Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто
- 30% recurring commission
- Выплаты в USDT
- Вывод каждую неделю
- Комиссия до 5 лет за каждого referral
На правах рукописи
ЗАХАРЮК Анастасия Геннадьевна
РАСПРОСТРАНЕНИЕ И АКТИВНОСТЬ АЛКАЛОФИЛЬНЫХ СУЛЬФАТ - И ЖЕЛЕЗОРЕДУЦИРУЮЩИХ
БАКТЕРИЙ В СОДОВЫХ ОЗЕРАХ ЗАБАЙКАЛЬЯ
03.00.16 - экология
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Улан-Удэ – 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук
Институте общей и экспериментальной биологии
Сибирского отделения РАН
Научный руководитель: | кандидат биологических наук |
Официальные оппоненты: | доктор биологических наук |
кандидат биологических наук Сыренжапова Арюна Сыдынжаповна | |
Ведущая организация: | Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН |
Защита диссертации состоится «25» марта 2010 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, биолого-географический факультет, конференц-зал.
Факс: (3012)210588
E-mail: *****@***ru
*****@***ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН и Бурятского государственного университета
Автореферат разослан «20» февраля 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. На территории Забайкалья насчитывается более 500 содовых озер, отличающихся по степени минерализации, рН и ионному составу воды (Дзюба и др., 1997; Намсараев и др., 2007) и представляющих тип экосистем, широко распространенных в аридных условиях. В озерах, характеризующихся щелочными значениями рН и повышенной минерализацией, функционирует алкалофильное микробное сообщество, включающее продуцентов и деструкторов органического вещества (Заварзин, 2007).
Одним из ключевых метаболитов, образуемых на первых этапах деструкции органического вещества является ацетат. В пресноводных экосистемах и кислых средах ацетат на конечных этапах деструкции используется сульфатредукторами. В содовых озерах использование ацетата вторичными анаэробами до сих пор до конца не изучено, хотя известно, что сульфатредукция является доминирующим процессом анаэробной деструкции (Горленко и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007).
В настоящее время выделено и описано несколько представителей алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), способных окислять Н2, формиат, лактат и некоторые и другие соединения с образованием Н2S (Pikuta, 1998; Pikuta, 2003; Zhilina, 2005). Способностью окислять ацетат среди сульфатредукторов, выделенных из содовых озер, обладает только Desulfonatronum cooperativum в бинарной культуре с Contubernalis alcalaceticum (Жилина и др., 2005). Выделение и описание СРБ, окисляющих ацетат до Н2S и СО2 в содовых водоемах представляет значительный интерес для понимания механизма стока водорода в алкалофильном микробном сообществе.
Изучению процессов восстановления железа (III) в пресноводных водоемах, термальных источниках и морских экосистемах уделено достаточно много внимания. Из этих экосистем выделено и описано более 30 культур (Слободкин и др., 1995; Slobodkin et. al., 1999; Coates et al., 1996; Finneran et al., 2002 и др.). В содовых водоемах в связи с низкой растворимостью окислов железа в щелочных условиях возможность процесса микробной железоредукции до последнего времени ставилась под сомнение. Лишь недавно были выделены и описаны единичные представители алкалофильных железоредуцирующих бактерий (ЖРБ) (Ye Q. et al., 2004; Заварзина и др., 2006; Жилина и др., 2009). К началу данных исследований железоредукторов из содовых озер выделено не было.
Исследование распространения и функционирования бактерий, восстанавливающих сульфаты и железо в щелочных условиях, имеет большое значение для понимания их роли в природе.
Целью настоящей работы являлось изучение распространения и активности гало-алкалофильных сульфат - и железоредуцирующих бактерий в содово-соленых озерах Забайкалья, выделение и характеристика культур.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать содово-соленые озера Забайкалья – места обитания алкалофильных микроорганизмов.
2. Определить численность алкалофильных сульфат - и железовосстанавливающих бактерий в донных осадках содовых озер.
3. Определить скорость сульфатредукции в донных осадках озер.
4. Выделить активные накопительные и чистые культуры сульфат - и железоредукторов.
5. Изучить экофизиологические и метаболитические характеристики выделенных чистых культур, определить филогенетическое положение бактерий.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведена оценка численности железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья.
Из содового озера Хилганта выделена и описана культура диссимиляторных железоредуцирующих бактерий – облигатно алкалофильная (рНопт. 10,3) спорообразующая палочка, восстанавливающая цитрат железа (III) (штамм Х-07-2). Филогенетически штамм близкородственен недавно описанному железоредуктору Alkaliphilus peptidofermentans (98% сходства) (Жилина и др., 2009), однако имеются существенные отличия от типового штамма.
Из содового озера Алгинское выделен новый вид алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (штамм Al915-01), способный к окислению ацетата. По совокупности физиологических и филогенетических свойств штамм предлагается выделить в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans».
Практическая ценность. Полученные результаты расширяют представление о разнообразии СРБ в природе, могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях. Выделенные штаммы сульфат - и железоредуцирующих бактерий представляют интерес для биотехнологии как продуценты солеустойчивых и устойчивых к высоким рН ферментов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), 2-м Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), III Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), IV Международной Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008), научной конференции преподавателей, научных работников и аспирантов ВСГТУ (Улан-Удэ, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, включая 4 статьи и 9 тезисов.
Объем и структура работы: Диссертационная работа изложена на ______страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация содержит ____таблиц, ____рисунков. Список литературы состоит из ____отечественных и ____зарубежных источников.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к. б.н. за общее научное руководство, заведующему лабораторией микробиологии д. б.н., проф. за постоянное внимание и помощь в работе и обсуждении результатов. Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантом лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, родным и близким за поддержку и ценные советы.
Автор выражает благодарность заведующему лабораторией Экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН д. б.н. , к. б.н. и всем сотрудникам данной лаборатории за советы и помощь в освоении методик, сотрудникам ИНМИ РАН , д. б.н. за помощь на отдельных этапах работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума СО РАН № 38 и 95, УрО РАН и СО РАН «Микробные сообщества экстремальных экосистем», МО РФ РНП.2.1.1./2165, НОЦ «Байкал».
экспериментальная часть
Объекты исследования. Объектами исследования являлись 8 содовых и содово-соленых озер, расположенных на территории Бурятия" href="/text/category/buryatiya/" rel="bookmark">Бурятии (Белое, Алгинское, Соленое, Нухэ-Нур) и Забайкальского края (Хилганта, Горбунка, Доронинское, Зун-Торей). Микробиологические и гидрохимические исследования проводились с 2005 по 2008 гг.
Методы исследования.
Физико-химические характеристики воды и донных осадков в изучаемых озерах определяли стандартными методами (Намсараев и др., 2006).
Органический углерод в осадках анализировали методом мокрого сжигания по Тюрину, со спектрофотометрическим окончанием (Аринушкина, 1961).
Среды и условия культивирования. Для определения численности бактерий использовали жидкую и агаризованную минеральную среду 1, состава (г/л): КН2РО4 – 0,2; MgCl2 х 6Н2О – 0,1; NH4Cl – 0,5; КCl – 0,2; NaCl – 15; дрожжевой экстракт – 0,05; раствор микроэлементов по Пфеннигу – 1мл/л. Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий к вышеописанной среде добавляли (г/л): Na2SO4 х10Н2О – 3; Na2S х 9Н2О – 0,05; натриевые соли молочной или уксусной кислот – 4; металлическую скрепку или раствор FeSO4 добавляли как индикатор процесса. Железоредуцирующие бактерии выращивали на минеральной среде 1, используя в качестве доноров электронов (г/л): лактат – 4; ацетат – 4; пептон – 4; глюкозу – 4. Акцепторам электронов служила (мМ): АГОЖ [аморфная гидроокись железа (III)] – 90.
Значения рН, соответствующие гидрохимии озер, устанавливали соотношениями NaHCO3 и Na2CO3. 10% растворы гидрокарбоната и карбоната натрия стерилизовали отдельно. Культивирование бактерий осуществляли в термостате при 30оС. В качестве химического контроля использована среда без инокуляции. Статистическую обработку при определении численности бактерий проводили по таблице Мак-Креди (Большой практикум по микробиологии, 2005).
Выделение чистых культур алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий проводили с использованием анаэробной техники Хангейта [Hungate, 1966] на среде 2 следующего состава (Sorokin, 2008) (г/л): Na2CO3 – 1,2; NaHCO3 – 1,85; NaCl – 15; K2HPO4 – 0,5; д/э – 0,05; раствор м/э по Пфеннигу – 1 мл/л. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): MgCl2 – 1; Na2S х 9Н2О – 1; Na2SO4 – 20. В качестве источника углерода и донора электронов использовали лактат натрия, с конечной концентрацией в среде 4 г/л. рН при посеве 9,6.
Чистые культуры алкалофильных железоредуцирующих бактерий выделяли также на среде 2. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): MgCl2 – 1; цитрат Fe (III) – 30. В качестве источника углерода и донора электронов использовали ацетат натрия с конечной концентрацией в среде 4 г/л. рН при посеве 9,3.
Температурную зависимость роста изучали в области от 5 до 47оС. При исследовании рН-зависимости в диапазоне рН 8,0 – 8,5 использовали раствор по Кларку-Лабсу, для рН 7,0 - фосфатный буфер, а для приготовления высокощелочных сред (рН 9,0 - 11,0) применяли карбонатные буферные растворы (Справочник по биохимии, 1996).
Определения зависимости роста от NaCl проводили на среде 3, следующего состава (г/л): K2CO3 – 1,2; KHCO3 – 1,85; K2HPO4 – 0,5; д/э – 0,05; раствор м/э по Пфеннигу – 1 мл/л. Из концентрированных растворов в стерильную среду добавляли (мМ): для СРБ MgSO4 – 1; (NH4)2SO4 – 20; для ЖРБ MgSO4 – 1; цитрат Fe (III) – 30. рН устанавливали 10% КОН. NaCl в концентрации от 0,5% до 20% добавляли отдельно в каждый флакон. Для оценки влияния ионов Na+ на рост бактерий NaCl заменяли на KCl (1,5%). Зависимость от ионов Cl - у выделенных организмов исследовали на среде 2, исключив NaCl. Зависимость от карбонат-гидрокарбонатов определяли, заменяя эти соли эквимолярным количеством NaCl в среде, где рН поддерживался 10% NaOH.
При определении возможных доноров электронов их вносили в конечной концентрации 0,12%. Способность к литогетеротрофному росту наблюдали с молекулярным водородом (100% газовой фазы).
Микроскопические методы исследования. Морфологию клеток бактерий изучали с использованием микроскопа Olympus BX41 с фазово-контрастным устройством и цифровой фотокамерой при увеличении 1300х и на тотальных препаратах и ультратонких срезах в электронном микроскопе Jeol JEM–100C (Япония) по стандартным методикам.
Определение роста. Рост бактерий фиксировали по изменению оптической плотности среды при длине волны 560 нм на фотоколориметре КФК – 3 (Россия), прямым подсчетом клеток и по образованию конечного продукта реакции – сульфида (для СРБ) (Trüper, Schleget, 1964) и Fe(II) (для ЖРБ) (Шапиро, Шапиро, 1971).
Скорость сульфатредукции определяли радиоизотопным методом с помощью меченного 35S-сульфата (Иванов и др., 1975).
Измерение содержания стабильных изотопов углерода 12С и 13С в виде газообразной формы СО2 проводили на масс-спектрометре МИ-1201 (СССР). Результаты приведены в виде величин δ 13С в промилле по отношению к общепринятым стандартам PDB. Анализ проведен к. б.н. (ИОЭБ СО РАН).
Метод анализа жирных кислот. Жирные кислоты анализировали хромато-масс-спектрометрическим методом (ГХ-МС). Исследования выполнены в детской клинической больнице им. Филатова, г. Москва.
Молекулярно-генетические методы. Выделение и очистку ДНК, амплификацию и секвенирование гена 16S рРНК выполняли в Институте биоинженерии РАН (г. Москва). Для сравнительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей с известными в GENBANK использовали пакет программ BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov). Полученные последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших гомологов с помощью программы CLUSTALX. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с помощью программы TREECONW по методу объединения ближайших соседей (Van de Peer, 1994).
Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили стандартными методами по (1969); , (1962).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Физико-химическая характеристика исследованных содовых озер Забайкалья.
По минерализации в период исследований (июнь 2005 – сентябрь 2008 гг.) воды озер, в соответствии с классификацией Валяшко, различались от солоноватых (сумма солей 1,0-25,0 г/дм3) до соленых (26-45 г/дм3). По химическому составу большинство озер относится к карбонатному типу. Значения рН воды в озерах находились в щелочной области и варьировали от 8,7 до 9,98 (табл. 1).
Таблица 1.
Физико-химическая характеристика исследуемых содовых озер, мг/ дм3
Озеро | Дата отбора проб | Место- положение | рН | ОМ, г/ дм3 | Cl- | SO42- | HCO3- | CO32- | Feобщее |
Соленое | октябрь 2005 г. | 1 | 9,9 | 5,6 | 199,72 | 376,5 | 2171,6 | 720 | 0,0032 |
Нухэ-Нур | 2005 г. | 2 | 9,84 | 5,7 | 137,7 | 575,9 | 4758 | 3900 | 0,0023 |
Алгинское | июнь 2005 г. | 3 | 9,62 | 45,0 | 34,43 | 25694 | 3050 | 3000 | 0,0006 |
Белое | июль 2005 г. | 4 | 8,7 | 1,8-2,6 | 335,5 | 477,7 | 106,7 | 54,0 | - |
Хилганта | 5 | 9,15 | 71,0 | 19700 | 14461 | 1037 | 0 | - | |
Горбунка | сентябрь 2005 г. | 6 | 8,7 | 41,3 | 3560 | 6424 | 920 | 420 | - |
Доронинское | сентябрь 2008 г. | 7 | 9,98 | 30 | 4830 | 117 | 480,8 | 138,0 | - |
Зун-Торей | сентябрь 2008 г. | 8 | 9,68 | 5,7 | - | 600 | 1952 | 600 | - |
Примечание:
1 – Кяхтинский район, Республика Бурятия, 2 – Баргузинский район, Республика Бурятия, 3 – -//-, 4 – Иволгинский район, Республика Бурятия, 5 – Агинский район, Забайкальский край, 6 – -//-, 7 – Улетовский район, Забайкальский край, 8 – Ононский район, Забайкальский край; в момент отбора проб озеро Хилганта пересохло, приведены результаты, полученные из водных вытяжек; «ОМ» – здесь и далее общая минерализация; «-» – не определено.
Концентрация HCO3- и CO32- в озерах изменялась в широких пределах от 0,1 до 4,8 г/дм3 и от 0,05 до 3,90 г/дм3, соответственно. Во всех исследованных озерах наблюдается преобладание содержания гидрокарбонатов над карбонатами. Максимальное содержание ионов Cl - (16,7 г/дм3) отмечено в озере Хилганта, минимальная концентрация Cl--иона (0,034 г/дм3) зафиксирована в озере Алгинское. Концентрация сульфат-ионов в разных озерах существенно варьирует (от 0,12 до 25,7 г/дм3). Наибольшее количество SO42- выявлено в озерах Алгинское – 25,7 г/дм3 и Хилганта – 14,5 г/дм3. В озере Доронинское содержание сульфат-ионов было минимальным и составило 0,12 г/дм3. Содержание общего железа в воде содовых озер было низким и колебалось в пределах от 0,0006 до 0,0032 мг/дм3.
Количество органического вещества в воде и донных осадках озер играет важную роль в функционировании микробного сообщества. Нами было определено содержание органического вещества (ОВ) в колонках донных отложений озера Соленое и в пробах песчаных матов озер Доронинское и Зун-Торей. В озере Соленое максимальное количество Сорг (19,25%) выявлено в подповерхностных слоях донных отложений на глубине 5 см. С увеличением глубины от 6 до 13 см количество органического вещества заметно снижалось и варьировало от 18 до 4,9%. Второй пик максимума зафиксирован на глубине 16 см (Сорг 18%), далее содержание ОВ снижается.
В песчаных матах озер Доронинское и Зун-Торей содержание органического вещества было незначительным и составило 1,6-1,7%. Изменение Сорг по слоям не зафиксировано. Низкое содержание ОВ в песчаных матах резко отличает их от цианобактериальных матов, развивающихся в содовых озерах и характеризующихся высоким содержанием органического вещества (до 19%). Исследуемые нами маты были представлены песчаными грунтами, которые, как правило, бедны органикой.
2. Распространение сульфат - и железоредуцирующих бактерий в донных осадках и песчаных матах содовых озер.
С целью изучения распространения алкалофильных сульфат - и железоредукторов в содовых озерах Забайкалья нами была определена численность этих физиологических групп в период с 2005 по 2008 гг.
В пробах донных осадков всех исследуемых водоемов численность сульфатредукторов была высокой и варьировала от 10 до 100 млн. кл/мл. Наиболее активный рост сульфатредуцирующих бактерий был отмечен на среде с лактатом. Наивысшая численность СРБ на лактате (>100 млн. кл/мл) была зафиксирована в пробах озера Соленое. На ацетате численность СРБ варьировала от 10 кл/мл (в оз. Белое), до 1 млн кл/мл (в пробе осадков оз. Соленое).
Численность железоредуцирующих бактерий в донных осадках исследуемых озер также была определена методом посева на элективные среды. Максимальная численность ЖРБ (10 млн. кл/мл) зарегистрирована в озере Хилганта. Наименьшее значение численности (1 тыс. кл/мл) выявлено в донных осадках озер Белое и Алгинское. Наблюдается определенная корреляция численности сульфат - и железоредуцирующих бактерий (табл.2).
Таблица 2.
Численность сульфат- и железоредукторов в донных осадках исследуемых озер
Озеро | Численность, кл/мл | |||||||
2005 г. | 2006 г. | 2008 г. | ||||||
СРБ | ЖРБ | СРБ | ЖРБ | СРБ | ||||
лактат | ацетат | смесь доноров | лактат | ацетат | смесь доноров | лактат | ацетат | |
Белое | 104 | 10 | 105 | 105 | 103 | 103 | 105 | 105 |
Соленое | >108 | 106 | 106 | 105 | 103 | 105 | 105 | 105 |
Хилганта | 107 | - | 107 | 105 | 104 | 107 | 105 | 105 |
Горбунка | 106 | - | 106 | 105 | 105 | 106 | - | - |
Алгинское | 106 | - | 103 | - | - | 103 | - | - |
Нухэ-Нур | - | - | 105 | - | - | 105 | - | - |
Доронинское | - | - | - | - | - | - | 107 | 105 |
Зун-Торей | - | - | - | - | - | - | 104 | 103 |
Примечание:
«-» - не определено, смесь доноров – пептон+сахароза
Таким образом, нами показано, что в щелочных условиях содовых озер широко распространены бактерии, активно участвующие в процессе анаэробной деструкции органического вещества. Вследствие высоких концентраций сульфатов в воде исследуемых содовых озер, численность сульфатредукторов превышает число железоредуцирующих бактерий.
3. Интенсивность процесса сульфатредукции в донных осадках и микробных матах озера Соленое.
В содовых озерах сульфатредукция является наиболее активным процессом на заключительных этапах деструкции органического вещества. В донных осадках и микробных матах озера Соленое была определена скорость сульфатредукции и произведен расчет органического вещества, затрачиваемого на этот процесс. Наиболее интенсивно процесс восстановления сульфатов протекал в пробах цианобактериального мата – 1,80 мг S/(кг сут) (табл. 3).
Таблица 3.
Интенсивность процесса сульфатредукции в озере Соленое.
Озеро | Тип пробы | Дата | Скорость, мг S/(кг сут) | Расход Сорг, мг С/(кг сут) макс. знач. |
Соленое | песок ил цианобакт. мат пурпурный мат | сентябрь | 0,01-0,35 0,35-0,64 0,70-1,80 0,25-1,28 | 0,26 0,48 1,35 0,96 |
Полученные данные сравнимы с имеющимися в литературе. Сравнительный анализ с полученными ранее данными по интенсивности метаногенеза (Солоноватые и соленые озера Забайкалья, 2009) указывает на преобладание сульфатредукции на терминальных этапах деструкции ОВ.
4. Изотопный состав углерода донных осадков озера Соленое.
При исследовании вертикальной стратификации донных осадков оз. Соленое изотопный состав углерода органического вещества и карбонатов составлял от -26.14‰ до -29.60‰ и от -11.21‰ до -14.3‰, соответственно. В слое 6-7 см происходит облегчение органического вещества и карбонатов, по-видимому, здесь находится зона анаэробной деструкции органического вещества. В результате образования газов изотопно-легкой фракции в анаэробных условиях и их потребления микроорганизмами органическое вещество оказывается обедненным изотопом 13С. В толще донных осадков к нижним горизонтам изотопный состав углерода утяжеляется, что свидетельствует о разложении, в первую очередь, более легкой фракции органического вещества (рис. 1). Вниз по слоям донных осадков до 5 см происходит накопление органического вещества и карбонатов. На глубине от 5 до 7 см наблюдается резкое снижение и от 7 до 13 см происходит обратное увеличение содержания органического вещества и карбонатов (рис. 2).
|
|
5. Выделение и характеристика культур алкалофильных сульфат - и железоредукторов.
Из содовых озер Забайкалья выделены и охарактеризованы 4 чистые культуры микроорганизмов: три штамма алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (B918-01, Al915-01 и D21) и один штамм алкалофильных железоредуцирующих бактерий (Х-07-2). Также из накопительной культуры, выделенной из донных осадкой озера Хилганта и поддерживаемой периодическими пересевами в течение 4 лет, была получена еще одна чистая культура сульфатредуцирующих бактерий – штамм Хил-05-ос. Для этого штамма изучена только нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и определены ближайшие гомологи.
5.1. Описание штаммов алкалофильных СРБ
Из проб донных осадков озер Белое, Алгинское (Бурятия) и озера Доронинское (Забайкальский край) были выделены штаммы алкалофильных СРБ – B918-01, Al915-01 и D21, соответственно.
Морфология. Выделенные штаммы представлены подвижными вибрионами, одиночными или соединенными в цепочки по 2-4 клетки. Размер клеток штамма Al915-01 0,4-0,5 х 1,2-2,25 µм, размеры клеток штамма B918-01 0,45-0,5 х 1,15-2,8 µм, штамма D21 – 0,35-0,41 х 1,2 х 2,18 µм. Образование спор не обнаружено.
Клетки бактерий имеют характерную для грамотрицательных организмов волнистую мембрану с выраженным периплазматическим пространством (рис. 3).
|
|
|
а) б) в)
Рис. 3. Световые и электронные микрофотографии штаммов СРБ; а) и б) штамм Al915-01, в) штамм В918-01
Физиологические свойства. Все организмы - облигатные алкалофилы с областью развития рН 8,0 - 10,5. Оптимум рН для штаммов Al915-01 и B918-01 – 9,3; для штамма D21 рНопт 9,87 (рис. 4).
Рис. 4. Зависимость роста штаммов СРБ от рН
Оптимальная концентрация NaCl для развития штаммов Al915-01 и B918-01 составила 4%, нижний предел концентрации NaCl - 0,5%, верхний для штамма Al915-01 – 10%, для штамма B918-01 – 15%. Штамм D21 растет при содержании NaCl от 0,5 до 10% с оптимумом NaCl 1%. Таким образом, выделенные СРБ являются умеренными галофилами (рис. 5). Установлено, что все штаммы облигатно нуждаются в ионе Na+. Cl-- ионы не являются обязательным компонентом среды для данных культур.
Организмы облигатно нуждаются в карбонат-ионе: замена карбонатов эквимолярным количеством NaCl в среде, где рН поддерживался 10% NaOH, не давала роста.
|
По отношению к температуре микроорганизмы являются мезофилами. Температурные интервалы развития штаммов B918-01 и Al915-01 лежат в пределах 10 – 40оС с оптимумом роста 36оС. Для штамма D21 оптимум температуры лежит в пределах 23-30оС, роста ниже 10оС и выше 47оС не наблюдали (Рис.6).
Рис. 6. Зависимость роста штаммов СРБ от температуры
Из всех проверенных субстратов рост зафиксирован на лактате, ацетате, пирувате, формиате, оксалате, фруктозе, метаноле. На водороде (100% газовой фазы) рост слабый. Штамм D21, в отличие от штаммов B918-01 и Al915-01, окислял этанол. Дрожжевой экстракт не оказывал стимулирующего действия на рост бактерий.
Установлено, что в качестве акцепторов электронов организмы используют тиосульфат и сульфит. Отмечен слабый рост на Fe(OH)3. Штаммы Al915-01 и D21 способны расти на нитрате. Роста без акцептора электронов не обнаружено.
Состав жирных кислот. Был определен состав жирных кислот клеточной стенки для штаммов B918-01 и Al915-01. В значительном количестве в клеточной стенке штаммов обнаружена изо-гептадеценовая кислота (i17:1) 16,83% у штамма Al915-01 и 19,88% - у штамма В918-01. Также доминировала октадеценовая кислота (18:1ω7) и в большом количестве выявлена антеозо-пентадекановая кислота (а15:0) – 15,29% у штамма Al915-01 и 15,46% - у штамма В918-01. У штамма Al915-01, в отличие от штамма В918-01 в большом количестве присутствует гексадеценовая кислота (16:1 ω 7) – 12,05% от общего количества кислот.
Генотипическая характеристика. Для культур B918-01 и, Al915-01 Хил-05-ос была получена генотипическая характеристика.
Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма Al915-01 составило 58,3 мол.%. Содержание Г+Ц пар в молекуле ДНК штамма В918-01составило 58,2 мол.%.
По филогенетическому скринингу, проведенному в базе данных GenBank с помощью программы BLAST, все три исследуемых штамма относятся к семейству Desulfonatronumaceae δ-подкласса Proteobacteria. На построенном филогенетическом дереве (рис. 7) штаммы относятся к кластеру, объединяющему представителей семейства Desulfonatronumaceae. Наиболее близкий к штаммам оказался вид Desulfonatronum lacustre (99% сходства).
По результатам молекулярной ДНК-ДНК гибридизации уровень сходства ДНК между штаммами В918-01 и Al915-01составляет 52%. Уровень сходства ДНК штамма В918-01 с ДНК вида Desulfonatronum lacustre составляет 71%. Штамм Al915-01 характеризуется относительно низким уровнем гомологии (40%) по отношению к типовому штамму Desulfonatronum lacustre.
|
Сравнительный анализ выделенных штаммов с близкородственными видами (табл. 4) показал различия фено - и генотипических характеристик.
Выделенные штаммы способны расти и при температуре 10 оС, в то время как у D. lacustre рост начинался при 20 оС. Также отличен и нижний предел и оптимум роста в диапазоне солености – типовой штамм D. lacustre способен расти и при очень низкой солености, у выделенных же штаммов рост начинался только при солености среды 5%, а оптимум составляет 10-40 г/л. Типовой штамм не способен использовать лактат, ацетат и восстанавливать нитрат. И как уже отмечалось выше довольной низкий уровень сходства по ДНК-ДНК гибридизации.
Таким образом, основываясь на существенном отличие физиологических и фенотипических свойств выделенного штамма Al915-01 от известных видов рода Desulfonatronum, предлагается выделить его в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans».
Таблица 4.
Сравнительный анализ исследуемых штаммов с видами рода Desulfonatronum
Характеристика | D. lacustre | D. thiodismutans | D. cooperativum | Штамм В918-01 | Штамм Al915-01 | Штамм D21 |
Форма клеток | вибрионы | вибрионы | вибрионы | вибрионы | вибрионы | вибрионы |
Размеры, µм | 0,7-0,9х 2,5-3,0 | 0,6-0,7х 1,2-2,7 | 0,4-0,5х 1,0-2,5 | 0,45-0,5х 1,25-2,8 | 0,4-0,5х 1,2-2,25 | 0,35-0,41х 1,2-2,18 |
Температура, 0С: | 22-45 | 15-48 | 15-40 | 10-40 | 10-40 | 10-47 |
Пределы роста | ||||||
Оптимум роста | 40 | 37 | 35-38 | 36 | 36 | 23-30 |
рН: | 8,0-10,1 | 8,0-10,0 | 6,7-10,3 | 8,0-10,5 | 8,0-10,5 | 8,0-10,5 |
Пределы роста | ||||||
Оптимум роста | 9,3-9,5 | 9,5 | 8,0-9,0 | 9,3 | 9,3 | 9,87 |
Рост с NaCl, г/л: | 0-100 | >10-70 | >10-80 | 5-150 | 5-150 | 5-40 |
Пределы роста | ||||||
Оптимум роста | 0 | 30 | 5-15 | 40 | 40 | 10 |
Г+Ц ( мол.%) | 57,3+1 | 63,1+1 | 56,5+1 | 58,2 | 58,3 | н. о. |
Н2 | + | + | + | + | + | н. о. |
формиат | + | + | + | + | + | + |
лактат | - | - | + | + | + | + |
ацетат | - | - | - | + | + | +/- |
этанол | + | + | - | - | - | +/- |
Тиосульфат | + | + | + | + | + | + |
Сульфит | + | + | + | + | + | + |
Fe(OH)3 | - | н. о | н. о | +/- | +/- | - |
S0 | - | - | +/- | +/- | н. о. | |
Нитрат | - | - | - | - | + | +/- |
Литературный источник | Pikuta et. al., 1998; Zhilina, 2005 | Pikuta et. al., 2003 | Zhilina et. al., 2005 | Наши данные | Наши данные | Наши данные |
5.2. Описание новых штаммов алкалофильных ЖРБ.
Из донных осадков озера Хилганта выделен алкалофильный штамм ЖРБ – Х-07-2. Полученный организм восстанавливает цитрат железа с ацетатом в качестве донора электронов и единственного источника углерода с образованием, предположительно, сидерита.
Морфология. Клетки штамма Х-07-2 представлены длинными тонкими подвижными палочками, нередко изогнутыми (рис. 8). На 15 сутки культивирования наблюдается образование спор. Размеры клеток 5,58-8,87 µм, размеры спор – 0,85 µм.
|
|
а) б)
Рис. 8. Световые (а) и электронные (б) микрофотографии штамма Х-07-2
Физиологические свойства. Штамм Х-07-2 является облигатным алкалофилом с областью развития в диапазоне значений рН 7,0 – 10,7 и оптимумом при рН 10,27 (рис. 9а).
Оптимальная концентрация NaCl для развития выделенного организма составила 4%, нижний предел концентрации NaCl - 0,5%, верхний – 15% (рис. 9б). Таким образом, штамм Х-07-2 являются умеренным галофилом.
Штамм Х-07-2 – мезофил. Температурные интервалы развития штамма лежат в пределах от 25 до 47 0С. Оптимум роста выявлен при 30 0С (рис. 9в).
а) б) в)
Рис. 10. Зависимость роста штамма Х-07-2 от рН (а), концентрации NaCl (б) и температуры (в).
Установлено, что в качестве альтернативных доноров электронов культура активно использует глюкозу и дрожжевой экстракт. С лактатом, пептоном и этанолом роста клеток не обнаружено. Выделенный организм не способен развиваться без добавления донора электронов. В качестве акцепторов электронов микроорганизм на среде с ацетатом восстанавливает аморфную гидроокись железа (III) и сульфат натрия. При использовании в качестве акцепторов электронов ЭДТА - Fe3+ , Na2SO3 и NaNO3 роста не зафиксировано. Штамм не растет без акцептора электронов.
Штамм Х-07-2 относится к диссимиляторным организмам, поскольку урожая клеток на среде без железа (III) зафиксировано не было (рис. 10). Максимум роста штамма с железом выявлен на 20 сутки культивирования.
Рис. 10. Рост штамма Х-07-2 с трехвалентным железом.
Филогенетические свойства. По филогенетическому скринингу, проведенному в базе данных GenBank с помощью программы BLAST, исследуемый штамм относятся δ-подклассу Proteobacteria. Штамм Х-07-2 оказался наиболее близок к Alkaliphilus peptidofermentans (98% сходства) (рис. 11).
0,02
Рис. 11. Филогенетическое дерево на основе анализа 16S рРНК, показывающее положение штамма Х-07-2 в подклассе δ-Proteobacteria.
Сравнительный анализ выделенного штамма с близкородственным видом Alkaliphilus peptidofermentans показал отличия по фенотипическим характеристикам (табл. 5).
Таблица 5.
Сравнительная характеристика выделенного штамма с
близкородственным видом
Характеристика | Alkaliphilus peptidofermentans | штамм Х-07-2 |
Форма клеток | слабо изогнутые палочки | палочки |
Спорообразование | + | + |
Размеры клеток (µм) | 0,25–0,4 х 1,15–3,0 | 0,28–0,3 х 5,58–8,87 |
рН (оптимум) | 7,5–9,7 (9,1) | 7,0-10,7 (10,27) |
NaCl, г/л (оптимум) | 0 – | 5 – |
Т 0С (оптимум) | 6 – | 25 – |
Доноры: глюкоза | - | + |
дрожжевой экстракт | + | + |
лактат | - | - |
пептон | + | - |
этанол | - | - |
ацетат | н. о. | + |
Акцепторы: цитрат Fe (III) | - | + |
АГОЖ (III) | + | + |
Na2SO4 | - | + |
ЭДТА – Fe 3+ | + | - |
Na2SO3 | - | - |
NaNO3 | - | - |
Источник выделения | оз. Верхнее Белое (Бурятия) | оз. Хилганта (Забайкальский край) |
Авторы статей | Жилина и др., 2009 | Наши данные |
Таким образом, выделение из содового озера железоредуцирующих бактерий еще раз подтверждает факт возможности микробного восстановления Fe(III) в щелочных условиях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Микробиологические исследования, проведенные в различных содово-соленых озерах Забайкалья, показали, что в экосистемах с высокими значениями рН и минерализации, широко распространены анаэробные алкалофильные и гало-алкалофильные сульфат - и железоредуцирующие бактерии.
Количественные исследования их деятельности показывают важную роль этих групп микроорганизмов в деструкции органического вещества на терминальных этапах. Сульфат - и железоредукторы играют определенную роль в установлении равновесия между биогеохимическими процессами в донных осадках и водной толще озер.
До недавнего времени считалось, что микробная железоредукция в содовых водоемах невозможна в связи с низкой растворимостью окисного железа в щелочной среде. За последнее время появляется все больше новых сообщений, в которых описываются организмы, способные восстанавливать Fe(III) в щелочных озерах. Выделенный и изученный нами облигатно алкалофильный железоредуктор восстанавливает цитрат Fe(III) при рН среды 9,5 – 10,0.
Выделенный и описанный нами новый представитель СРБ рода Desulfonatronum, расширяет список немногочисленных пока алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий. Использование ацетата выделенным организмом указывает на одну из важнейших экологических функций. Ацетат является несбраживаемым продуктом разложения органического вещества в анаэробных условиях. В большинстве экосистем его удаление осуществляется ацетатокисляющими метаногенами. Однако в содовых водоемах доминирующим процессом на терминальных этапах деструкции органического вещества является сульфатредукция. Таким образом, можно полагать, что выделенные организмы являются важным звеном, ответственным за утилизацию ацетата в алкалофильном микробном сообществе.
ВЫВОДЫ
Сульфатредуцирующие и железоредуцирующие бактерии широко распространены в донных осадках содовых озер Забайкалья. Численность сульфатредукторов варьирует от 10 кл/мл до 100 млн кл/мл, предпочтительным донором электронов является лактат. Впервые определена численность железоредукторов в донных осадках, которая достигает 10 млн кл/мл. В донных осадках и мате озера Соленое, характеризующихся наиболее высокой численностью сульфатредуцирующих бактерий, скорость процесса сульфатредукции достигает 0,70-1,80 мгS/(кг сут). Из содовых озер Алгинское, Белое и Хилганта, различающихся гидрохимическими параметрами, выделены чистые культуры сульфатредукторов, родственных Desulfonatronum lacustre. Тем самым показана широкая географическая распространенность данного вида. Выделен новый представитель рода Desulfonatronum. На основании отличий физиологических и фенотипических свойств выделенного штамма Al915-01 от известных видов рода Desulfonatronum, предлагается выделить его в новый вид «Desulfonatronum acetoxidans». Выявлено, что щелочные условия содово-соленых озер не препятствуют развитию железоредуцирующих бактерий. Из содово-соленого озера Хилганта выделен и охарактеризован новый штамм алкалофильного железоредуктора, близкий к Alkaliphilus peptidofermentans (уровень сходства 98%).Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
Статьи:
Захарюк Fe(III) накопительными культурами из донных отложений содовых озер Забайкалья / , , // Вестник БГУ. Сер. Химия. Биология. География. 2007. С. 136-138. Захарюк разнообразие алкалофильных микроорганизмов в содовом озере Соленое / , , // Вестник БГУ. Сер. Биология. География. 2009. С. 92-95. Захарюк -химическая характеристика песчаных матов содовых озер Доронинское и Зун-Торей (Забайкалье) / , , // Вестник БГУ. Сер. Химия. Физика. 2009. С. 20-22. Захарюк и активность бактерий-деструкторов органического вещества содово-соленого озера Хилганта (Южное Забайкалье) в градиенте рН-соленость / , , / Сибирский экологический журнал. 2010. № 4. С. 425-429.Тезисы:
Захарюк. железовосстанавливающих бактерий в донных осадках содово-соленых озер Забайкалья / // Проблемы экологии и освоения недр. Труды десятого международного симпозиума имени академика студентов и молодых ученых, посвященного 100-летию первого выпуска сибирских инженеров и 110-летию основания Томского политехнического университета. – Томск, 2006. С. 188-190. Захарюк железовосстанавливающих бактерий из содовых озер Забайкалья / , // Материалы II Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс. – Москва, 2006, С. 14-16. Захарюк бактерии донных осадков содово-соленых озер Забайкалья / , // Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии: тез. Всерос. конф. с междунар. участием. - Улан-Удэ, 2006. Т. 2. С. 45-46. Захарюк - и сульфатредукторы в содовых озерах Забайкалья / , // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ: материалы II Байкальского микробиол. симпозиума с междунар. участием. – Иркутск, 2007. С. 89-90. Захарюк рН и NaCl на распространение и активность бактерий-деструкторов в сухом мате озера Хилганта / , // Материалы III Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс. – Москва, 2007, С. 36-37. Захарюк железовосстанавливающих бактерий в деструкции органического вещества в содовых озерах Забайкалья / , // Экология в современном мире: взгляд научной молодежи: тез. Всерос. конф. молодых ученых.– Улан-Удэ, 2007. С. 159-160. Захарюк сульфат - и железоредукторы в содовых озерах Забайкальского края и Бурятии / , , // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Междун. науч. конф. – Минск, 2008. Т.1. С. 134-136. Захарюк сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках озера Соленое (Бурятия) / , // Материалы IV Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс. – Москва, 2008. С. 18-20. Захарюк алкалофильных сульфатредукторов в содовом озере Доронинское / , // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: тез. междун. научной школы-конференции студентов и молодых ученых. – Абакан, 2008. С. 129.Подписано в печать 19.02.10. Формат 60 х 84 1/16.
Усл. печ. л. 1,27. Тираж 100. Заказ № 000.
Издательство Бурятского госуниверситета
г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а
