Клинико-лабораторная характеристика микроспоридиоза и криптоспоридиоза у вич-инфицированных пациентов

На правах рукописи

СОКОЛОВА

Ольга Игоревна

Клинико-лабораторная характеристика микроспоридиоза и криптоспоридиоза

у ВИЧ-инфицированных пациентов

14.01.09 – инфекционные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Правительства Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор

Официальные оппоненты:

, доктор медицинских наук профессор

Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени » Министерства обороны Российской Федерации, начальник кафедры инфекционных болезней.

, доктор медицинских наук

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика » Министерства Здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой инфекционных болезней.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора».

Защита состоится 20 мая 2013 года в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д215.002.01 на базе Федерального государственного казенного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени " Министерства обороны Российской Федерации ( Санкт-Петербург, ).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке

Военно-медицинской академии имени

Автореферат разослан «____» _______________2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Пандемия ВИЧ-инфекции, охватившая планету, является одной из наиболее актуальных проблем современности. По Данным Всемирной Организации Здравоохранения на конец 2010 года в мире зарегистрировано 20104 миллиона ВИЧ-инфицированных. В регионе «Восточная Европа и Средняя Азия», к которому относится Россия, антиретровирусную терапию (АРВТ) получают 79430 человек, что составляет 21 – 29% от нуждающихся в АРВТ пациентов. Это один из самых низких показателей обеспеченности АРВТ в сравнении с другими регионами мира. Количество ВИЧ-инфицированных, погибающих от ВИЧ-ассоциированных заболеваний, возрастает. К самым распространенным СПИД-ассоциированным заболеваниям у взрослых и детей в странах нашего региона, не входящих в ЕС/ЕЭЗ, относятся туберкулез легких – 29%, туберкулез внелегочной локализации – 11% и синдром истощения, обусловленный ВИЧ-инфекцией – 13% [WHO; UNAIDS; UNICEF progress report, 2010, WHO; UNAIDS; UNICEF progress report, 2011].

Одной из причин синдрома истощения при ВИЧ-инфекции являются разнообразные микроорганизмы, поражающие желудочно-кишечный тракт. К ним относятся вирусные инфекции (цитомегаловирус, простой герпес, и аденовирусы), паразиты (криптоспоридии, Giardia и Isospora), грибы (Candida, Cryptococcus, Microsporidia, Histoplasma) и бактерии (Shigella, Salmonella, Listeria, микобактерии и спирохеты) [Huppmann, A. R., Orenstein, J. M., 2010]. Наиболее часто обнаруживаемые возбудители – цитомегаловирус, встречаемость 20,1%, Cryptosporidia – 19,6%, Microsporidia – 19,4% [Sharpstone, D., Gazzard, B., 1996], по другим данным цитомегаловирус, Candida, криптоспоридии и чуть реже микроспоридии [Huppmann, A. R., Orenstein, J. M., 2010].

Возникновение микроспоридиоза и криптоспоридиоза сопровождается развитием синдрома мальабсорбции, что приводит к длительным диареям и развитию синдрома истощения у ВИЧ-инфицированных пациентов [Kotler, D. P., Orenstein, J. M., 1998; Cama, V. et al., 2007].

В клиниках Российской Федерации диагностика микроспоридиоза не выполняется, а диагностика криптоспоридиоза осуществляется с использованием устаревших методик. Данных по распространенности, клинической картине, спектру возбудителей, эпидемиологическим характеристикам криптоспоридиоза в России крайне мало, а исследования, посвященные микроспоридиозу человека, ранее не проводились никогда.

Степень разработанности темы исследования. Микроспоридии человека и вызываемые ими оппортунистические инфекции у больных иммунодефицитом активно изучались европейскими и американскими учеными, I. Desportes, A. Cali, E. S. Didier, L. M. Weiss, D. M. Orenstein, C. Franzen и др. Микроспоридии человека в России не изучались. В то же время, в Санкт-Петербурге в Институте защиты растений (ВИЗР) активно работает научная группа под руководством известного паразитолога проф. , которая занимается проблемами биологии микроспоридий на паразито-хозяинных системах с участием насекомых. Особенности клинико-лабораторного течения и распространенность криптоспоридиозов человека освещены в работах Л. Ксяо., Р. Файера., В. Кама (США) и др. В России большую роль в изучении криптоспоридиозов человека сыграла проф. . Под ее руководством был отработан светооптический метод диагностики криптоспоридиоза у домашних животных и человека.

Настоящее исследование – попытка восполнить пробел в изучении микроспоридий и криптоспоридий человека в России, а также роли этих патогенов в развитии диарейного синдрому у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Цель исследования: изучить клинические проявления и лабораторные показатели при микроспоридиозе и криптоспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Задачи исследования:

1.  Определить частоту встречаемости и видовой состав представителей рода Cryptosporidium и типа Microsporidia, выявленных у ВИЧ-инфицированных пациентов в Санкт-Петербурге.

2.  Оценить клинические проявления и лабораторные показатели при микроспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

3.  Изучить клинические проявления и лабораторные показатели при криптоспоридиозе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

4.  Исследовать факторы риска развития микроспоридиоза и криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Научная новизна исследования.

