Введение

ВВЕДЕНИЕ

Настоящий лабораторный практикум предусматривает выполнение студентами трех лабораторных работ по дисциплине «Технологии ферментных препаратов», шифр 500 ДС.03 согласно специализации 260204 «Технология бродильных производств и виноделие».

Объем первой и второй работы – по 6 академических часов, третьей – 5 часов.

Обычно в бродильных производствах применяются не чистые ферменты, а неочищенный солод или ферментные препараты, включающие целый комплекс ферментов. Целью данного лабораторного практикума является определение амилолитической, осахаривающей и протеолитической активности ферментов солода и ферментных препаратов, полученных с помощью микроорганизмов поверхностным или глубинным способом.

Первая лабораторная работа заключается в определении амилолитической активности ферментов солода или ферментных препаратов микробного происхождения соответственно. Вторая лабораторная работа заключается в определении осахаривающей активности, третья – протеолитической активности ферментов солода и ферментных препаратов, полученных с помощью микроорганизмов поверхностным или глубинным способом.

Работы, выполняемые студентами в рамках настоящего практикума, служат закреплению теоретических знаний по дисциплине «Технологии ферментных препаратов».

Кроме того, методики, изложенные в данном лабораторном практикуме, могут быть использованы при выполнении НИП, курсовых и дипломных работ студентами всех форм обучения, обучающимися по специальностям 260204 – «Технология бродильных производств и виноделие», 240901 – «Биотехнология».

1 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

1.1 Определение амилолитической активности ферментов

солода

1.1.1 Сущность метода

Для точного определения активности ферментов необходимо строго соблюдать определенные условия проведения реакции, катализируемой ферментом (температура, рН среды, длительность реакции, концентрация субстрата и способы его приготовления, способы приготовления ферментного раствора).

На скорость ферментативной реакции большое влияние оказывает соотношение фермент-субстрат. Поэтому активность ферментов следует определять при строго постоянном соотношении фермента и субстрата, которое обеспечивает определенную степень гидролиза субстрата.

Активность ферментов находят с помощью графика, выражающего зависимость степени гидролиза субстрата от числа единиц активности фермента, взятого для реакции; на оси абсцисс этого графика откладывают количество взятого для анализа солода (или ферментного препарата), а на оси ординат – степень гидролиза субстрата. В большинстве случаев эта зависимость выражается прямой линией в пределах гидролиза от 15 до 75 %. Прямолинейный участок графика дает возможность по количеству субстрата, превращенного в процессе реакции, определять активность препарата. Для удобства расчета прямая графика может быть представлена в виде уравнения.

Амилолитическая активность (АС) характеризует способность ферментов солода катализировать расщепление крахмала в основном на декстрины с небольшим количеством олигосахаридов. Эта активность главным образом обусловлена присутствием a-амилазы.

В основу определения амилолитической активности положена зависимость степени гидролиза крахмала от числа единиц фермента, взятого для проведения ферментативной реакции.

Для определения амилолитической способности крахмал гидролизуют вытяжкой исследуемого солода и определяют количество оставшегося негидролизованного крахмала после действия ферментов по йодкрахмальной реакции с использованием фотоэлектроколориметра.

При фотоколориметрическом методе определения за единицу амилолитической способности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз крахмала при следующих условиях:

– температура реакции 30 °С;

– рН раствора 4,8…4,9;

– продолжительность реакции 10 мин;

– объем 15 мл (10 мл субстрата и 5 мл ферментного раствора);

– постоянное соотношение в реакционной смеси фермент-субст-рат, обеспечивающее гидролиз крахмала на 30 % за 10 мин.

