндонуклеаза

Продукты рестрикции (длины фрагментов)

Изучаемые аллели

2184А/G

BsmF1 из Bacillus stearothermophilus F (New England Biolabs)

266 п. о.

136 п. о.

А

174 п. о.

136 п. о.

92 п. о.

G

1704 G/T

ВfaI из Bacteroides fragilis (New England Biolabs)

240

143

42

G

240 п. о.

185 п. о.

Т

G82S

Аlu I из Arthrobacter luteus (New England Biolabs)

123 п. о.

26 п. о.

248 п. о

GG

123 п. о.

26 п. о.

67 п. о.

181 п. о.

АG

Документирование гелей проводили с помощью оптической системы “BIORAD” (USA) и с использованием программы “Гель-Док” (рис.2,3,4,5).

Медицина | Эта статья также находится в списках: , , | Постоянная ссылка
Мы в соцсетях:




Архивы pandia.ru
Алфавит: АБВГДЕЗИКЛМНОПРСТУФЦЧШЭ Я

Новости и разделы


Авто
История · Термины
Бытовая техника
Климатическая · Кухонная
Бизнес и финансы
Инвестиции · Недвижимость
Все для дома и дачи
Дача, сад, огород · Интерьер · Кулинария
Дети
Беременность · Прочие материалы
Животные и растения
Компьютеры
Интернет · IP-телефония · Webmasters
Красота и здоровье
Народные рецепты
Новости и события
Общество · Политика · Финансы
Образование и науки
Право · Математика · Экономика
Техника и технологии
Авиация · Военное дело · Металлургия
Производство и промышленность
Cвязь · Машиностроение · Транспорт
Страны мира
Азия · Америка · Африка · Европа
Религия и духовные практики
Секты · Сонники
Словари и справочники
Бизнес · БСЕ · Этимологические · Языковые
Строительство и ремонт
Материалы · Ремонт · Сантехника