Отработана и проведена клиническая диагностика микроспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов, определен видовой состав микроспоридий, описаны клинико-лабораторные особенности течения криптоспоридиоза и микроспоридиоза, а также проанализирована значимость этих инфекционных заболеваний в развитии диарейного синдрома и синдрома потери веса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

В частности, показано, что частота встречаемости микроспоридиоза и криптоспоридиоза в Санкт-Петербурге – соответственно 19% и 17,2%. Основные виды микроспоридиий, паразитирующих в кишечнике ВИЧ-инфицированных пациентов это Encephalitozoon intestinalis, Enc. cuniculi, Enterocytozoon bieneusi и Enc. hellem, а криптоспоридий – Cryptosporidium parvum и C. hominis. Микроспоридиальные инфекции вызывают диарею, осложненную синдромом мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов, что приводит к тяжелой (более 10%) потери веса и к развитию анемии. Микроспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с низким (менее 100 клеток/мл крови) количеством CD4(+) Т-лимфоцитов. Для криптоспоридиоза характерно развитие длительных (более 10 суток) диарей. Криптоспридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с количеством CD4(+) Т-лимфоцитов менее 200 клеток/мл крови. Развитие микроспоридиоза характерно для лиц без определенного места жительства и для лиц, злоупотребляющих алкоголем. Развитие криптоспоридиоза ассоциировано с употреблением внутривенных наркотических препаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные позволяют расширить представления об оппортунистических инфекциях, возникающих при СПИДе. Проведенные исследования позволили определить группы риска, предложить методы диагностики криптоспоридиоза и микроспоридиоза и сформулировать рекомендации для практического здравоохранения.

Пациентов с ВИЧ-инфекцией, сопровождающейся длительной диареей, необходимо обследовать на микроспоридиоз и криптоспоидиоз, т. к. показана достаточно частая встречаемось микроспоридий и криптоспоридий у данной группы пациентов и выявлена взаимосвязь наличия этих возбудителей с развитием синдрома мальабсорбции. Пациентам с микроспоридиозом и криптоспоридиозом необходимо назначать специальную терапию или начинать антиретровирусную терапию для повышения уровня CD4(+) Т-лимфоцитов, иррадикации возбудителей, предотвращения синдрома мальабсорбции и восстановления функции кишечника.

ВИЧ-инфицированным пациентам без определенного места жительства, а также, имеющим зависимость от алкоголя, которые наиболее подвержены заражению микроспоридиями, следует назначать обследование на микроспоридиоз и криптоспоридиоз в обязательном порядке.

Отработаны лабораторно-клинические методы диагностики изучаемых патогенов. В частности, показано, что для диагностики и определения видовой принадлежности микроспоридиий предпочтительнее использовать метод ПЦР.

Методология и методы исследования.

В исследовании использованы общенаучные и специальные эпидемиологические, клинические, и лабораторные методы, широко используемые в современных научных исследованиях. К ним относятся: стандартные методы сбора эпидемиологического анамнеза и объективного осмотра больных; микроскопические методы анализа мазков с помощью световой и флуоресцентной микроскопии; молекулярно-биологические методы, такие как выделение ДНК, ПЦР, гель-электрофорез; анализ сиквенсов. Достоверность всех полученных результатов оценивалась статистическими методами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.  Частота встречаемости микроспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 19%. Основными выявленными видами микроспоридий были Encephalitozoon intestinalis, Enc. cuniculi, Enterocytozoon bieneusi и Enc. hellem. Частота встречаемости криптоспоридиоза составила 17,2%. Основными возбудителями были Cryptosporidium parvum и Cryptosporidium hominis.

2.  Развитие микроспоридиоза характерно для лиц без определенного места жительства и для лиц, злоупотребляющих алкоголем. Развитие криптоспоридиоза ассоциировано с употреблением внутривенных наркотических препаратов.

3.  Микроспоридиальные инфекции вызывают диарею, осложненную синдромом мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов, что приводит к тяжелой (более 10%) потери веса и к развитию анемии. Микроспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с низким (менее 100 клеток/мл крови) количеством CD4(+) Т-лимфоцитов. Для криптоспоридиоза характерно развитие длительных (более 10 суток) диарей. Криптоспоридиоз чаще обнаруживается у ВИЧ-инфицированных пациентов с количеством CD4(+) Т-лимфоцитов менее 200 клеток/мл крови.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Достоверность полученных результатов обусловлена репрезентативностью (от фр. и достаточностью выборки пациентов, включенных в исследование, объемом проанализированного материала, адекватностью методов исследования. Методологические подходы, использованные в исследовании, корректны и современны. Лабораторные эксперименты осуществлялись на сертифицированном и проверенном оборудовании.

Основные положения и материалы диссертации были представлены в виде докладов на 5-м Европейском протистологическом конгрессе (V European Congress of Protistology and XI European Conference on Ciliate Biology), Санкт-Петербург, 2004 г.; на 12-м Международном симпозиуме по оппортунистическим протистам (IWOP-12), Нью-Йорк, 2012 г., на 7-й и 8-й Ассамблеях молодых ученых и специалистов СПбГУ. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, а также две в иностранных журналах.

Результаты исследований внедрены в практическую деятельность кафедры Инфекционных болезней, эпидемиологии и дерматовенерологии Медицинского факультета СПбГУ, СПб ГУЗ Клинической инфекционной больницы им. , включены в план тематических занятий со студентами, интернами, ординаторами и аспирантами Медицинского факультета СПбГУ.

Личное участие автора в получении результатов. Автором выполнялось клиническое обследование пациентов, отбор образцов, разработка «Индивидуальной карта пациента», микроскопический анализ образцов от всех пациентов, формирование базы данных и статистический анализ полученных результатов. Автор принимал участие в подготовке проб и разработке методик для молекулярно-биологической части диссертационной работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы, описание материалов и методов и результатов исследования, заключения, состоящего из обсуждения полученных результатов и выводов, списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, 28 таблицами и одним приложением. Список литературы содержит 145 источников, в том числе 7 отечественных и 138 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы.

Микроспоридиоз и криптоспоридиоз – оппортунистические инфекции у пациентов с выраженным иммунодефицитом [Didier, E. S., Weiss, L. M., 2006]. Зараженность микроспоридиозом больных СПИДом колеблется от 2 до 50% [Canning, E. U., Hollister, W. S., 1990]. Самый распространенный вид микроспоридий человека – Enterocytozoon bieneusi, далее следуют Encephalitozoon. intestinalis, Enc. cuniculi и Enc. hellem [Didier, E. S., Weiss, L. M., 2006, Endeshaw, T., et al., 2006]. Реже встерчаются другие виды микроспоридий. Частота встречаемости криптоспоридиоза составляет 5 – 20% [Cama, V. et al., 2007]. У человека паразитируют 2 вида криптсопоридий – C. parvum, передающийся к человеку от животных, и C. hominis, для которого характерен антропонозный механизм передачи [Cama, V. et al., 2007, Raccurt, C. et al., 2006, Muthusang, D. et al., 2010].

Возникновение этих заболеваний сопровождается поражением слизистой оболочки кишечника и развитием ряда патологических изменений, проявляющихся в снижении активности гликолитических ферментов: лактазы, α-глюкозидазы, а также в снижении абсорбции крахмала, d-ксилозы и некоторых моносахаров [Kotler, D. P., Orenstein, J. M., 1998, Schmidt, W., 1997]. В результате формируется синдром мальабсорбции и диарейный синдром, с длительностью более 4-х недель [Endeshaw, T. et al., 2006, Bern, C. et al., 2005], который приводит к выраженному снижению массы тела [Dascomb, K. et al., 1999]. Некоторые виды способны вызывать диссеминированные процессы [Didier, E. S., 1995, Dillingham, R. A., 2002].

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в клинической инфекционной больнице им. . Всего было обследовано 158 ВИЧ-инфицированных пациентов.

Для выявления микроспоридий и криптоспоридий изучались образцы стула, взятые у пациентов, находящихся в стационаре. В группу пациентов, обследуемых на микроспоридиоз, было включено 158 пациентов, а в группу обследуемых на криптоспоридиоз – 99 пациентов. Критерии включения: ВИЧ-инфицированные пациенты с диареей в возрасте от 20 до 50 лет. Критерии исключения: ВИЧ-инфицированне пациенты, получающие АРВТ, выявление шигеллеза и сальмонеллеза при бактериологическом исследовании.

Клиническое наблюдение за больными включало в себя сбор анамнеза заболевания и эпидемиологических данных, опрос пациента, анализ историй болезней пациентов, анализ температурной кривой во время нахождения в стационаре и оценка динамики веса пациентов за последние 2 года. Также изучались лабораторные показатели клинического анализа крови, данные микроскопического исследования кала, посевов кала на бактерии родов Shigella, Salmonella, условно-патогенную флору, грибы рода Candida. Иммунологические показатели снижения CD4-клеток оценивались однократно в ближайшие 2 недели до или после сбора кала на исследования.

Среди обследованных на микроспоридиоз было 107 мужчин и 51 женщина (67,7% и 32,3% соответственно). Средний возраст женщин составил 31,0 ± 8,27 лет, а мужчин – 32,3 ± 8,56 лет. Среднее количество CD4 (+) Т-лимфоцитов для всех пациентов составило 106,5 кл/мкл (P10=11, P90=543).

Среди обследованных на криптоспоридиоз, было 64 мужчины и 35 женщин (64,6% и 35,4% соответственно). Возраст женщин составил 30,0 ± 6,96 лет, а мужчин – 33,7 ± 9,24 лет. Среднее количество CD4(+) Т-лимфоцитов для всех пациентов составило 63,5 кл/мкл (P10=9, P90=450).

Для выявления микроспоридий и криптоспоридий от одного до трех последовательных образцов стула от одного пациента собирались в течение трех дней и хранились либо в 2,5% растворе K2Cr2O7 при температуре 4°C, либо замороженными при температуре -20°C. Всего было собрано 247 образцов от 158 пациентов.

Световая микроскопия. Для выявления микроспоридий стекла с нанесенными мазками стула фиксировали метанолом, окрашивали флуоресцентным красителем Калькофлором и/или Голубым Трихромом и просматривали под микроскопом Leica DM 2500. Для выявления криптоспоридий фиксированные мазки окрашивали карбол-фуксином (модификация окраски по Цилю-Нильсену) (Garcia et al., 1983) и просматривали в световом микроскопе при увеличении 1.000Х.

ПЦР-диагностика. Выделение ДНК из образцов кала для диагностики микроспоридиоза и криптоспоридиоза проводилось по методике Xiao, L. et al. (2002). Амплификация ДНК выполнялась методом вложенного ПЦР (nested PCR).

Сиквенирование продуктов ПЦР. Для видовой диагностики микроспоридиозов ампликоны нужного размера вырезали из 2% агарозного геля. ДНК извлекали из геля с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, Madison, WI, USA) согласно инструкции производителя. ПЦР для сиквенирования проводилась на амплификаторе системы Applied BioSystems BigDie Terminator (version 3.1); ПЦР-продукты анализировалась на сиквенаторе Beckman Coulter Seq 8000 DNA sequencer. Для сиквенирования использовали праймеры MSP-3, МСП-4A, и MSP-4B; каждый ампликон прочитывался в двух направлениях.