1.1.2 Реактивы

– 1 %-ный забуференный раствор крахмала (картофельного) – навеску растворимого крахмала берут из такого расчета, чтобы в 100 мл раствора содержался 1 г сухого крахмала. Например, если влажность крахмала 13 %, то навеска крахмала в граммах для 100 мл 1 %-ного раствора должна составить

. (1)

Взвешенную на технических весах навеску крахмала без потерь переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды и перемешивают, затем добавляют еще 25 мл воды и помещают колбу в кипящую водяную баню, выдерживая ее до полного растворения крахмала и непрерывно помешивая раствор. Содержимое колбы охлаждают до 20 °С, добавляют 10 мл буферного раствора
(рН 4,8…4,9), доводят водой до метки и перемешивают;

– буферный раствор (рН 4,8…4,9);

– 0,1 н раствор соляной кислоты;

– основной раствор йода – в тарированном стаканчике с притертой крышкой отвешивают 0,5 г йода и 5,0 г йодированного калия и добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают до полного растворения йода. Раствор переливают в мерную колбу с притертой крышкой на 200 мл, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в темном месте и используют в течение 30 дней;

– рабочий раствор йода – 2 мл основного раствора разбавляют в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой до метки. Перед употреблением необходимо проверить оптическую плотность рабочего раствора йода на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной грани 1,0 см при светофильтре с длиной волны l=453 нм.

Оптическая плотность раствора йода должна быть равна 0,160 ± 0,01. В случае отклонения оптической плотности раствора от этой величины ее приводят к необходимой добавлением нескольких капель воды или основного раствора йода;

– солодовая вытяжка – взвешивают на технических весах две навески измельченного солода – одну для определения влажности и вторую для определения АС. Величина навески просяного солода 10 г, ячменного, овсяного и ржаного 5 г. Навеску количественно переносят в химический стакан или коническую колбу на 200…250 мл, добавляют 10 мл буферного раствора (рН 4,7…4,9) и 90 мл дистиллированной
воды.

Полученную смесь выдерживают в течение 60 мин при 30 °С, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения АС. Для проведения ферментативной реакции готовят рабочий раствор, пользуясь данными таблицы 1.

Таблица 1 – Приготовление рабочих ферментных растворов солода

Ожидаемая активность солода, ед. АС	Масса солода в 5 мл рабочего раствора, мг	Расход основного раствора на приготовление рабочего раствора, мл/100 мл
Для просяного солода
5…10	30	6
11…15	20	4
16…20	10	2
Для ячменного, овсяного, ржаного солода
16…20	20	8
21…30	10	4
31…50	7,5	3

1.1.3 Проведение анализа

Осахаривание крахмала ведут в строго определенных условиях:

– температура 30 °С;

– рН среды 4,8…4,9;

– продолжительность реакции 10 мин;

– объем раствора 15 мл (10 мл раствора крахмала  + 5 мл рабочего раствора ферментов солода).

Для анализа берут две пробирки (18´180 мл), наливают в каждую по 10 мл приготовленного раствора крахмала, ставят в ультратермостат или водяную баню с температурой 30 °С ± 0,5 °С и выдерживают в
течение 10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 мл дистиллированной воды (контрольный раствор), а во вторую – 5 мл солодовой вытяжки (опытный раствор). Смеси быстро перемешивают и выдерживают точно 10 мин при той же температуре.

После этого пробирки с реакционной смесью вынимают из термостата, отбирают из каждой по 1 мл и переносят в другие пробирки с предварительно налитыми туда 10 мл 0,1 н соляной кислотой, которая прерывает действие ферментов. Жидкости взбалтывают, от каждой пробы отбирают по 1 мл, переносят в новые пробирки, в которые предварительно налито по 10 мл рабочего раствора йода, и содержимое пробирок перемешивают.

Контрольный раствор окрашивается в синий цвет, опытный – в фиолетово-коричневый различной интенсивности, в зависимости от количества гидролизованного крахмала. Далее определяют оптическую плотность полученных растворов в кюветах с длиной грани 1,0 см при красном светофильтре с длиной волны l=656 нм или близкой к этой величине. Колориметрирование проводят по сравнению с дистиллированной водой.

Оптическая плотность контрольного раствора соответствует количеству исходного крахмала субстрата во взятом растворе, а оптическая плотность опытного раствора – количеству крахмала, оставшемуся негидролизованным после действия ферментов. Этот крахмал надо понимать условно, так как фактически в растворе крахмала нет, он превратился в декстрины различной молекулярной массы, которые и дают фиолетово-коричневую окраску. Разность между оптической плотностью контрольного и опытного растворов соответствует количеству крахмала, которое подверглось гидролизу под действием ферментов солода.

