На правах рукописи
ГОРИН КИРИЛЛ ВИКТОРОВИЧ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБНЫХ НУТРИЕНТОВ – БИОКОРРЕКТОРОВ НА БАЗЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ
Специальность: 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва – 2011
Работа выполнена на кафедре “Биотехнология” ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»
Научный руководитель: | доктор технических наук, профессор
|
Официальные оппоненты: | доктор технических наук, профессор
|
кандидат технических наук
|
Ведущая организация: ФГУ Российский государственный аграрный университет - МСХА имени .
Защита состоится: « __ »____________ 2011 г. в ____ ч. в ауд. ____ на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» Москва, Волоколамское шоссе.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГУПП.
Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять Москва, Волоколамское шоссе, ФГБОУ ВПО МГУПП, ученому секретарю Совета Д 212.148.04
Автореферат отправлен по адресу *****@ для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www. *****.
Автореферат разослан «__» ноября 2011 г.
Ученый секретарь Совета, к. т.н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Во всем мире, и в России в том числе, весьма острой является проблема дефицита животного белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам. Значительный интерес в этом плане представляет использование белка одноклеточных. В Советском Союзе микробная биомасса в виде дрожжей, выращенных на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья и на парафинах нефти (1,5 млн. тонн в год), была очень эффективным обогатителем кормов для сельскохозяйственных животных, однако практически все производства кормовых дрожжей в настоящее время свою деятельность прекратили из-за распада промышленного животноводства
, дороговизны сырья, электроэнергии и материального оснащения. Однако сама идея интенсивного использования микробного белка остается весьма актуальной. Причем такой белок становится все более интересным не только как компонент кормов для животных, но и пищи для людей.
Существующие мощности подавляющего большинства биотехнологических предприятий, возведенных в основном еще в советское время, либо разрушены, либо морально и физически устарели и требуют модернизации с использованием инновационных технологий.
Очень актуальным становится вопрос по каким направлениям вести эти инновации. В “Стратегии национальной безопасности Российской Федерации до 2020 года”, утвержденной Указом президента Российской Федерации № 000 от 01.01.01 г., к числу главных направлений обеспечения национальной безопасности в среднесрочной перспективе отнесена продовольственная безопасность. Микробная биомасса является важнейшим нутриентом человека у народов очень многих стран, однако в нашей стране это направление особенного развития не имело.
Второй немаловажной проблемой является нарушение структуры питания населения. Нехватка в рационе полноценных белков, витаминов, пищевых волокон, макро - и микронутриентов, полезных микробов в пище вызывает рост социально опасных заболеваний, в том числе желудочно-кишечных. Часто причиной этих заболеваний является нарушение микробиоценозов желудочно-кишечного тракта. Возбудителями заболеваний человека и животных нередко становятся условно-патогенные бактерии, приобретающие плазмиды токсигенности, колонизационной резистентности и антибиотикоустойчивости.
Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов агропромышленных предприятий (спиртзаводов, молзаводов, животноводческих комплексов и т. п.). В пищевых отраслях образуется до 45 млн т вторичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется неэффективно, направляясь в отвалы или выливается в водоемы, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.
Все вышеприведенные проблемы могут эффективно решаться путем микробной биоконверсии сложных субстратов, составленных из первичных и вторичных, твердых и жидких агропромышленных продуктов растительного и животного происхождения.
Инструментом биоконверсии исходных субстратов являются прежде всего микроорганизмы, отличающиеся высокой способностью накапливать богатую незаменимыми аминокислотами биомассу на твердых и жидких субстратах, а полученные в результате микробной ферментации продукты имеют очень серьезные перспективы для использования в качестве основы или компонента пищи и кормов.
Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы стала разработка универсального способа биоконверсии различных видов первичного и вторичного агропромышленного и прежде всего растительного сырья, отходов его переработки, в том числе и ксенобиотиков в биологически активные полуфабрикаты, обогащенные микробным белком.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Отселекционировать новые штаммы дрожжей и бактерий из молока млекопитающих, способные расти на твердых негидролизованных растительных субстратах.
2. Сконструировать жидкие и твердые питательные среды для выделенных дрожжей и выявить из них наиболее перспективные, подобрать оптимальный состав и условия культивирования.
3. Сконструировать дрожже–бактериальные ассоциации для совместного культивирования на твердых и жидких субстратах.
4. Разработать рецептуры полуфабрикатов пищевых продуктов и кормов.
5. Оценить химическую и биологическую ценность полученных полуфабрикатов и приготовленных из них продуктов.
Научная новизна.
- Впервые разработана методика выделения дрожжей и молочнокислых бактерий из женского грудного молока.
- Показана возможность эффективной биоконверсии практически любого целлюлозосодержащего растительного сырья с помощью сконструированных дрожже–бактериальных ассоциаций; установлена перспективность использования для этих целей прежде всего дрожжей рода Pichia и молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus. - Установлено, что взаимоотношения дрожжей - суперпродуцентов биомассы и молочнокислых бактерий при совместном аэробном культивировании на твердых средах не носят конкурентного характера. В условиях же анаэробной ферментации наблюдается стимулирующее влияние дрожжей на рост молочнокислых бактерий, а развитие дрожжей при этом подавляется.
- Сформулированы представления о механизме действия выделенных дрожжей и молочнокислых бактерий а также твердых и жидких полуфабрикатов на патогенную микрофлору. Молочнокислые бактерии в чистых культурах и в составе пищевых продуктов в большей или меньшей степени подавляют рост патогенных стафилококков и продукцию стафилококкового энтеротоксина. Дрожжи, выделенные из грудного молока, такой выраженной способностью не обладают и они его могут даже стимулировать подобно сахаромицетам.
- Таким образом, in vitro показано, что дрожжи прежде всего являются нутриентами для бактерий, а молочнокислые бактерии являются потенциальным регулятором микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Результаты исследований выявленных зависимостей послужили обоснованием предложенной в работе технологии производства новых видов нутриентов – биокорректоров на основе аэробно – анаэробной биоконверсии целлюлозосодержащего сырья дрожже – бактериальными ассоциациями.
Практическая значимость результатов работы. Отобраны штаммы дрожжей, обладающие высокой продуктивностью и скоростью роста на различных видах целлюлозосодержащего сырья. Сформированы дрожже-бактериальные ассоциации для эффективной биоконверсии растительных субтратов. Сконструированы твердофазные питательные среды для дрожже-бактериальных ассоциаций. Определены общие закономерности роста дрожже - бактериальных ассоциаций на простых и комплексных твердых питательных средах, определены оптимальные параметры субстратов и условия роста. Разработана двухэтапная технология получения продуктов пищевого и кормового назначения, по которой на аэробном этапе осуществляется в основном накопление дрожжевой биомассы на увлажненном субстрате, после добавления же жидкого компонента ферментация осуществляется в анаэробном режиме с накоплением бактериальной массы, продуктов ее метаболизма и формированием специфического комплекса органолептических свойств новых продуктов. Предложена рецептура и технология производства новых продуктов – напитков на основе отрубей и сенной муки, обогащенных дрожжами и молочнокислыми бактериями. Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика продукта. Разработана технологическая инструкция получения дрожже-бактериального полуфабриката, получаемого путем аэробной твердофазной ферментации пшеничных отрубей.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Международная научно-практическая конференция “Биотехнология. Вода и пищевые продукты” (Москва, 2008); VI Научно-практическая конференция с международным участием “Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли” (Москва, 2008); VI международной научно-практической конференции “ Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты.”; X юбилейном международном форуме “Высокие технологии 21 века” (Москва 2009); Первой научно-практической конференции с международным участием “Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств” (Москва 2009); VII международная научно – практическая конференция и выставка “Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты (Москва 2009); Первой международной научно-практической конференции “Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасность наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах” (Москва 2009); EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow 2010; III межведомственной научно-практической конференции “Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров”, (Москва 2010).
Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 204 источника (в том числе 82 – на иностранных языках) и 7 приложений. Работа изложена на 160 страницах, содержит 39 рисунков, 22 таблицы.
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы рассмотрены общие представления о пищевой цепи животных и человека, охарактеризован каждый составляющий её уровень. Приведена краткая история индустриального производства микробного белка. Рассмотрен микробный биоценоз желудочно – кишечного тракта, его роль в колонизации кишечника макроорганизма, приведены современные средства его коррекции. Также приведены данные по стафилококку и стафилококковым энтеротоксинам и их роли в желудочно – кишечной патологии. Дана характеристика молока млекопитающих, химический и микробиологический состав, а также его роль в становлении и поддержании микробиоценоза человека.
2 ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводились на кафедрах “Биотехнология” МГУПП, “Биология почв” МГУ, а также в лабораториях «Молекулярные основы патогенности» (группы «Стафилококковых инфекций») и лаборатории “Генная инженерия патогенных микроорганизмов” ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России.
2.1 Материалы и методы исследований
Объектом исследования были различные штаммы дрожжей и бактерий, выделенные из молока млекопитающих, микробиоценозов молочнокислых продуктов, производственных заквасок и пробиотических продуктов.
Образцы молока млекопитающих высевали на твердофазную питательную среду (пшеничные отруби), в которую добавляли 50 мкг/г гентамицина. После инкубации в аэробных условиях при температуре 28-32ºС выделяли доминирующие культуры и оценивали их продуктивность. Критерием оценки служила концентрация дрожжевых клеток в 1 г субстрата, накопленная в процессе ТФФ. Подсчет клеток осуществляли микроскопически в камере Горяева. Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра. Идентификацию дрожжей проводили по общепринятой методике (, 1979) согласно определителям дрожжей. Идентификацию дрожжей до вида проводили методом ПЦР-анализа ( и др., 2006).
В качестве основы питательных сред использовалось целлюлозосодержащее сырье: сенная мука, травяная мука, соломенная мука, шрот подсолнечный, шрот соевый, а также зерно, продукты и отходы его переработки, корнеплоды, овощи.
ГФ вели в качалочных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. Продолжительность ферментации –ч, температура 30±2°С.
ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в качалочных колбах при высоте слоя 1-3 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат начаса при температуре воздуха 30±2°С и влажности 90-95%.
Содержание сырого протеина определяли по методу Несслера, величину рН измеряли потенциометрическим методом.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по программе Excel 97 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%.
2.2 Результаты исследований и их обсуждение.
2.2.1 Селекция дрожжей – суперпродуцентов биомассы на целлюлозосодержащем сырье.
В литературе очень много сведений о лактобактериях и бифидобактериях молока и в частности женского грудного молока, об их роли в формировании микробиоценозов ребенка, потребляющего это молоко.
И в то же время очень мало сведений о дрожжевой компоненте этих продуктов. В настоящей работе мы сделали попытку осветить этот малоизученный вопрос. В общей сложности было выделено более 100 дрожжевых культур. Так как доминирующей в молоке все-таки является бактериальная составляющая, а дрожжи, если даже они в нем встречаются, все-таки вряд ли могут конкурировать с бактериями, в женском грудном молоке дрожжи искали на разных стадиях его формирования (молозиво и стационарное молоко), а само культивирование вели как без подавления бактериальной флоры, так и при подавлении ее антибиотиком гентамицином. В таблице 1 представлены результаты этой серии экспериментов.
Таблица 1
Рост дрожжей из натурального молока на пшеничных отрубях.
№ п/п | Источник дрожжей | Коли-чество иссле-дуемых образцов | Количество выросших дрожжевых культур | |||
На отрубях с антибиотиком | На чистых отрубях | |||||
Положительных результатов | % | Положительных результатов | % | |||
1 | Натуральное коровье молоко | 31 | 30 | 96,7 | 29 | 93,5 |
2 | Женское молозиво | 43 | 3 | 6,97 | 2 | 4,65 |
3 | Женское грудное молоко стационарное | 32 | 25 | 78,1 | 15 | 46,87 |
Из этой таблицы достаточно четко видно, что в изученном в качестве контроля коровьем молоке выделяемость дрожжей почти 100% - ная как на средах без антибиотика, так и в его присутствии. Что же касается женского грудного молока, то здесь ситуация значительно более сложная. На основании наших экспериментов мы можем говорить о положительном влиянии вводимого в питательные среды гентамицина на стимулирование роста дрожжей и частоту их выделения. И совсем уж демонстративной является разница в частоте выделения дрожжей из молозива и стационарного молока. На основании этих результатов мы считаем нерациональным пытаться выделять дрожжи из молозива и в качестве материала для поиска дрожжей рекомендуем использовать стационарное молоко.
Дрожжи, выделения из молока млекопитающих и пищевых продуктов, сравнивались по продуктивности при ГФ и ТФФ (таблица 2).
Таблица 2
Продуктивность дрожжей при глубинной и твердофазной ферментации
№ п/п | Источник выделения | Продуктивность 109 кл./ г (см3) | ||||
ГФ на молоке | ТФФ на пшеничном проделе | ТФФ на пшеничных отрубях | ||||
24 ч | 24 ч | 24 ч | 48 ч | 72 ч | ||
1 | Коровье молоко | 0,15 | 0,65 | 0,2 | 0,8 | 1,3 |
2 | Коровье молоко | 0,27 | 0,51 | 0,1 | 0,6 | 1,1 |
3 | Коровье молоко | 0,05 | 0,32 | 0,18 | 0,5 | 1,4 |
4 | Коровье молоко | 0,22 | 0,53 | 0,16 | 0,9 | 1,2 |
5 | Коровье молоко | 0,07 | 0,06 | 0,2 | 1,4 | 2,5 |
6 | Коровье молоко | 0,1 | 0,67 | 0,3 | 0,7 | 1,6 |
7 | Коровье молоко | 0,03 | 0,26 | 0,24 | 0,5 | 0,9 |
8 | Коровье молоко | 0,2 | 0,15 | 0,4 | 0,9 | 2,1 |
9 | Коровье молоко | 0,21 | - | - | - | - |
10 | Коровье молоко | 0,13 | 0,37 | 0,22 | 0,7 | 1,2 |
11 | Коровье молоко | 0,2 | 0,14 | 0,3 | 0,6 | 1,1 |
12 | Коровье молоко | 0,1 | 0,41 | 0,2 | 0,5 | 0,9 |
13 | Коровье молоко | 0,1 | 0,18 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |
14 | Коровье молоко | - | - | - | - | - |
15 | Коровье молоко | 0,05 | 0,13 | 0,26 | 0,9 | 1,7 |
16 | Коровье молоко | 0,1 | 2 | 1,25 | 2,1 | 2,9 |
17 | Коровье молоко | 0,15 | 0,51 | 0,28 | 0,8 | 1,6 |
18 | Коровье молоко | 0,1 | 0,41 | 2,4 | 3,1 | 3,3 |
19 | Коровье молоко | 0,11 | 0,55 | 2,5 | 3,3 | 3,6 |
20 | Коровье молоко | - | - | - | - | - |
21 | Коровье молоко | 0,03 | 0,3 | 0,6 | 0,8 | 1,9 |
22 | Коровье молоко | 0,05 | 0,24 | 0,4 | 0,7 | 1,2 |
23 | Коровье молоко | 0,1 | 0,3 | 0,22 | 1,1 | 1,8 |
24 | Коровье молоко | 0,2 | 1,2 | 0,15 | 0,4 | 0,7 |
25 | Коровье молоко | 0,3 | 0,2 | 0,5 | 0,7 | 1,1 |
26 | Коровье молоко | 0,6 | 1,9 | 1,2 | 2,3 | 3,6 |
27 | Коровье молоко | 0,31 | 0,85 | 1,2 | 1,8 | 2,9 |
28 | Коровье молоко | 0,17 | 0,8 | 0,9 | 1,7 | 2,3 |
29 | Коровье молоко | 0,06 | 0,46 | 0,4 | 0,8 | 2,2 |
30 | Коровье молоко | 0,03 | 0,9 | 1 | 2,3 | 3,1 |
31 | Коровье молоко | 0,2 | 0,5 | 0,34 | 0,9 | 2,1 |
32 | Козье молоко | 0,12 | 0,9 | 0,28 | 0,7 | 1,5 |
33 | Айран | 0,4 | 0,7 | 1 | 1,7 | 1,8 |
34 | Кефир | 0,05 | 0,8 | 0,8 | 1,1 | 1,2 |
35 | Candida famata T8 | 0,9 | 2 | 2,1 | 3,7 | 4,2 |
В ряде случаев при росте дрожжей, выделенных из коровьего молока, на твердой питательной среде продуктивность была в 10 раз выше, чем на жидкой среде. В связи с этим выбор был сделан в пользу твердофазного культивирования для накопления дрожжевой биомассы. Следует отметить, что только 11 % штаммов дрожжей, выделенных из коровьего молока приближались, но не превосходили по продуктивности контрольный штамм Candida famata T8.
Культуры дрожжей, выделенные из женского грудного молока, также сравнивались по продуктивности с эталонным штаммом дрожжей – Сandida famata T8, который уже используется в производстве БАД “Фервитал” (Солдатова, 2004 г, таблица 3). Близкими к нему свойствами обладают 12 % тестируемых культур, превосходящими 35%. Как правило, это дрожжи, размеры клеток которых не превышают (1,5-4,0) х (3,0-8,0) мкм.
Таблица 3
Продуктивность дрожжей, выделенных из грудного молока, на пшеничных отрубях.
№ п/п | Штамм | Размеры клеток на Сабуро-агаре, мкм | Продуктивность дрожжей, 109 кл./г | ||
24 | 48 | 72 | |||
1 | P1 | (1,0-3,0)×(3,0-6,0) | 2,1 | 4,9 | 5,1 |
2 | А1 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 2,2 | 4,7 | 4,9 |
3 | I1 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 1,9 | 4,3 | 4,5 |
4 | А2 | (2,0-4,0)×(3,0-12,0) | 1,1 | 1,5 | 1,5 |
5 | Т1 | (2,0-4,0)×(3,5-12,0) | 1,4 | 2,5 | 2,7 |
6 | L1 | (2,0-4,0)×(3,5-12,0) | 0,6 | 1,2 | 1,3 |
7 | N1 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 1,5 | 3,9 | 4,6 |
8 | 8 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 1,2 | 2,8 | 3,1 |
9 | 9а | (1,0-3,0)×(3,0-6,0) | 2,5 | 5,1 | 5,3 |
10 | 9b | (1,0-3,0)×(3,0-6,0) | 2,3 | 5,0 | 5,1 |
11 | 11 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 0,7 | 0,8 | 1,3 |
12 | 12 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 1,3 | 1,5 | 1,5 |
13 | 13 | (1,0-3,0)×(3,0-8,0) | 1,8 | 2,6 | 2,9 |
14 | 14 | (1,0-3,5)×(3,5-8,0) | 1,6 | 2,3 | 2,6 |
15 | 17 | (2,0-4,0)×(3,0-12,0) | 0,6 | 0,9 | 1,2 |
16 | 19 | (1,0-3,0)×(3,0-6,0) | 1,0 | 2,7 | 3,0 |
17 | 25 | (1,0-3,0)×(3,0-6,0) | 1,1 | 2,0 | 2,5 |
18 | Candida famata Т8 | (1,5-4,0)×(3,0-5,0) | 2,2 | 3,6 | 4,4 |
Самые продуктивные выделенные штаммы идентифицированы по ПЦР до вида: Pichia anomala (P1, 9a), Pichia guilliermondii (A1, I1). Изучены их биохимические свойства, а также определена способность к пленкообразованию всех выделенных дрожжей в чистом виде и совместно с лактобактериями.
2.2.2 Конструирование питательных субстратов для твердофазной ферментации.
Если говорить о крупнотоннажном производстве микробной биомассы методом ТФФ, то для этих целей одних отрубей не достаточно в силу того, что они сами по себе являются высокоценным кормовым продуктом и хорошей добавкой к пище, прежде всего к хлебобулочным изделиям. Для этих целей нужно иметь множество различных субстратов вторичных и первичных, а в агропромышленном комплексе России они есть. Одним из таких субстратов является сенная мука из дикорастущих и сеяных трав, количество которой может достигать сотен миллионов тонн, если учесть те огромные нераспахиваемые площади в стране, на которых травы вообще никогда не косились, и практически половину пахотных земель, которые заросли травами и нередко мелколесьем за последние 20 лет.
В качестве первичного агропромышленного сырья для конструирования питательных субстратов использовали сенную и травяную муку. На первичном сырье практически самыми продуктивными оказались те же штаммы, что и на отрубях, достигая максимума 4,7•109 кл/г. Самым интересным из первичного сырья оказалась сенная мука (рисунок 1), продуктивность выделенных дрожжей на ней была даже несколько выше, чем на травяной муке. Это можно объяснить несколько большей пористостью сенной муки, изготовленной из созревших, более богатых целлюлозой растений.
Рисунок 1 - Продуктивность дрожжей на сенной муке. | Более нежные частицы травяной муки, возможно, не обеспечивают оптимальную степень пористости. Сенная мука естественной сушки имеет неоспоримые экономические преимущества. |
Заготовка, хранение и подготовка сырья требует специальных технических средств, материальных и трудовых затрат. В то же время в агропромышленном комплексе имеется достаточно большое количество вторичных субстратов, которые остаются, нередко в очень больших количествах после получения целевого первичного продукта. В качестве вторичного сырья использовали соломенную муку, подсолнечный шрот, соевый шрот, свеклосахарный жом. Практически около 50 млн. тонн соломы не находит рационального применения и в основном просто сжигается. На соломе мы также попытались накапливать микробную биомассу. Хотя и на этом субстрате самыми продуктивными были штаммы дрожжей, продуктивные на сенной и травяной муке, но все же на этом виде целлюлозосодержащего сырья продуктивность дрожжей едва превышала 1 • 109 клеток/г, т. е. практически была ниже в 4 раза, а значит по каким - то составляющим этот субстрат явно был дефицитным и для интенсивного роста дрожжей он должен обогащаться какими – то добавками, более богатыми ростовыми веществами.
В этом плане другие вторичные продукты, такие как подсолнечниковый и соевый шроты, свеклосахарный жом были несравненно более продуктивными для накопления дрожжевой биомассы• 109 кл/г субстрата). Естественно, что такие вторичные продукты как соевый и подсолнечниковый шроты сами по себе являются ценными кормовыми добавками и источниками достаточно ценного растительного белка для животных и для микробной биоконверсии они могут быть использованы весьма ограниченно. А вот свеклосахарный жом в нашей стране на современном этапе, когда производство сахарной свеклы и активность сахарных заводов заметно оживились, составляет серьезную проблему, т. к. он не утилизируется традиционными методами как корм для крупного рогатого скота и часто является серьезным загрязнителем окружающей среды в регионах производства и переработки сахарной свеклы.
| Конструирование питательных сред из новых субстра-тов естественно требует нахожде-ния оптимальной степени диспер-сности, влажности среды и влияния углеводных и азот-содержащих добавок. |
Рисунок 2 - Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9a на разных фракциях сенной муки.На рисунке 2 представлен наиболее подходящий размер частиц сенной муки для биоконверисии ее дрожжами. Продуктивность дрожжей не сильно зависит от дисперсности целлюлозосодержащих материалов, но все - таки максимум достигается при размере частиц 1 – 3 мм, т. е. в производственных условиях у технолога будет достаточно большая степень свободы в этом параметре.
| Классическое твердофазное культивирование микроорганизмов сформулировало представление о каких – то стандартных условиях влажности твердофазных культур. Обычно она колеблется в интервале 50-60%. |
Рисунок 3 - Удельная продуктивность дрожжей Pichia amomala 9a при различной влажности сенной муки.Вообще для роста дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах показатель оптимальной влажности довольно сильно размыт, что опять же и по этому параметру дает технологу довольно широкую степень свободы, а если говорить об оптимуме влажности, то при такой ферментации, по нашему мнению, нужно ввести новый показатель эффективности роста культур на твердофазной среде – удельную продуктивность дрожжей при различной влажности. По этому показателю как на отрубях, так и на сенной муке (рисунок 3) оптимум будет приходиться на 70 – 80% - ную влажность, что в литературе обычно не фигурировало. Это также является значительным удобством для технолога, т. к. в условиях интенсивного роста твердофазных культур значительное повышение влажности это явление достаточно типичное.
Для более четкого представления о стимулирующей роли углеводных добавок на рост дрожжей использовали наиболее бедный для микробной биоконверсии субстрат – пшеничную солому. В качестве нативных сахаров использовали сахарозу и глюкозу, а также овощи, богатые углеводами, морковь и капусту белокочанную с содержанием глюкозы 2,5 % и 2,6 % соответсвенно.
Солому и овощи в соотношении 1:3 засевали дрожже-бактериальной ассоциацией до влажности 50-55%. В качестве контролей служили чистая солома, морковь и капуста. Образцы соломы с сахарозой и глюкозой увлажняли до влажности 50-55% и конечной концентрацией сахара засеянной культуры 2% (рисунок 4).
Рисунок 4 - Продуктивность дрожжей Pichia anomala 9а на питательных средах с углеводными добавками. | Добавление сахарозы стимулировало продуктивность дрожжей в 1,7 раза, глюкозы – в 2 раза, моркови – в 4,7 раза, капусты – в 5 раз по сравнению с продуктивностью на нативной соломе. |
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что стимуляция роста дрожжей более эффективна при добавлении комплексных углеводистых субстратов. Возможно, это связано не только с содержанием углеводов в овощах, но и других минеральных элементов.
Соломенная мука по химическому составу значительно беднее сенной муки и прежде всего по сырому протеину. В работе была сделана попытка повысить содержание белка в этих субстратах с помощью минерального азота (сульфат аммония) и нативной зерновой послеспиртовой барды.
Введение минерального азота в сенную питательную среду не оказывает заметного стимулирующего влияния на рост дрожжей.
Таблица 4
Влияние барды на рост дрожжей на соломе.
№ п/п | Штамм | Питательная среда | Увлажняющий компо-нент | Влажность, % | 24 часа | 48 часов | 72 часа |
1 | Candida famata T8 | солома | барда | 50-55 | 6,0 | 6,3 | 4,7 |
2 | P. guilliermondii A1 | солома | барда | 50-55 | 7,2 | 6,4 | 4,3 |
3 | P. anomala P1 | солома | барда | 50-55 | 6,0 | 5,3 | 3,9 |
7 | C. famata T8 | солома+зерно (1:1) | барда | 50-55 | 4,2 | 7,0 | 4,5 |
8 | P. guilliermondii A1 | солома+зерно (1:1) | барда | 50-55 | 5,0 | 8,0 | 5,5 |
9 | P. anomala P1 | солома+зерно (1:1) | барда | 50-55 | 5,6 | 8,3 | 4,8 |
В то же время из таблицы 4 достаточно наглядно видно, что барда является очень хорошим стимулятором роста дрожжей на соломенной муке, причем этот рост идет быстро, в основном в течение первых суток. Последующее культивирование обычно приводит к лизису уже наросших дрожжей. Если же к этому комплексному субстрату добавлять измельченное зерно, то максимум клеток достигается за более продолжительное время и этот максимум ни так уж значительно отличается от комплексной среды без зерна. Скорее всего, наиболее рациональной средой для утилизации барды по данной технологии будет соломенная мука, увлажненная зерновой бардой до 60-70% - ой влажности.
2.2.3. Определение условий культивирования дрожжей на целлюлозосодержащих субстратах.
Определена наиболее подходящая температура для культивирования выделенных дрожжей - 30°С, высота слоя твердофазной культуры – не более 3 см.
В большинстве случаев дрожжи накапливают биомассу в течение 24-48 часов, а затем через 72 часа наблюдается либо незначительное нарастание, либо культура остается на том же уровне. Нередки также факты, когда после 48 часов ферментации можно визуально наблюдать снижение числа клеток в твердофазных культурах, в других же случаях к 72-му часу рост продолжается. Задачей технолога в каждом отдельном случае, применительно к продукту и субстрату проконтролировать ход процесса. Но все-таки как правило основную массу клеток (свыше 70%) дрожжи наращивали в течение первых двух суток.
Перемешивание растущей твердофазной культуры особо не влияет на рост дрожжей. Этот факт мы считаем очень важным при конструировании растильного оборудования для твердофазного культивирования микроорганизмов. Практически приемлемыми могут быть установки и с перемешиванием и без перемешивания растущей культуры.
2.3. Взаимодействие дрожжей и лактобактерий в процессе производства микробных нутриентов.
Рисунок 5 – Динамика дрожжей Pichia anomala 9a и лактобактерий Lactobacillus acidophilus в процессе аэробного культивирования на сенной муке. | Лактобактерии при совместном твердофазном культивировании с дрожжами в аэробных условиях не оказывают на них ингибирующего и стимулирующего влияния. В этих условиях идет преимущественное накопление дрожжевой биомассы (рисунок 5). |
Рисунок 6 – Динамика дрожжей Pichia anomala 9a и лактобактерий Lactobacillus acidophilus в ходе анаэробной ферментации. | В процессе анаэробной ферментации создаются благоприятные условия для развития лактобактерий и роль дрожжей отходит на второй план – их рост прекращается и даже отмечается постепенный их лизис (рисунок 6). |
В процессе анаэробного культивирования активная кислотность уменьшается, а титруемая возрастает. Скорее всего это связано с интенсивным ростом лактобактерий и образованием ими молочной кислоты. Если говорить о получении напитка по титруемой кислотности сравнимой с квасом (20-40 °Т), то достаточно 24 –ех часовой ферметнации, кефира °Т) – 96 – ти часовой ферметнации. Содержание сухих веществ (СВ) в напитке составляло 12%.
Содержание белка в продуктах микробной ферментации повышается на 20-25% и что особенно важно на 20-30% нарастает содержание особо ценных незаменимых аминокислот.
2.4. Некоторые аспекты взаимодействия дрожже-бактериальных препаратов и патогенных микроорганизмов.
В процессе исследования влияния чистых культур бактерий на патогенные стафилококки показано, что молочнокислые бактерии обладают ингибирующей способностью по отношению к СЭА и СЭВ, причем более активно они ингибировали синтез СЭА, чем СЭВ.
Что касается дрожжей, то из таблицы 5 видно, что взятые в качестве контроля дрожжи Saccharomyces boulardii известные в литературе их позитивным действием при заболеваниях, вызванных токсигенными бактериями, никакого ингибирующего действия на выбранный нами модельный штамм и его токсинообразование не оказывают. Аналогично ведут себя и полученные нами инактивированные комплексные культуры, что позволяет сделать заключение, что дрожжи являются в основном нутриентами и если мы говорим о позитивном действии дрожжей при токсикоинфекциях, то скорее всего речь идет о непрямом их влиянии на токсигенный микроб через стимулирование активности собственной полезной микрофлоры кишечника. Роль же прямых биокорректоров принадлежит скорее всего бактериальной составляющей ассоциации, а сама ассоциация в пищевых и кормовых продуктах должна содержать живые комплексные культуры.
Таблица 5
Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих Staphylococcus aureus FRI 722 при совместном выращивании с жидкими дрожже-бактериальными полуфабрикатами.
№ п/п | Штамм | lg КОЕ/ см3(г) | Фосфоли-пазная актив-ность, % | pH | Концентрация токсина | |||||
б/р | 1:10 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | ||||||
1 | Контроль 1 S. aureus FRI 722 | 10,8 | 100 | 7,81 | + | + | + | - | - | |
2 | Контроль 2 S. aureus FRI 722 +отруби +свекла+ сахарный р-р. | 10,2 | 25 | 5,0 | + | + | - | - | - | |
3 | S. boulardii живые | 9,5 | 100 | 8,45 | + | + | + | + | - | |
S. boulardii инакт.* | 10 | 100 | 8,2 | + | + | + | + | + | ||
Комплексные культуры | ||||||||||
3 | P. anomala 9а на 2 сутки+L. acidophilus | 9,7 | 50 | 8,33 | + | - | - | - | - |
|
4 | P. anomala 9а инакт. на 2 сутки +L. acidophilus | 11,8 | 100 | 7,4 | + | + | + | + | + |
|
5 | P. anomala 9а на 5 сутки + L. acidophilus | 10 | 90 | 8,6 | - | - | - | - | - |
|
6 | P. anomala 9а инакт. на 5 сутки +L. acidophilus | 12,3 | 100 | 8,2 | + | + | + | + | - |
|
7 | P. anomala 9а на 7 сутки + L. acidophilus | 9,3 | 60 | 8,71 | - | - | - | - | - |
|
8 | P. anomala 9а инакт на 7 сутки +L. acidophilus | 9,7 | 60 | 8,05 | + | + | + | + | - |
|
*инакт – инактивированный (прогретый при 100°С 15 минут)
2.5. Пути технологической и технической реализации разработанных процессов.
На рисунке 7 представлена принципиальная схема получения микробных нутриентов.
Основной стадией получения продуктов по разработанной технологии является непосредственно ферментация твердых субстратов дрожже – бактериальными ассоциациями. В условиях существующих спиртзаводов и хлебозаводов данную стадию возможно осуществлять непосредственно в кюветах или поддонах, используемых на спиртзаводах для получения грибных гидролитических ферментов методом твердофазного культивирования, на хлебозаводах – на протвинях для выпечки хлеба.
Если технология будет доведена до промышленного производства, эта стадия станет самим узким местом в техническом решении. Здесь нами разработаны 2 варианта оборудования:
1. Для чисто твердофазной ферментации в кондиционируемом помещении может быть использована система горизонтальных транспортерных лент с ограничиваемой высотой слоя растущей культуры и с пересыпанием с ленты на ленту. Прототипы подобного устройства в литературе известны.
|
|
 |
Рисунок 7 - Блок – схема ключевых технологических этапов разрабатываемой технологии.
ВЫВОДЫ
1. Установлена возможность эффективного накопления микробной биомассы пищевого и кормового назначения на твердых целлюлозосодержащих субстратах.
2. В качестве источника микроорганизмов - продуцентов биомассы предложено использовать молоко млекопитающих.
3. Наиболее перспективным источником дрожжей и бактерий - продуцентов биомассы на твердых растительных субстратах признано женское грудное молоко.
4. Для накопления дрожже-бактериальной биомассы рекомендовано использовать различные виды первичного и вторичного целлюлозосодержащего сырья: зерновые отруби, сенная, травяная мука, жомы, шроты и т. п.
5. Подобраны оптимальные условия культивирования дрожже-бактериальных сообществ на различных твердофазных субстратах: влажность - 40-70%, температура – 30-35°С, продолжительность культивирования 24-48 часов, размер частиц субстрата – 1-3 мм, высота слоя растущей культуры – до 3 см.
6. В разработанной технологии ферментацию предложено осуществлять в 2 этапа: 1 – й этап - аэробный, на котором осуществляется в основном накопление дрожжевой биомассы на увлажненной твердой среде, 2 - й этап – после добавления жидкого компонента ферментация осуществляется в анаэробном режиме с накоплением бактериальной массы и продуктов ее метаболизма, которые в основном формируют органолептические свойства получаемых продуктов.
7. Разработана технологическая схема, по которой пищевые и кормовые продукты и полуфабрикаты могут получаться как в твердофазном так и в твердофазно – глубинном варианте.
8. Установлены принципы взаимодействия получаемых твердых и жидких микробных продуктов с патогенными токсигенными микроорганизмами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Твердофазное культивирование микроорганизмов в комплексном решении народно-хозяйственных проблем. / , // В сб.: Международная научно-практическая конференция “Биотехнология. Вода и пищевые продукты”. Москва, 11-13 марта 2008 г. - С.57.
2. Микробная биомасса в пище и кормах: свершения и надежды. / , // В сб.: VI Научно-практическая конференция с международным участием “Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли”. М.: МГУПП, 18-19 ноября 2008 г. – С. 64-71.
3. Функциональные пищевые продукты на основе первичного и вторичного зернового сырья. / // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты. Сборник материалов VI международной научно-практической конференции. – М.: МГУПП, 2008 г. – Ч.2. – С. 117-121.
4. Инновационные технологии производства продовольствия и кормов. / // X юбилейный международный форум “Высокие технологии 21 века”. Москва, 21-24 апреля 2009 г. – С. 193-196.
5. Жидкие агропромышленные поллюанты как сырье для производства микробной биомассы. / , , // Первая научно-практическая конференция с международным участием “Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств”. - М.: МГУПП, 23 сентября 2009 г. – С. 57-62.
6. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для производства дрожжевой биомассы. / , // VII международная научно – практическая конференция и выставка “Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты”. – М.:МГУПП, 7-8 октября 2009 г. – С. 157-161.
7. Альтернативное производство продовольствия в условиях кризиса. / // Пищевая промышленность, 2009 г. - №6. – С.28-29.
8. Gorin K. V. The yeast-bacterial edible products based on the primary and secondary agroindustrial raw materials. / Borisenko E. G., Kanochkina M. S, Nguen Chyong Zang // EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow, 2010. – Р. 236-237.
9. Горин К. В. Нутриенты – биокорректоры на базе нетрадиционного сырья. / , , // Сборник докладов III межведомственной научно-практической конференции “Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров”/ Отв. ред. . – М.: Издательский комплекс МГУПП, 2010. – С. 81-85.
10. Влияние молочнокислых микроорганизмов и дрожжей на продукцию стафилококковых энтеротокссинов типа А и В. / , , // Вопросы питания, 2011. – Том 80. - №5. – С. 55 – 59.
Список сокращений, использованных в автореферате
БАД – биологически активная добавка; ГФ – глубинная ферментация; ТТФ – твердофазная ферментация; ТГФ – твердофазно – глубинная ферментация; ПЦР – полимеразная цепная реакция; СЭА – стафилококковый энтеротоксин типа А; СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа В; СВ – сухие вещества.
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д. т.н., профессору , заведующей кафедрой “Биотехнология” МГУПП д. т.н., профессору , к. м.н., с. н.с. НИИЭМ им. , с. н.с. НИИЭМ им. , заведующему кафедрой “Биологии почв” МГУ д. б.н., профессору , а также всем сотрудникам кафедры «Биотехнология» МГУПП.
Summary
The problem of protein deficit in human’s and animal’s nutrition based on microbial bioconversion various cellulosic substrate, which enriched essential amino acid, vitamins, we suggest to decide. The strains of yeasts and bacteria were selected from human breast milk. These yeasts have ability of intensive accumulation of biomass on various primary and secondary raw materials during solid-state fermentation. We developed yeasts – bacteria associations for bioconversion raw materials, which contain cellulose: crushed grass, hay, straw, green weight of corn and millet, grain, products of its processing, tubers, root crops and etc. These yeasts – bacteria associations depend upon aerobic – anaerobic fermentaton are used for production semi – products for food and feed, which become a nutrients - biocorrectors of gastro – intestinal tract. Its food and feed enriched viable microflora action against pathogenic bacteria and it’s toxins.