Для видовой диагностики криптоспоридиоза реакцию сиквенирования осуществляли при помощи набора реагентов DYEnamic ET dye terminator cycle sequencing kit (US81090, Applied Biosystems) с праймерами AL3532, AL3534 и промежуточным праймером AL3533: 5’-GAGATATATCTTGGTGCG-3’.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных (лат. фрагментов (ПДРФ). C целью установления вида криптоспоридий ДНК, амплифицированную с помощью ПЦР (SSU rRNA области геномной ДНК), подвергали рестрикционному анализу. Для рестрикции ПЦР продукта использовали две рестриктазы: SspI и VspI (Сибэнзим, Россия) (Таблица 1).

Для статистической обработки данных использовалась программа Statistica 6.0.

Таблица 1

Распределение длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР SSU области у представителей разных видов криптоспоридий

Вид возбудителя криптоспоридиоза	Фермент рестрикции	Длины получаемых при рестрикции фрагментов (количество пар оснований). *жирным выделены видимые в геле фрагменты
C. hominis	SspI	450, 267, 111, 12, 11
VspI	561, 115, 104, 71
C. parvum	SspI	450, 267, 108, 12, 11
VspI	629, 115, 104

Результаты и их обсуждение

Диагностика возбудителей. Световая микроскопия показала наличие спор микроспоридий в стуле у 17 пациентов после окраски мазков Калькофлором, и у 19 пациентов после окраски Трихромом. Метод ПЦР выявил наличие ДНК микроспоридии у 28 пациентов (Таблица 2).

Таблица 2

Количество пациентов, у которых были диагностированы микроспоридии различными методами

ПЦР	Оба красителя отр.	Калькофлор – положит.	Трихром - положит.	Оба красителя - положит.	Всего
ПЦР-отриц.	125	1	2	2	130
ПЦР-положит.	10	3	4	11	28
Всего	135	4	6	13	158

Инфицированными микроспоридиями мы считали пациентов, в образцах от которых возбудители были обнаружены при использовании ПЦР или обоих методов световой микроскопии. Таковыми оказались%) из 158 обследованных пациентов.

Сиквенирование продуктов ПЦР и сравнение полученных сиквенсов с имеющимися в базе данных Генбанка позволило идентифицировать большинство видов микроспоридий. Вид E. intestinalis был выявлен у 21 пациента (70%), E. cuniculi – у 3 человек (10%), E. hellem – у одного (3,33%), а E. bieneusi - у 2 (6,66%) пациентов. У одного пациента были обнаружены микроспоридии двух видов E. intestinalis и E. cuniculi (Таблица 3).

Таблица 3

Результаты обследования пациентов на микроспоридии методами световой микроскопии, ПЦР и сиквенирования

Вид возбудителя	№ пац	Номер образца, исследуемого различными методами1
1	2	3
PCR	LM	CAL	PCR	LM	CAL	PCR	LM	CAL
Enc. intestinalis	63	+	+	+	+	+	+	н/и2	+	+
69	+	+	+	+	-	-	+	-	-
70	+	-	-	+	-	-	-	+	-
71	+	-	-	-	-	-	н/с3
72	+	-	-	н/с
73	+	-	-	+	+	+	н/с
76	-	-	-	+	-	-	н/с
77	+	+	+	н/с
80	+	-	-	+	+	+	н/с
81	+	+	+	+	+	+	н/с
137	+	-	+	н/с
138	+	-	+	н/с
139	+	+	+	н/с
140	+	-	-	н/с
141	+	+	-	н/с
142	+	+	+	-	+	+
145	-	н/и	-	н/и	+	-	+
152	+	+	+	н/с
154	+	-	-	н/с
1564	+	-	+	-	+	+	н/с
158	+	-	-	н/с
Enc. cuniculi	str. I5	5	+	-	-	-	-	-	н/с
str. II5	124	+	-	-	н/с
1563	+	-	+	-	+	+	н/с
Enc. hellem	114	+	-	+	н/с
Microsporidium spp.	sp.16	16	+	-	-	н/с
sp.26	58	-	-	-	+	-	-
Ent. bieneusi	1	+	+	+	+	+	+	+	+	+
118	-	н/и	+	-	+	н/с
Неизвестный вид7	66	-	-	-	-	+	+	н/с
79	-	+	+	н/с

Примечания: 1 - PCR – полимеразная цепная реакция, LM – световая микроскопия мазков, окрашенных Трихромом, Cal – световая микроскопия мазков, окрашенных калькофлором; 2 – здесь и во всей таблице: н/и – образец не исследовался; 3 – здесь и во всей таблице: н/с – образец не собран; 4 – у пациента № 000 обнаружено 2 вида микроспоридий: E. intestinalis и E. cuniculi; 5 – обнаружено 2 штамма E. cuniculi: штамм 1 – str 1 и штамм 2 – str 2; 6 – два неизвестных вида отнесены к роду Microsporidium spp.; 7 – возбудители, обнаруженные только методами световой микроскопии, не определены до вида.

Кроме того, было выявлено два новых сиквенса, принадлежащих к неописанным ранее видам микроспоридий. Они показали низкую гомологию с сиквенсами микроспоридий, имеющимися в Генбанке и были предварительно помещены в сборный род Microsporidium до тех пор, пока эти виды не будут описаны морфологически и классифицированы (номера в Генбанке GQ 408913 и GQ 408914). Микроспоридии, обнаруженные только методами световой микроскопии у двух пациентов (6,66%), до вида не определены (Таблица 3).