Количество гидролизованного крахмала (в г) рассчитывают по формуле

, (2)

где – оптическая плотность контрольного раствора;

– оптическая плотность опытного раствора;

0,1 – количество крахмала, взятое для определения в качестве субстрата, г.

Если окажется, что количество гидролизованного крахмала больше 0,07 или меньше 0,02, то анализ повторяют, изменив разбавление рабочего раствора солодовой вытяжки.

Амилолитическую способность (ед./г) рассчитывают по фор-
муле

, (3)

где Сг. кр – количество гидролизованного крахмала субстрата, г;

n – масса солода, содержащаяся в 5 мл раствора, взятого для осахаривания крахмала, мг;

6,889 и 0,029388 – коэффициенты расчетного уравнения, полученные экспериментально для данных условий, установленные с учетом действия фермента в течение 60 мин.

1.2 Определение амилолитической активности микробных

ферментных препаратов

1.2.1 Теоретическое обоснование

Грибные и бактериальные ферментные препараты содержат богатый комплекс амилолитических ферментов, позволяющих полнее гидролизовать крахмал, чем при применении солода. Грибные культуры продуцируют a-амилазу, глюкоамилазу. В них содержатся активные целлюлазы и гемицеллюлазы, протеолитические ферменты. Для осахаривания применяют глубинные культуры грибов и бактерий (Гх) и поверхностные культуры грибов (Пх), реже – высушенные препараты (Г3х) и очищенные (Г10х).

1.2.2 Реактивы

– 1 %-ный забуференный раствор растворимого крахмала (картофельного);

– буферный ацетатный раствор для препаратов грибного происхождения (рН 4,7…4,8);

– буферный фосфатный раствор для препаратов бактериального происхождения (рН 5,9…6,0);

– 0,1 н раствор соляной кислоты;

– основной раствор йода;

– рабочий раствор йода;

– основной раствор ферментного препарата – в стаканчике вместимостью 25…30 мл взвешивают 0,1 г исследуемого препарата. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой, добавив немного воды, затем количественно переводят в мерную колбу на 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и при необходимости фильтруют через складчатый фильтр. Прозрачный основной раствор ферментного препарата может храниться в течение 1 суток при температуре от +2 до -40 °С;

– рабочий раствор ферментного препарата готовят, разбавляя основной раствор так, чтобы в 5 мл содержалось количество фермента, достаточное для гидролиза 20…70 % крахмала в принятых условиях. Количество основного раствора препарата, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора, находят по таблице 2.

Таблица 2 – Приготовление рабочих растворов из ферментных

микробных препаратов

Амилолитическая активность (АС) (предполагаемая), ед./г	Количество препарата в 5 мл рабочего раствора, мг	Расход основного раствора на приготовление рабочего раствора, мл	Общий объем разбавленного раствора, мл
20…80	5,0	50,0	50,0
81…150	2,0	20,0	50,0
151…300	1,0	10,0	50,0
301…700	0,5	5,0	50,0
701…1200	0,25	10,0	200,0
1201…2500	0,125	5,0	200,0
2501…5000	0,05	2,0	200,0
Свыше 5000	0,025	1,0	200,0

1.2.3 Проведение анализа

Осахаривание крахмала ведут в строго определенных условиях:

– температура 30 °С;

– рН среды 4,7…4,8 (для препаратов грибного происхождения) или 5,9…6,0 (для препаратов бактериального происхождения);

– продолжительность реакции 10 мин;

– объем раствора 15 мл (10 мл раствора крахмала + 5 мл рабочего раствора ферментов солода).

Методика проведения анализа описана в п. 1.1.

Амилолитическую способность (ед./г) определяют по числу единиц, содержащихся в 1 г поверхностной культуры и в 1 мл глубинной культуры аналогично определению активности солода.

Расчет ведется по следующим уравнениям:

– для препаратов бактериального происхождения:

, (4)

– для препаратов грибного происхождения:

, (5)

где – количество гидролизованного крахмала (субстрата), г;

n – масса ферментного препарата, содержащаяся в 5 мл раствора, взятого для осахаривания крахмала, мг;

5,885; 0,001671; 7,264; 0,03756 – коэффициенты расчетных уравнений, полученные экспериментально для данных условий, установленные с учетом действия фермента в течение 60 мин.

2 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ СОЛОДА ИЛИ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

2.1 Сущность метода

Осахаривающая активность () характеризует способность ферментов катализировать гидролиз крахмала до редуцирующих сахаров. В процессе этой реакции образуется целый комплекс редуцирующих сахаров, поэтому осахаривающую активность определяют в пересчете на тот сахар, который преобладает в гидролизате: на мальтозу при анализе солодов, на глюкозу при анализе препаратов, полученных с помощью большинства грибных продуцентов.

Определение осахаривающей активности с помощью поляриметра (Осп) основано на определении скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала, которая устанавливается по уменьшению величины угла вращения плоскости поляризации. Это уменьшение происходит за счет образования низкомолекулярных углеводов под действием ферментов на крахмал.

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в строго определенных условиях гидролизует до низкомолекулярных углеводов 1 г крахмала, который составляет 10 % от введенного в реакцию.

– рН 4,8…4,9 для солода (применяется фосфатный буфер) или 4,7…4,8 для плесневых грибов (применяется ацетатный буфер);

– температура 50 оС;

– время действия фермента 30 мин;

– объем смеси 30 мл (20 мл субстрата и 10 мл рабочего раствора фермента.

Поляриметрический метод позволяет определять концентрацию оптически активных веществ в растворах. К оптически активным органическим веществам относятся глюкоза, сахараза, фруктоза, крахмал, аминокислоты и др. Эти вещества обладают свойством отклонять плоскость поляризации проходящего через их растворы поляризованного луча.

Угол поворота плоскости поляризации измеряют с помощью оптических приборов – поляриметров (рисунок 1). Наибольшее распространение получили поляриметры-сахариметры СУ-2 и СУ-1 с нормальной сахарной шкалой.

1 – винт; 2 – окуляр; 3 – лупа; 4 – поляриметрическая трубка;

5 – камера; 6 – поляризатор; 7 – осветительный узел; 8 – трансформатор

Рисунок 1 – Поляриметр СУ-2

Схема устройства оптической системы поляриметра представлена на рисунке 2. Поляриметр состоит из двух поляризационных призм Николя, установленных таким образом, что плоскости их главных сечений взаимно перпендикулярны. Между призмами размещается трубка с раствором оптически активного вещества. Ближайшая к источнику света призма (поляризатор) служит для поляризации световых лучей, вторая (анализатор) – для компенсации угла вращения плоскости поляризации.

1 – светофильтр; 2 – двояковыпуклая линза; 3 – поляризатор;

4, 8 –диафрагмы; 5, 7 – защитные стекла; 6 – трубка с испытуемым

раствором; 9 – кварцевый компенсатор; 10 – анализатор;

11 – зрительная трубка (2 объектива и окуляр)

Рисунок 2 – Оптическая схема поляриметра

При отсутствии раствора в трубке поляризационный свет через анализатор не пройдет, и будет наблюдаться полная темнота; при наличии раствора в анализаторе можно видеть свет, ослабленный по сравнению с исходным. Яркость его тем больше, чем более концентрированный раствор.

Практически трудно отличить полную темноту от очень слабого света.

В настоящее время используют полутеневые поляриметры, в которых устанавливают дополнительную призму, благодаря чему получаются два одинаковых полукруга. Для измерения концентрации вещества в растворе освещенность обеих половин выравнивают.

В полутеневом приборе обе призмы установлены неподвижно, а освещенность полей регулируется кварцевым компенсатором. Кварц является веществом, близким по оптическим свойствам к сахарозе. Таким образом, вместо измерения угла поворота анализатора измеряют толщину компенсирующей вращение кварцевой пластины. Величина угла вращения плоскости поляризации α при определенных условиях зависит от концентрации раствора. Для характеристики каждого оптически активного вещества вводится понятие удельного вращения [α]tD, т. е. угла вращения, которым обладает раствор, содержащий в 100 см3 100 г вещества при длине трубки 100 мм.

Угол вращения определяют обычно при 20 оС в монохроматическом свете.

Концентрацию раствора оптически активного вещества С (в г на 100 см3) находят по формуле

, (6)

где l – длина трубки, мм;

– удельное вращение оптически активного вещества.

Пользуясь сахариметром, можно определить процентное содержание сахарозы в сахаросодержащих продуктах. При анализе крахмалистых материалов вводят расчетный коэффициент исходя из величины удельного вращения крахмала и взятой на анализ навески. Поляриметр СУ-3 имеет линейно-эмпирическое устройство шкалы. Она градуирована по раствору химически чистой сахарозы, содержащему 26 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды. Такой раствор при поляризации в трубке длинной 200 мм при температуре 20 оС дает показания на условной шкале 100о. Шкала разделена на 100 равных частей. Одно деление шкалы отвечает содержанию 0,26 г сахарозы. Такая шкала сахариметра является нормальной шкалой, а навеска сахарозы 26 г – нормальной навеской.

Поляриметр-сахариметр имеет две шкалы: основную и нониусную (рисунок 3). Целые градусы определяют по положению черты «0»
нониуса по основной шкале, десятые доли по шкале-нониусу; угол вращения раствора находят по этим двум шкалам.

Перед началом работы проверяют нулевую точку прибора, т. е. освещенность поля при нулевом положении основной и нониусной шкалы – она должна быть одинаковой.

Рисунок 3 – Шкалы поляриметра

Затем заполняют поляриметрическую трубку так, чтобы в ней не оставалось пузырьков воздуха. Покровные стекла должны быть чистыми. Температура раствора 20 оС. Помещают трубку в камеру прибора. Поле поляриметра наблюдают через окуляр, компенсатор перемещают винтом до получения одинаковой освещенности поля зрения, показания отсчитывают по шкале.

Поляризационная трубка на 200 мм считается нормальной. При использовании трубок длиной 100 или 400 мм показания поляриметра увеличивают или уменьшают соответственно в 2 раза.

2.2 Реактивы

– 2 %-ный раствор растворимого крахмала. Навеску растворимого крахмала берут из такого расчета, чтобы в 100 мл раствора содержалось 2 г сухого крахмала.

Взвешенную на технических весах навеску крахмала без потерь переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды и перемешивают, затем добавляют еще 25 мл и помещают колбу в кипящую водяную баню, выдерживая её до полного растворения крахмала и непрерывно помешивая раствор. Содержимое колбы охлаждают до 20 °С, добавляют 10 мл буферного раствора, доводят водой до метки и перемешивают;

– буферный фосфатный раствор (рН 4,8…4,9) – для анализа солода;

– буферный ацетатный раствор (рН 4,7…4,8) – для анализа ферментных препаратов, продуцированных плесневыми грибами;

– 1 н раствор соляной кислоты;

– 30 %-ный раствор сульфата цинка;

– 15 %-ный раствор раствора гексациано-(II)-ферроата калия (K4Fe(CN)6).

– солодовая вытяжка – взвешивают на технических весах две навески измельченного солода – одну для определения влажности и вторую для определения осахаривающей активности солода. Величина навески просяного солода 10 г, ячменного, овсяного и ржаного 5 г. Навеску количественно переносят в химический стакан или коническую колбу на 200…250 мл, добавляют 10 мл буферного фосфатного раствора (рН 4,8…4,9) и 90 мл дистиллированной воды.

Полученную смесь выдерживают в течение 60 мин при 30 оС, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения осахаривающей активности солода. Для проведения ферментативной реакции готовят рабочий раствор, пользуясь данными таблицы 1.

– основной раствор ферментного препарата – в стаканчике вместимостью 25…30 мл взвешивают 0,1 г исследуемого препарата. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой, добавив немного воды, затем количественно переводят в мерную колбу на 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и при необходимости фильтруют через складчатый фильтр. