Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто
- 30% recurring commission
- Выплаты в USDT
- Вывод каждую неделю
- Комиссия до 5 лет за каждого referral
На правах рукописи
ПАВЛОВ КОНСТАНТИН АЛЕКСАНДРОВИЧ
Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного
кислого протеина
03.00.04 - биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Государственный научный центр судебной и социальной психиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор,
ФГУ «ГНЦССП Росздрава»
Владимир Павлович Чехонин
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук,
ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России-ВЦ»
Вадим Анатольевич Меркулов
Доктор биологических наук, профессор
НИИ «ФХМ ФМБА России»
Вадим Маркович Говорун
Ведущее учреждение:
ГОУ ВПО Московская медицинская академия им.
Защита состоится «17» июня 2009г. в ______ часов на заседании Диссертационного Совета Д208.057.01 при НИИ «ФХМ ФМБА России» Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ «ФХМ ФМБА России» Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.
Автореферат разослан «15» мая 2009г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук,
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Количественный анализ глиофибриллярного кислого протеина (GFAP) в биологических жидкостях человека является критерием выбора в оценке тяжести нарушения резистентности гематоэнцефалического барьера больных нервными и психическими заболеваниями [Aurell A. 1991; Blennow M. 1995; 1996; Dotevall L. 1996; Eng L. 2000, Hermann M. 2000; 2001; Van Geel W. J. 2002 ; Herrmann 2003; Jauch E. 2000; Kristjansdottir R. 2001; Sporer B. 2004; Petzold A. 2004]. Практически любой патологический процесс в нервной ткани характеризуется, в той или иной степени, активацией ее астроглиального компонента, и последующим реактивным астроглиозом [Eddleston M. 1993; McGraw J. 2001]. Наиболее ярким проявлением реактивного астроглиоза на субклеточном уровне является резкое увеличение экспрессии GFAP в активированных астроцитах [Blomstrand C. 1995; Hill M. 2000; Fitch M. T. 2008]. Дальнейшее развитие патологического процесса, как правило, приводит к гибели реактивных астроцитов, нарушению резистентности цитоплазматической мембраны и элиминации GFAP - белка промежуточных филаментов астроцитов в межклеточную жидкость, а затем диффузии его в ликвор и кровоток пациента [Eng L. 2000; 2001; Guffard R. G. 2005; Pekny M. 2004, 2007; Wang W. 2007]. Подобная диффузия GFAP наблюдается при некоторых патологических состояниях из-за нарушение структуры и барьерных функций гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Rosenfeld R. G. 1987; Cornford E. M. 2005].
Таким образом, количество GFAP в биологических жидкостях напрямую зависит от количества погибших или поврежденных астроцитов, что в свою очередь отражает степень выраженности нейродегенеративных процессов [Lamers K. J. 2003; Petzold A. 2004]. Используя метод количественного иммуноферментного анализа для определения концентрации GFAP в крови и ликворе в динамике развития патогенетического процесса, можно получить достоверную информацию о темпах развития заболевания и оценить эффективность применяемой терапии.
Цель исследования: Получить и охарактеризовать рекомбинантный GFAP человека, иммунохимически идентичный нативному антигену и разработать иммуноферментный анализ для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного GFAP и антител полученных при иммунизации данным белком.
Задачи исследования:
1. Клонировать кДНК hGFAP в вектор pET28-a, и получить штамм-продуцент, обладающий способностью к биосинтезу рекомбинантного белка с высоким уровнем эффективности.
2. Разработать метод очистки рекомбинантного белка из первичного биоматериала с высоким уровнем гомогенности и максимальным выходом.
3. Провести сравнительный иммунохимический анализ нативного и рекомбинантного препарата GFAP с использованием коммерческих препаратов антисывороток.
4. Получить поликлональные и моноклональные анти-GFAP антитела и иммунохимически охарактеризовать их.
5. Разработать метод количественного иммуноферментного анализа GFAP на основе рекомбинантного препарата и соответствующих поли - и моноклональных антител в биологических жидкостях и протоколы для иммуногистохимического анализа GFAP на гистологических срезах и в культуре клеток.
Научная новизна.
1. Впервые показано, что рекомбинантный GFAP обладает идентичными нативному белку иммунохимическими и иммуногенными свойствами, а препараты моноклональных и поликлональных антител полученных в результате иммунизации рекомбинантным GFAP идентичны антителам, традиционно получаемым иммунизацией нативным белком.
2. Впервые создан и стандартизован сэндвич вариант твердофазного ИФА для определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека на основе рекомбинантного препарата GFAP и полученных к нему антител.
Практическая значимость: Разработанная иммуноферментная тест-система анализа GFAP характеризуется высоким уровнем технологичности. Все антительные компоненты системы получены при иммунизации животных рекомбинантным GFAP, что позволяет их стандартизовать и накапливать в необходимых количествах. Данная тест-система позволяет воспроизводимо, специфично и надежно осуществлять количественный мониторинг функциональной и структурной целостности ГЭБ при нервных и психических заболеваниях, а также других поражениях ЦНС (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, различные формы менингитов и энцефалитов), опухолях и травмах головного мозга. Анализ результатов количественного скрининга и мониторинга GFAP в сыворотке крови больных дает возможность рекомендовать его для дополнительной диагностики, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.
Положения, выносимые на защиту:
1. Клонирование кДНК hGFAP в вектор pET28a и последующая экспрессия в штамме E. coli (DE3 BL21) позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену.
2. Поликлональные и моноклональные антитела, полученные к рекомбинантному GFAP идентичны антителам, получаемым к нативному антигену.
3. На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.
Внедрение результатов исследования: Разработанный иммуноферментный анализ активно применяется в лаборатории иммунохимии отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава» для изучения иммунохимических аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.
Полученные антитела активно применяются для иммуногистохимических исследований мозга экспериментальных животных с целью оценки степени выраженности нейродегенеративных процессов при моделировании различных патологических состояний, а также для разработки липосомальных контейнеров векторного типа, способных транспортировать диагностические и терапевтические препараты в заинтересованную область ЦНС.
Апробация материалов диссертационного исследования. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании проблемного совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП Росздрава».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 4 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 – глава в монографии.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 схемами, 21 рисунком, 1 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (160 источников из них 4 отечественных и 156 зарубежных авторов). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клонирование кДНК hGFAP в вектор pET28a и экспрессия рекомбинантного белка в E. coli (штамм DE3-BL21).
Выделение полиA+ мРНК было выполнено с помощью магнитных олиго-дT чаcтиц из первичной культуры астроцитов. Первичная культура астроцитов была выделена путем механической и ферментативной диссоциации из биоптата мозга пациента, полученного в процессе нейрохирургической операции. Для выделения мРНК использовали около 2 млн. клеток. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью обратной транскриптазы M-MLV и 18-мерного олиго-дT праймера. Проверку получившегося кДНК проводили посредством ПЦР-амплификации убиквитарно экспрессируемого гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Фрагмент кДНК GFAP, содержащий белок-кодирующую область соответствующей мРНК был амплифицирован с применением ген-специфичных праймеров комплиментраных последовательности в начале рамки считывания и последовательности в области терминирующего трансляцию кодона.
Последовательность праймеров была определена с помощью программы Vector NTI Suite 9. Предполагаемая нуклеотидная последовательность кДНК GFAP человека была загружена из GenBank`a. Ампликон GFAP был очищен от примесей методом препаративного электрофореза в агарозном геле и выделен из геля с использованием силика-спин микроколонок. Очищенный препарат использовался в качестве матрицы в следующем раунде ПЦР. С целью последующего клонирования продукт реакции был реамплифицирован с использованием гнездных праймеров содержащих синтетические сайты распознавания для эндонуклеаз рестрикции (лат. NdeI и EcoRI. Амплификацию осуществляли в режиме горячего старта. Ампликон был выделен методом препаративного электрофореза, дважды экстрагирован смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 25:24:1, осажден, дважды промыт этанолом и высушен. Ампликон, как и вектор были обработаны эндонуклеазами рестрикции NdeI и EcoRI и дефосфорилированы щелочной фосфатазой. Продукты с интересующей массой были выделены препаративным электрофорезом и очищены на силика-спин колонках.
Лигирование осуществляли при помощи ДНК-лигазы бактериофага T4. После инкубации препарат использовали при электропорации суспензии компетентных клеток E. coli (штамм XL-1Blue). После часовой инкубации в среде SOC клетки были пересеяны на чашки с плотной средой LB, содержащих 50 мкг/мл канамицина. Отбор и анализ рекомбинантов на присутствие и правильную ориентацию вставки осуществляли методом ПЦР при помощи пары праймеров, комплиментарных последовательности кодирующей области GFAP и последовательности транскрипционного терминатора T7 вектора pET-28a. Колонии, давшие продукт ожидаемой молекулярной массы при электрофорезе были использованы для выделения плазмид.
Выделенные плазмиды подвергли рестрикционному анализу с применением эндонуклеаз рестрикции FaunDI и EcoRI. Образцы, содержащие вставки ожидаемого размера были отобраны для определения нуклеотидной последовательности с вектор-специфичными праймерами T7prom и T7term. Определение нуклеотидной последовательности осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI3100 Genetic Analyzer.
Для экспрессии рекомбинантного GFAP штамм E. coli (DE3 BL21) был трансформирован отобранной плазмидой «кальциевым» методом. Для анализа эффективности экспрессии трансформированный штамм культивировали на шейкере в селективной среде до достижения оптической плотности 0,4 при 600 нм. Затем культуру индуцировали добавлением ИПТГ и продолжали инкубацию, отбирая каждый час 1 мл суспензии. Бактерии осаждали центрифугированием и хранили на -20*С. Анализ эффективности экспрессии осуществляли методом аналитического диск-электрофореза. Об эффективности судили по увеличению размеров бэнда с ожидаемой молекулярной массой.
Препаративное выделение рекомбинантного GFAP. С этой целью штамм-продуцент наращивали в объеме 300,0 мл до оптической плотности 0,4-0,6 при 600 нм. После индукции ИПТГ продолжали культивирование еще 4 часа, затем бактерии осаждали центрифугированием (4000g), и замораживали при -20*С. После разморозки на льду осадок лизировали на шейкере денатурирующим буфером, содержащим хаотропный агент, в течении 30-45 минут при комнатной температуре. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием, лизат ресуспендировали с уравновешенным денатурируюшим буфером носителем Ni-NTA агарозой. Лизат с агарозой инкубировали на роторном шейкере 30-45 минут, вносили в колонку и собирали не связавшуюся фракцию. Носитель промывали денатурирующим буфером, проводили элюцию этим же буфером, закисленным до 4,5, после чего элюат защелачивали до pH=8.0 и проводили ступенчатый диализ с кратным уменьшением хоатропного агента. Выпавший в осадок белок собирали центрифугированием и использовали для иммунизации животных. Белок, оставшийся в растворе лиофилизировали, и использовали в качестве стандарт антигена при постановке ИФА.
Иммуноблот-анализ. Иммуноблот анализ проводили в соответствии со стандартными протоколами [H. Towbin и соавт. 1979 г.], разработанными либо для пероксидазного, либо хемолюминесцентного способа проявления с применением коммерческих препаратов анти-GFAP антител.
Иммунодиффузионный сравнительный анализ рекомбинантного и нативного препаратов GFAP. Иммунодиффузионный анализ проводили по методу Оухтерлони в модификации Храмковой и Абелева с коммерческим препаратом поликлональных антител к GFAP. Визуализацию полос преципитации осуществляли после окраски гелей кумасси R250.
Иммунизацию животных, получение гибридом и очистку антител проводили по стандартным методикам [ и др., 2000].
Твердофазный иммуноферментный анализ проводили по методу [A. Voller et al. 1976], в некоторой нашей модификации [ и др., 2008].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Клонирование и экспрессия GFAP в вектор pet28a и экспрессия в штамме DE3-BL21.
После выделения м-РНК из культуры астроцитов и постановки реакции ОТ-ПЦР полученная кДНК библиотека использовалась в качестве матрицы для постановки 2-х последовательных ПЦР: первая с ген-специфическими праймерами, вторая с праймерами, содержащими сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции NdeI и EcoRI. На рисунке 1 A и Б представлены фотографии агарозных гелей.
После лигирования очищенного ампликона GFAP в вектор pet28а, высева на селективную среду и появления колоний было отобрано 20 случайных колоний трансформантов, которые были проверены на наличие вставки при помощи пары праймеров gfap350-s и T7term. Все тестируемые колонии дали при амплификации продукт ожидаемой молекулярной массы (350 п. н.). Среди них случайным образом были отобраны 6 клонов для выделения плазмидной ДНК с целью последующего рестрикционного анализа и определения нуклеотидной последовательности вставок.
Для определения размера вставок плазмиды были подвергнуты расщеплению эндонуклеазами рестрикции FauNDI и EcoRI. Данные рестрикционного анализа приведены на рисунке 1-В.
Образцы, содержавшие вставки ожидаемого размера 1295bp (клоны pT7rGFAP-1 и pT7rGFAP-4), были отобраны для определения нуклеотидной последовательности с вектор-специфичными праймерами T7prom (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’) и T7term (см выше).
В результате анализа полученных нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей было обнаружено, что оба клона содержали некоторое количество мутаций. В частности, клон 4 содержал нонсенс-мутацию, приводящую к преждевременной терминации трансляции в положении K257 (нумерация от N-конца нативного GFAP), что не позволило использовать данный клон в дальнейшем. В то же время клон 1 содержал миссенс-мутацию, приводящую к замене H→Y в положении 219. Однако стереохимическое сходство этих аминокислот и отсутствие других мутаций позволило использовать данный белок для дальнейшей работы.
Рисунок 1. А-В: Электрофорез в агарозном 1% геле. Г – СДС-ПААГ электрофорез 7,5% гель. Дорожка λ - λ/HindIII – 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 пн. A - Амплификация фрагмента кДНК GFAP. Визуализируется ампликон GFAP с молекулярной массой 1334 п. н. Б - Второй раунд ПЦР с использованием «гнездных» праймеров. Нужный ПЦР продукт обозначен стрелочкой. В - Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид. Дорожки 2-7 плазмидные ДНК из рекомбинантных клонов. Стрелками отмечены вставки с ожидаемой молекулярной массой. Г - Электрофоретический анализ тотального белка из клона-продуцента GFAP после индукции IPTG. Дорожка 1 – маркеры молекулярных масс; дорожка 2 –неиндуцированная культура; дорожки 3-6 культура после 0.5, 1, 2 и 3 часов индукции соответственно.
При анализе эффективности экспрессии методом СДС-ПААГ электрофореза был выявлен факт активного накопления продукта в первые 4 часа после индукции. Дальнейшее инкубирование не приводило к увеличению выхода рекомбинантного GFAP (Рисунок 1-Г).
Сравнительный анализ рекомбинантного и нативного GFAP. Для подтверждения идентичности полученного рекомбинантного белка нативному антигену было проведено изучение некоторых физико-химических свойств белка, а именно определение молекулярной массы, изоэлектрической точки и определение критической концентрации агрегации. В таблице №1 представлены данные сравнительного анализа рекомбинантного и нативного антигенов (по результатам анализа тематических публикаций), а также результаты компьютерного прогнозирования, полученные с помощью программы Vector NTI v. 9.0. В таблице приведены данные кажущейся электрофоретической подвижности.
Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что рекомбинантный препарат GFAP обладает свойствами практически идентичными нативному белку.
Таблица №1. Физико-химические свойства рекомбинантного и нативного препаратов GFAP, а также данные Vector NTI. | |||
Характеристика для сравнения | Vector NTI | Нативный GFAP | Рекомбинантный GFAP |
Молекулярная масса, кДа | 49,504 | 47 - 51 | 49 |
Значение изоэлектрической точки | 5,85 | 5,7 – 5,9 | 5,8 |
Критическая концентрация для спонтанной агрегации, мкг/мл | - | 40 | 40 |
Анализ чистоты рекомбинантного GFAP проводили методом диск-электрофореза с последующей денсиметрией полиакриламидных гелей, окрашенных кумасси R-250.
Рисунок 2.
A - Результат ECL иммуноблотинга (дорожка 1) и аналитического СДС-ПААГ электрофореза (дорожка 2 - rec_hGFAP (49kDa, GelAnalysis, v. 1.0; СДС-ПААГ, 7,5% AA) рекомбинантного GFAP, дорожка 3 - белковые препараты с калиброванной молекулярной массой, кДа.
Б - Сравнительный иммунодиффузионный анализ препаратов нативного и recGFAP, в системе коммерческих и полученных нами анти-GFAP антисывороток. 1 - рекомбинантный препарат GFAP, 2 - нативный препарат GFAP, 3 - коммерческая антисыворотка анти-GFAP (Signet), 4 - сыворотка кролика, иммунизированного рекомбинантным GFAP.
Результаты диск-электрофоретического анализа представлены на рисунке 2-А.
Иммунохимическую идентичность рекомбинантного и нативного GFAP подтверждали методом иммунодиффузионного анализа по Оухтерлони в модификации и (рис. 2-Б). Непрерывная линия преципитации (отсутствие «шпор» и «перекрестов») свидетельствует о полной иммунохимической идентичности этих препаратов.
Получение моноклональных и поликлональных антител к рекомбинантному GFAP.
При иммунизации кроликов (порода Шиншилла) и мышей (BALB/C) препаратом рекомбинантного GFAP по классической схеме [ и соавт. 2001] были получены высокие титры анти GFAP антител как у кроликов, так и у мышей. Антитела принадлежали классу IgG. На рисунке 2-Б представлены результаты сравнительной иммунодиффузии полученных при иммунизации rec_GFAP поликлональных антител и коммерческих кроличьих поликлональных антител к GFAP. Непрерывная линия преципитации (отсутствие «шпор» и «перекрестов») свидетельствует о полной иммунохимической идентичности сравниваемых антител.
Для получения моноклональных антител было проведено слияние миеломных клеток линии SP2/0-Ag14 с клетками селезенки иммунизированных мышей по стандартному протоколу с использованием «PEG/DMSO Hybri-Max», («Sigma», USA). После культивирования на селективной среде, гибридные клетки переводили на ростовую среду (RPMI, 10FBS). Видимые клоны образовывались через 3-4 недели после слияния. Анализ специфичности и эффективности секреции антител к GFAP проводили методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа. Более 90% полученных в результате слияния клонов гибридом обладали способностью к синтезу анти-GFAP антител. Для получения конечного клона-продуцента было отобрано 5 наиболее активно синтезирующих клонов. Один из них был взят в работу для получения асцитов, содержащих моноклональные антитела.
Рисунок 3.
Иммуноцитохимический анализ GFAP в первичной культуре астроцитов (А, Б) и на срезах мозга крысы (В, Г) с помощью антител, полученных в результате иммунизации рекомбинантным GFAP. А - Первичные антитела – поликлональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab – BA2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. Б - Первичные антитела – моноклональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab – Ab – R6393 (Invitrogen), Rhodamine BA2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. В - Первичные антитела – моноклональные антитела, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab – BA2000 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML. Г - Первичные антитела – поликлональные антитела кролика, полученные при иммунизации рекомбинантным GFAP. Вторичные Ab – BA2005 (Vector labs), ABC kit. X400. Leica DML
В целях проверки специфичности и аффинности полученных поликлональных и моноклональных антител были проведены эксперименты по иммунохимическому проявлению GFAP на срезах ткани головного мозга крысы и в препаратах фиксированных первичных культур астроцитов человека.
На рисунке 3 представлены микрофотографии иммунопероксидазного и иммунофлуоресцентного проявления GFAP-позитивных внутриклеточных структур соответствующими препаратами анти анти-GFAP антител. Полученные антитела высокоспецифично связываются с GFAP, визуализируя промежуточные филаменты астроцитов, при этом уровень их афинности позволяет использовать повышенную концентрацию детергента при отмывке, тем самым значительно снижая интенсивность неспецифического связывания антител и улучшить качество иммунопроявления.
Разработка сэндвич-варианта иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного GFAP и полученных к нему антител.
Для разработки ИФА было получено соответственно 5 и 10 мг препаратов поли - и моноклональных антител. В качестве препарата стандарт-титра для построения калибровочной кривой использовали лиофилизированный неденатурированный препарат рекомбинантного GFAP в концентрации 10 мг\л.
Препараты моноклональных и поликлональных анти-GFAP антител разводили бикарбонатным буфером (0.1M NaHCO3, pH 9.2) до конечной концентрации 10 мг/л и использовали сразу после разведения.
В лунки 96-луночного планшета (Sarsdedt, 82.1581) вносили препарат моноклональных анти-GFAP антител в концентрации 10 мг/л (0.1M NaHCO3, pH 9.2) по 50 мкл в лунку и инкубировали во влажной камере не менее 12 часов при 4°С. Далее лунки трижды промывали промывочным буфером (100мМ PBS, 150мМ NaCl, 0.2% БСА, 0.05% Tвин 20) на автоматическом вошере ELX50 (Bio-Tek). С целью блокирования свободных сайтов связывания в лунки вносили по 100 мкл блокирующего буфера (100мМ PBS, pH 7.2, 1% БСА, 0.5% Tвин 20, 0.02% тимерозал) и инкубировали в течение 30 минут при 20°С. Затем лунки трижды промывали промывочным буфером, в случае необходимости жидкость аспирировали и хранили плашки при -80°С.
К 100 нг лиофилизированного GFAP добавляли 1 мл буфера для антигена (100мМ PBS, 150мМ NaCl) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. На следующем этапе, с использованием буфера для антигена, готовили серию разведений препарата GFAP от 100 до 0,75 нг/мл, вносили раствор GFAP по 150 мкл в лунку и инкубировали в течение 60 минут, при слабом покачивании, при 20°С. В 2 лунки вносили буфер без белка (контроль). В оставшиеся лунки вносили исследуемые образцы (плазма, ликвор) по 150 мкл в разведении 1:2 в буфере для антигена. После окончания инкубации лунки трижды промывали промывочным буфером.
На следующем этапе во все лунки планшета вносили по 100 мкл препарата поликлональных анти-GFAP антител кролика (10 мкг/мл) и инкубировали 30 минут при слабом покачивании, при 4°С. После окончания инкубации лунки трижды промывали промывочным буфером. Следующие стадии осуществляли в соответствие с протоколом производителя ABC Vector Labs Kit. Пероксидазную активность проявляли в течение 15 минут субстратным раствором, содержащим 0,3% H2O2 в субстратном буфере (0,04М C6H8O7, 0,27М NaHPO4х2H2O, pH 4,5) и 0,04% ОФД. Детекцию пероксидазной активности в лунках планшета осуществляли на фотометре ELx-800 Reader (Bio-Tek) при длине волны 450 нм.
|
Рисунок 4. Стандартная калибровочная кривая разработанной тест-системы для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека. |
Для определения точности и воспроизводимости калибровочной кривой иммуноферментного определения GFAP калибровали стандартный антиген, измеряя оптическую плотность при каждом варианте концентрации 6 раз. Анализ доверительного интервала и стандартного отклонения осуществляли в Excel (Microsoft). Для проведения калибровки по стандарту («тест возврата») использовали пробы сыворотки с заранее определенной концентрацией GFAP. Далее к двум пробам прибавляли заведомо известное количество GFAP в концентрации 1 нг/мл. Результат оценивали в виде отношения ожидаемого и полученного результата. Для теста на определение линейности прямых для разного разведения пробы, выполняли титровку пробы 0,3% H2O2 в субстратном буфере (0,04М C6H8O7, 0,27М NaHPO4х2H2O, pH 4,5) от 1:1 до 1:8. Результат оценивали в виде отношения ожидаемых и полученных значений.
Результаты, характеризующие разработанную тест-систему, представлены в таблице №2. Точность и воспроизводимость калибровочной кривой подтверждается результатами анализа доверительного интервала и коэффициента вариации, значение которого лишь при концентрации 32 нг/мл оказывается более 5%.
Результаты определения теста-возврата демонстрируют значимое (более 20%) отклонение от ожидаемого результата лишь в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении.
Полученные результаты позволяют характеризовать разработанную тест-систему как высокоспецифичную, воспроизводимую и стандартизованную.
На рисунке 4 приведена типичная калибровочная кривая, построенная с применением стандартного препарата рекомбинантного GFAP. Величина достоверности аппроксимации составляет 0,99, что позволяет адекватно оценивать концентрацию GFAP в заданном диапазоне.
Таблица №2: А) Точность и воспроизводимость калибровочной кривой иммуноферментного определения GFAP.
Б) Калибровка по стандарту («тест возврата») в иммуноферментном определении GFAP
В) Тест на определение параллельности калибровочных прямых при разведении антигена.
|
Результаты определения теста-возврата демонстрируют значимое (более 20%) отклонение от ожидаемого результата лишь в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении в случае 3-х кратного увеличения концентрации GFAP. Тест на определение параллельности кривых при разведении пробы приводит к значимым искажениям результата лишь при 8-ми кратном разведении.
Полученные результаты позволяют характеризовать разработанную тест-систему как высокоспецифичную, воспроизводимую и стандартизованную.
На рисунке 4 приведена типичная калибровочная кривая, построенная с применением стандартного препарата рекомбинантного GFAP. Величина достоверности аппроксимации составляет 0,99, что позволяет адекватно оценивать концентрацию GFAP в заданном диапазоне.
ОБСУЖДЕНИЕ
Открытие технологии рекомбинантных ДНК ознаменовало наступление новой эпохи, как для биохимии, так и для биологической науки в целом. Методы молекулярной биотехнологии практически упразднили громоздкие методики традиционной препаративной белковой химии. Благодаря динамично развивающимся системам для трансгенной экспрессии белков сегодня у исследователя есть целый арсенал инструментов для быстрого клонирования, экспрессии, выделения и очистки интересующего белка.
Основной целью данной работы являлось изучение адекватности применения рекомбинантных белков на примере GFAP для создания высокостандартизованных твердофазных иммуноферментных систем количественного анализа белков в биологических жидкостях, что широко распространено в современной клинической диагностике, а также в фундаментальных исследованиях.
Весьма важен вопрос выбора клеточных систем экспрессии того или иного белка, и в каждом случае он должен решаться индивидуально. Теоретически для разработки тест-систем с применением рекомбинантных антигенов целесообразно использование эукариотических систем экспрессии, так как посттрансляционная модификация приводит к образованию специфичных и высокоиммуногенных антигенных эпитопов. Рекомбинантный белок при эукариотической экспрессии имеет возможность для нативного образования вторичной и последующих структур и не агрегирует, образуя малорастворимые формы, что позволяет проводить выделение в нативных условиях.
Что же касается GFAP, то проведенные нами исследования не подтверждают факт существования в его структуре высокоиммуногенных антигенных детерминант, возникающих в процессе посттрансляционной модификации. Поэтому прокариотическая система белковой экспрессии является вполне адекватной, в целях получения рекомбинантного GFAP, для разработки иммуноферментной тест-системы.
Pекомбинантный препарат был охарактеризован физико-химическими и иммунохимическими методами. В качестве препарата сравнения был использован GFAP, выделенный из постмортального мозга человека, описанным ранее [ и соав. 1999] способом. Методами иммунодиффузии, ПААГ электрофореза и иммуноблотинга была продемострирована полная иммунохимическая идентичность рекомбинантного и нативного препаратов.
Кроме самостоятельной задачи - клонирования и выделения очищенного GFAP, в работе был изучена возможность применения рекомбинантного белка для получения высокоспецифичных препаратов поликлональных и моноклональных антител.
Результаты проведенных экспериментов позволяют утверждать, что иммунизация животных (кроликов и мышей) рекомбинантным GFAP человека приводит к возникновению адекватного иммунного ответа. При иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител более 90% клонов-гибридом оказались продуцентами анти-GFAP антител.
При изучении полученных поли - и моноклональных антител не было обнаружено перекрестной иммунореактивности, что зачастую случается при иммунизации нативным белком (вероятно, даже высокоочищенный белковый препарат содержит иммуногенно значимые количества примесных белков). В случае рекомбинантного GFAP высокоспецифичный способ металлохелатной хроматографии исключает возможность контаминации очищенного белка.
В экспериментах по сравнению антител, полученных при иммунизации рекомбинантным и нативным препаратами, не было найдено различий ни в специфичности, ни в аффинности сравниваемых иммуноглобулинов. При анализе соотношения классов иммуноглобулинов в данных антисыворотках принципиальных отличий также найдено не было.
При иммуноцитохимическом исследовании гистологических срезов и фиксированных культур клеток, поликлональные и моноклональные антитела позволяли высокоспецифично визуализировать активированные астроциты. При этом, неспецифический фон практически отсутствовал. Препарат поликлональных анти-GFAP антител в концентрации 1 мг/мл для иммуноцитохимических исследований применялся в разведении 1:10000, что является хорошим показателем, характеризующим их высокую аффиность и специфичность. Рекомендуемое разведение моноклональных анти-GFAP антител, для иммунохимического проявления составило 1:5000. Для иммуноблот анализа нативного и рекомбинантного GFAP максимальное разведение, при условии хемилюминесцентного проявления, составляет 1:50000 и 1:30000 соответственно.
Следующим шагом после проведенного изучения всех полученных компонентов системы было создание твердофазного количественного ИФА GFAP в биологических жидкостях человека. Одним из основных компонентов такой тест-системы является стандартный препарат антигена, различные разведения которого используются при построении калибровочной кривой.
Разработанный твердофазный сэндвич-вариант иммуноферментного анализа позволяет достоверно, точно и надежно определять концентрацию GFAP в сыворотке и ликворе человека. Рабочий диапазон для оптимального определения локализуется в интервале концентраций антигена от 1 до 32 нг/мл. Проверка тест-системы на параллелизм, проведенная с помощью кратных разведений рекомбинантного препарата GFAP, позволила получить кривые, практически параллельные стандартной.
В лабораторной практике существуют ИФА тест-системы для количественного определения GFAP [Blennow M. 1995; 1996; 2001; Rosengreen L. , Petzold A. 2004]. Однако все они разработаны на основе нативных антигенов, выделяемых из разнообразных биологических материалов: мозга быка, свиньи, человека. При этом методики выделения отличаются друг от друга, как и конечный продукт. К примеру, в одной тест-системе молекулярная масса стандарт-титра антигена, используемого для построения калибровочной прямой, равняется 45кДа, а в другой 58кДа. Несмотря на высокую межвидовую гомологию GFAP, было бы наивным полагать, что 1 нг GFAP человека, массой 45кДа, будет обладать такой же связывающей способностью, что и GFAP быка, массой 58кДа. Вот почему существующие тест-системы являются стандартизованными лишь в рамках одной партии, созданной по одной методике. Это осложняет процедуру экстраполяции результатов, полученных на разных тест-системах, и не позволяет проводить анализ накопленных данных, полученных разными исследователями.
Принципиальным отличием ИФА тест-системы, созданной на основе рекомбинантного препарата GFAP человека, является возможность стандартизовать все компоненты системы. Будучи единожды трансформирован, штамм-продуцент E. Coli синтезирует один и тот же белок, обладающий одинаковыми физико - и иммунохимическими характеристиками, что позволяет производить стандартные тест-системы неограниченно долго и, практически, в любых количествах.
Внедрение данной тест-системы в практическое здравоохранение позволит значительно расширить арсенал клинико-лабораторных методов диагностики, скрининга и мониторинга течения и эффективности проводимой терапии больных с заболеваниями нервной системы. С другой стороны, применение данных систем анализа резистентности ГЭБ открывает новые перспективы в изучении аутоиммунных аспектов патогенеза нервных и психических заболеваний.
ВЫВОДЫ
1. Клонирование ОТ-ПЦР-продукта, полученного на матрице полиаденилированной мРНК из культуры нормальных астроцитов, в вектор pET-28a позволило получить штамм E. coli, обладающий способностью к эффективной экспрессии рекомбинантного GFAP. Введение гексагистидинового мотива в состав рекомбинантного белка-слияния значительно упрощает выделение химически чистого GFAP, иммунохимически идентичного нативному белку.
2. Иммунизация рекомбинантным GFAP дает возможность получать моноклональные и поликлональные антитела с иммунохимическими свойствами идентичными антителам, получаемым иммунизацией нативным GFAP.
3. Полученные путем иммунизации рекомбинантным препаратом поликлональные и моноклональные антитела способны высокоспецифично распознавать и связываться с нативным GFAP в таких видах иммунохимического анализа как иммуноблот анализ, иммуноцито - и гистохимический анализ, твердофазный иммуноферментный анализ.
4. Разработанная тест-система твердофазного иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного антигена и антител, полученных при иммунизации антигеном, для количественного определения GFAP в биологических жидкостях человека является высокоспецифичной, легко воспроизводимой, стандартизованной системой и характеризуется порогом чувствительности 0,5нг/мл.
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. , , Клонирование и экспрессия кДНК GFAP в E. Coli // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, №1, стр.
2. , , Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы С6 // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007. – 2. – С.65-73
3. , , в монографии: Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам // Москва — Издательство «Медицина» 2007
4. V. P. Chekhonin, GM Yusubalieva V. P. Baklaushev, K. A. Pavlov, O. I. Gurina Immunohistochemical analysis of a model rat c6 glioma // Mat. of conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M. I. Vavilov, Kiev, 2007
5. K. Pavlov, O. Gurina, V. Chekhonin. Recombinant GFAP for antibody production. //Glial cells in health and disease. London. 4-8 September 2007.
6. , , Направленный транспорт моноклональных антител к GFAP и AMVB1 на экспериментальной модели глиомы С6 крысы // Материалы конференции с международным участием Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга, Санкт – Петербург, 2008
7. , , Разработка иммуноферментного анализа GFAP на основе рекомбинантного антигена. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008, №11, стр. 535-539
8. V. P. Baklaushev, K. A. Pavlov, V. P. Chekhonin; Monoclonal Antibodies in Diagnostics of High-Grade Gliomas // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2009, Vol. 3. No. 2, pp. 105-115
ФГУ «ГНЦССП Росздрава»
Подписано в печать 15.05.2009. Тираж 100 экз.