При микроскопии мазков кала от 99 пациентов, окрашенных карбол-фуксином, ооцисты криптоспоридий были выявлены у,2%) пациентов. С помощью ПЦР наличие криптоспоридий хотя бы в одном образце от пациента было выявлено у,2%) пациентов. У 9 пациентов результаты ПЦР-диагностики и световой микроскопии совпали.

У 8 пациентов наличие криптоспоридий методами световой микроскопии не было подтверждено ПЦР. Таким образом, у,2%) из 99 пациентов криптоспоридиоз был выявлен хотя бы одним из используемых методов. Учитывая субъективность микроскопического анализа и возможность подтверждения наличия криптоспоридий в ПЦР-положительных образцах методом ПДРФ, только диагнозы, подтвержденные ПЦР, расценивались как положительные на криптоспоридиоз (Таблица 4).

Таблица 4

Количество пациентов, положительных при обследовании на криптоспоридии различными методами

ПЦР	СМ* - положит.	СМ-отрицат	Всего
ПЦР-отриц.	7	75	82
ПЦР-положит.	9	8	17
Всего	16	83	99

*- СМ – световая микроскопия

Таким образом, встречаемость криптоспоридиоза в нашем исследовании составила 17,2%: возбудители были обнаружены у 17 из 99 пациентов, включенных в анализ по криптоспоридиозу. При выполнении ПДРФ было обнаружено, что у 6 (35,3%) пациентов возбудитель криптоспоридиоза относится к виду Cryptosporidium hominis, а у,7%) — Cryptosporidium parvum (Таблица 5). При сиквенировании ПЦР-положительных образцов ДНК криптоспоридий была обнаружена во всех образцах, однако результаты видовой идентификации не во всех случаях совпали с результатами ПДРФ. Анализ такого несоответствия требует дополнительных исследований.

Возрастно-половой состав пациентов в зависимости от наличия микроспоридиоза или криптоспоридиоза. Среди 30 пациентов, инфицированных микроспоридиями, было%) женщин и%) мужчин в возрасте от 22 до 57 лет (32,6 ± 8,9 лет). В группе пациентов без микроспоридиоза было,5%) женщин и,5%) мужчин. Средний возраст пациентов без микроспоридиоза составил 31,7 ± 8,4 лет и колебался от 18 до 62 лет. Возрастной и половой состав группы пациентов с микроспоридиозом достоверно не отличался от возрастного и полового состава группы пациентов без микроспоридиоза (p=0,6 и р=0,4 соответственно).

Таблица 5

Результаты обследования пациентов на криптоспоридии методами световой микроскопии, ПЦР и ПДРФ.

№ пац.	Результат СМ	Результат ПЦР серии образцов кала	Результат ПДРФ
№1	№2	№3
145	+	+	+	+	C. parvum
115	-	+	+	+	C. parvum
95	+	+	+	-	C. parvum
96	+	-	+	+	C. parvum
80	-	+	-	-	C. hominis
81	+	+	-	-	C. hominis
92	+	+	-	-	C. hominis
159	+	+	+		C. parvum
165	-	+	+	н/д*	C. parvum
75	-	-	+	н/д	C. hominis
154	-	-	+	н/д	C. parvum
120	н/д	+	н/д	н/д	C. hominis
127	+	+	н/д	н/д	C. parvum
139	+	+	н/д	н/д	C. parvum
170	+	+	н/д	н/д	C. parvum
177	-	+	н/д	н/д	C. parvum
178	-	+	н/д	н/д	C. hominis

*н/д – исследование не выполнялось

Среди 17 пациентов с криптоспоридиозом было 4 (32,5%) женщины и,5%) мужчин. Средний возраст больных с криптоспоридиозом составил 33,5 ± 9,9 лет и колебался от 20 до 57 лет. Среди 82 пациентов без криптоспоридиоза были,8%) женщина и,2%) мужчина. Средний возраст пациентов без криптоспоридиоза составил 32,2 ± 8,4 лет и колебался от 18 до 62 лет. Возрастной и половой состав группы пациентов с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза достоверно не различались (p=0,6 и р=0,3 соответственно).

Уровни CD4+ Т-лимфоцитов у пациентов в зависимости от наличия микроспоридиоза или криптоспоридиоза. Уровень CD4+ Т-лимфоцитов у пациентов с микроспоридиозом колебался от 4 до 647 кл/мкл и составил, в среднем, 62 кл/мкл (P10=12, P90=553). Он достоверно не отличался (p=0,2) от уровня CD4+ Т-лимфоцитов у пациентов без микроспоридиоза, у которых он колебался от 0 до 1061 кл/мкл и, в среднем, составил 140 кл/мкл (P10=8, P90=543). С помощью точного теста Фишера, было показано, что среди пациентов с микроспоридиозом количество больных с уровнем CD4+ Т-лимфоцитов <100 кл/мкл был достоверно выше, чем среди пациентов без микроспоридиоза (pдвухсторонний=0,02).

У пациентов с криптоспоридиозом уровень CD4 (+) Т-лимфоцитов колебался от 7 до 647 кл/мкл и составил, в среднем, 50кл/мкл (P10=9, P90=196). Он был достоверно ниже (p<0,05), чем у пациентов без криптоспоридиоза, у которых уровень CD4 (+) Т-лимфоцитов колебался от 0 до 636 кл/мкл и, в среднем, составил 74 кл/мкл (P10=11, P90=450).

Встречаемость патогенных и условно-патогенных инфекций желудочно-кишечного тракта у пациентов с микроспоридиозом и криптоспоридиозом. Среди пациентов с микроспоридиозом 12 человек (57,2%) переносили разнообразные инфекции ЖКТ. Из них у 3 (10%) были выявлены облигатно патогенные возбудители (р. Shigella, р. Salmonella). Среди пациентов без микроспоридиоза инфекции ЖКТ были выявлены у 51 человека (52%), у%) из них были обнаружены облигатно патогенные возбудители.

Среди исследованных на криптоспоридиоз, семь (77,8%) пациентов с криптоспоридиозом и,5%) без криптоспоридиоза переносили патогенные и условно-патогенные инфекции ЖКТ. Облигатно патогенные возбудители были выявлены у 2 (10,5%) пациентов с криптоспоридиозом и у,3%) пациентов без криптоспоридиоза. Достоверных различий в частоте встречаемости сопутствующих инфекций ЖКТ между пациентами с микроспоридиозом и без микроспоридиозоа, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза выявлено не было (p=0,7 и p=1,0 соответственно).

Пациенты, переносившие сальмонеллез и дизентерию, были выведены из дальнейшего анализа. Учитывая равномерное распределение инфекций ЖКТ, вызываемых условно-патогенной флорой, среди разных групп пациентов (с микроспоридиозои и без микроспоридиоза, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза), было решено, что эти инфекции ЖКТ не могли значимо повлиять на результаты исследования. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что наличие патогенных и условно-патогенных возбудителей не влияло на частоту встречаемости микроспоридиоза и криптоспоридиоза у исследованных больных.

Влияние микроспоридиоза и криптоспоридиоза на показатели микроскопического исследования кала. При исследовании копрограмм было показано, что наличие микроспоридиальной инфекциии достоверно чаще провоцировало развитие диарейного синдрома с возникновением мальдигестии и мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов. Консистенция стула при микроспоридиозе могла быть как кашицеобразной, так и жидкой. Микроспоридиальная инфекция не приводила к увеличению количества эритроцитов, лейкоцитов и слизе в стуле, т. е. к развитию колитического синдрома (Таблица 6).

Криптоспоридиоз не оказывал существенного влияния на показатели копрограмм.

Клинические проявления микроспоридиоза и криптоспоридиоза. Оценка клинических данных показала, что длительность диарейного синдрома у пациентов с исследуемыми инфекциями была достоверно выше, чем у пациентов без этих инфекций, и составляла более 10 суток (11 (Р10=0, Р90=24) при микроспоридиозе и 17,5 суток (Р10=0, Р90=112) при криптоспоридиозе). При этом заражение микроспоридиями, как и криптоспоридиями не увеличивало частоту жалоб на диарею. У пациентов с микроспоридиальной инфекцией частота стула была в среднем 5 раз в день, с криптоспоридиальной - 4. Частота стула достоверно не отличалась от таковой у пациентов без исследуемых инфекций (Таблицы 7 и 8).

Таблица 6

Распределение различных изменений в копрограммах у пациентов с микроспоридиозом и без микроспоридиоза

Признак	Признак выявлен Кол-во пациентов (%)	Признак не выявлен Кол-во пациентов (%)	Всего пациентов (%)	P
Микро +1	Микро –2	Микро +	Микро–
Неоформленный стул	19 (17,1)	73 (65,8)	0	19 (17,1)		0,04
Нарушения всасывания б, ж, у	19 (17,1)	69 (62,2)	0	23 (20,7)		0,02
Нарушения всасывания б	6 (5,3)	31(28)	13 (11,7)	61 (55,0)		1,0
Нарушения всасывания ж	7 (6,3)	24 (21,6)	12 (10,8)	68 (61,3)		0,4
Нарушения всасывания у	18 (16,2)	66 (59,5)	1 (0,9)	26 (23,4)		0,04

1 - Микро +, пациенты с микроспоидиозом; 2 - Микро –, пациенты без микроспоридиоза; б, ж, у – белки, жиры, углеводы

Никаких различий в возникновении жалоб на боли в животе, тошноту, рвоту, газообразование у пациентов с микроспоридиозом и без микроспоридиоза, с криптоспоридиозом и без криптоспоридиоза выявлено не было. У пациентов с микроспоридиозом достоверно чаще регистрировалась тяжелая (более 10%) потеря массы тела.

Таблица 7

Частота возникновения различных симптомов у пациентов в зависимости от наличия микроспоридиоза

Симптом	Симптом выявлен Кол-во пациентов (%)	Симптом не выявлен Кол-во пациентов (%)	Всего пациентов (%)	P
Микро +1	Микро –2	Микро +	Микро –
Диарея >10 дней	12 (10,9)	20 (18,2)	8(7,3)	70(63,6)		0,002
Диарея ≤ 10 дней	8 (7,3)	70 (63,6)	12(10,9)	20(18,2)
Лихорадка (t тела ≥ 37,3°C)	24 (15,5)	99 (63,9)	5(3,2)	27(17,4)		0,52
Снижение массы тела	26 (16,8)	63 (40,7)	3(1,9)	63(40,6)		0,0001
Снижение массы тела	<10%	7 (7,9)	32 (34,8)	19 (21,3)	31(36,0)	89 (100)	0,043
>10%	19 (21,3)	31 (36,0)	7 (7,9)	32(34,8)	89 (100)	0,043

1 - Микро +, пациенты с микроспоидиозом; 2 - Микро –, пациенты без микроспоридиоза;

Особенности показателей клинического анализа крови у пациентов с микроспоридиозом и криптоспоридиозом. Было показано, что у пациентов с микроспоридиозом, по сравнению с больными без этой инфекции, достоверно чаще встречались: снижение уровня гемоглобина – 108 ± 25,5 г/л (p=0,023), снижение уровня эритроцитов – 3,4 ± 0,7·109 кл/мкл (p=0,02), и повышение уровня СОЭ – 50 мм/ч (p=0,004). Последний показатель характеризовался как повышением среднего уровня, так и большей частотой высоких (СОЭ>20 мм/ч) значений. При криптоспоридиозе уровень лейкоцитов был заметно ниже – 5,7 ± 3,79·109 кл/мкл, чем у пациентов без криптоспоридиоза – 7,2 ± 4,31·109 кл/мкл, однако данные оказались недостоверными (p=0,2). Других тенденций относительно влияния криптоспоридиоза на показатели гемограмм замечено не было.

Таблица 8

Частота возникновения различных симптомов у пациентов в зависимости от наличия криптоспоридиоза.

Симптом	Симптом выявлен Кол-во пациентов (%)	Симптом не выявлен Кол-во пациентов (%)	Всего пациентов (%)	P
Крипто +1	Крипто –2	Крипто +	Крипто –
Диарея >10 дней	7(11,3)	18 (29)	1(1,6)	36(58,1)	62 (100)	0,006
Диарея ≤ 10 дней	1 (1,6)	36 (58,1)	7(11,3)	18(29)	62 (100)
Лихорадка (t тела >37,3°C)	15(15,3)	68 (69,4)	2 (2)	13 (13,3)	98 (100)	1,0
Снижение массы тела	13 (13,1)	56 (56,6)	4 (4)	26 (26,3)	98 (100)	0,6
Снижение массы тела	<10%	8 (11,6)	19 (27,5)	5 (7,2)	37(53,6)	69 (100)	0,1
>10%	5 (7,2)	37 (53,6)	8 (11,6)	19(27,5)	69 (100)

1-Крипто +, пациенты с криптоспоридиозом; 2-Крипто –, пациенты без криптоспоридиоза

Особенности эпидемиологического анамнеза пациентов с микроспоридиоозом и криптоспоридиозом. Для выявления возможных факторов риска развития микроспоридиоза были проанализированы следующие данные анамнеза жизни: условия жизни (отдельная / коммунальная квартира, лицо БОМЖ); употребление инъекционных наркотиков; гомосексуальные половые контаткы; беспорядочная половая жизнь; злоупотребление алкоголем; место проживания (иногородний/ житель Санкт-Петербурга); наличие домашних животных. Было показано, что злоупотребление алкоголем встречалось в группе пациентов с микроспоридиозом достоверно чаще, чем у пациентов без микроспоридиоза (p=0,02). Также значимо влиял на наличие микроспоридиоза фактор «Лицо БОМЖ» (p= 0,04). В группе пациентов с криптоспоридиозом достоверно чаще встречался фактор «употребление инъекционных наркотиков» (p=0,05).

Заключение

В Санкт-Петербурге уровень зараженности микроспоридиозом и криптоспоридиозом сопоставим с уровнем данных заболеваний в развивающихся странах или уровню заболеваемости в эпоху до широкого распространения АРВТ. Более частое выявление вида Enc. intestinalis, с зоонозным механизмом передачи, по сравнению с Ent. beineusi, а также выявленный в нашем исследовании штамм 2 Enc. сuniculi, ранее выделявшийся только у животных, главным образом, грызунов, могут свидетельствовать о том, что в Санкт-Петербурге микроспоридиоз является зоонозой инфекцией. Возможно, преобладание Enc. intestinalis в наших образцах и наличие «крысиного» штамма Enc. cuniculi отражает неблагополучные санитарно-эпидемиологические условия, что косвенно подтверждается данными о широкой распространенности острых кишечных инфекций в Санкт-Петербурге [ и др., 2010]. Более частое выявление C. parvum (64,7%), по сравнению с C. hominis (35,3%), подтверждает идею о зоонозном распространении исследуемых инфекций.

Обнаружение генотипов двух потенциально новых видов микроспоридий (номера в Генбанке CG408911 и CG408912), возможно, расширяет круг известных патогенов человека.

Большинство пациентов с микроспоридиозом (69%) и криптоспоридиозом (76,5%) находились на продвинутых стадиях ВИЧ-инфекции с выраженной иммуносуппрессией, количеством CD4(+) T-лимфоцитов менее 100 кл/мкл. Однако неожиданным оказалось, что 5 (17,2%) больных с микроспоридиозом имели уровень CD4(+) T-лимфоцитов более 400 кл/мкл. Выявленные изменения показателей копрограмм, такие как изменение консистенции стула и наличие признаков нарушения всасывания в тонком кишечнике, в первую очередь, углеводов, говорят о вероятной роли микроспоридий в возникновении диарей у ВИЧ-инфицированных пациентов. Длительность диареи при микроспоридиозе в нашем исследовании была несколько ниже, чем описывается в литературе, и составила в среднем 11 дней. Снижение массы тела было выявлено у большинства пациентов с микроспоридиозом (89%): у 73% пациентов вес снизился более чем на 10%, что соответствует данным литературы [Endeshaw, T. et al., 2006].

Выводы

1.  Частота встречаемости микроспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 19% (30 из 158). Были выявлены 4 известных вида: Encephalitozoon intestinalis – у 21 пациента (70%), Enc. cuniculi – у 3 (10%), Enterocytozoon bieneusi – у 2 (6,66%), Enс. hellem – у одного (3,33%) пациента; и два неописанных ранее генотипа микроспоридий (Microsporidium 1 и Microsporidium 2).

2.  Частота встречаемости криптоспоридиоза в Санкт-Петербурге среди ВИЧ-инфицированных пациентов составила 17,2%, (17 из 99). Cryptosporidium parvum был выявлен у,7%) пациентов и Cryptosporidium hominis − у 6 (35,3%) пациентов.

3.  Микроспоридиальная инфекция у ВИЧ-инфицированных протекала с развитием длительной диареи с возникновением синдрома мальабсорбции, с преимущественным нарушением всасывания углеводов. Длительность диареи в среднем составляла 11 суток и приводила к тяжелой (более 10%) потере веса. Микроспоридиоз достоверно чаще выявлялся у ВИЧ-инфицированных пациентов с количеством CD4(+) клеток менее 100 кл/мкл. Микроспоридиоз приводил к снижению уровня гемоглобина и эритроцитов и сопровождался повышением уровня СОЭ>20 мм/ч.

4.  Клиническим симптомом криптоспоридиальной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов является развитие диарейного синдрома, длящего, в среднем, 17,5 суток. Криптоспоридиоз чаще наблюдался у пациентов с низким (50 кл/мкл) уровнем CD4 (+).

5.  Микроспоридиоз чаще диагносцировался у людей, злоупотребляющих алкоголем и у лиц «БОМЖ», а криптоспоридиоз - у лиц, употребляющих внутривенные наркотики.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1.  Для лабораторной диагностики микроспоридиоза целесообразно использовать молекулярно-биологические методы исследования (ПЦР) с расширенным набором праймеров для диагностики видов возбудителей. Для повышения эффективности диагностики криптоспоридиоза помимо обследования методом световой микроскопии образцов стула, окрашенных по Цилю-Нильсену, следует проводить ПЦР.

2.  Для исследования на криптоспоридиоз образцы следует хранить в 2,5% растворе K2Cr2O7, при температуре 4°C. Образцы, предназначенные для исследования на микроспоридиоз, могут храниться либо в K2Cr2O7, либо замороженными при температуре -20°C.

3.  В группу риска по микроспоридиозу у ВИЧ-инфицированных пациентов следует включать следующие показатели: снижение CD4 (+) лимфоцитов менее 100 кл/мкл; длительность диареи более 10 дней; снижение массы тела более 10%; сочетание анемии и длительной диареи; наличие в анамнезе злоупотребления алкоголем и/или фактора «лицо без определенного места жительства».

4.  Обследование на криптоспоридиоз следует проводить ВИЧ-инфицированным пациентам с уровнем CD4 T-лимфоцитов менее 200 кл/мкл и длительной, более 10 дней, диареей, особенно пациентам, употребляющим внутривенные наркотики.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Перспективным направлением развития темы «Клинико-лабораторная характеристика микроспоридиоза и криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных пациентов» является расширение исследуемой группы пациентов для изучения географического распространения патогенов, и более полного статистического анализа возможных путей передачи возбудителей, а также тестирование на микроспоридиоз других биологических жидкостей для исследования путей диссеминации микроспоридиоза. Другим направлением развития темы может стать изучение эффективности этиотропной терапии изученных заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  Соколова, случай обнаружения спор микроспоридий у ВИЧ-инфицированного пациента в России / , , и др. – Альманах «Инфекционные болезни – 2003» под ред. , , . – СПб.: НИИХ СПбГУ, 2004. – С. 210-214.

2.  Demyanov, A. V. Occurrence of Microsporidia and Cryptosporidia in stool samples from HIV positive patients with chronic diarrhea in The City Hospital for Infectious Diseases St. Petersburg, Russia / A. V. Demyanov, O. I Sokolova, V. A. Cama, A. A. Yakovlev et al. // Protistology. – №5(1). – Р.21.

3.  Соколова, микроспоридиальных инфекций человека. Первое исследование распространения кишечных микроспоридиозов среди ВИЧ - инфицированных пациентов в России / , // «Медицина ХХI век». – 2009. – Т. 3. – С. 23-35.

4.  Соколова, использования технологий FTA для сбора, архивирования и молекулярного анализа ДНК микроспоридий из клинических образцов / , , и др. // Цитология. – 2011. - №53(11). – С. 911-914.

5.  Соколова, у ВИЧ-инфицированных пациентов / , , и др. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2011. - № 3(3). - С. 63-70.

6.  Kucerova, Z. Microsporidiosis and Cryptosporidiosis in HIV/AIDS Patients in St. Petersburg, Russia: Serological identification of microsporidia and Cryptosporidium parvum in sera samples from HIV/AIDS patients / Z. Kucerova, O. I. Sokolova, A. V. Demyanov, M. Kvac et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 2011. – №27(1). – P.13-15.

7.  Sokolova, O. I. Emerging microsporidian infections in Russian HIV-infected patients / O. I. Sokolova, A. V. Demyanov, L. C. Bowers, E. S. Didier et al // J. Clin. Microbiol. – 2011. – №49(6). – P. .

8.  Соколова, у ВИЧ-инфицированных пациентов: диагностика и клинико-лабораторная характеристика / , , и др. // Журнал инфектологии. – 2012. – №4(2). – С. 26-32.

9.  Sokolova, O. I. Microsporidia and Cryptosporidia in HIV-infected patients in St. Petersburg, Russia. / Sokolova O. I., Demyanov A. V., Dedov V. A., Didier E. S. et al. // Proceedings from 12th International workshops on opportunistic protists (Tarrytown, New York). – 2012. – P.31-32.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АРВТ – антиретровирусная терапия,

ВИЧ – вирус иммунодефицита человека,

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота,

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт,

ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных франментов,

ПЦР – полимеразная цепная реакция,

рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота,

СМ – световая микроскопия,

СОЭ – скорость оседания эритроцитов,

СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита.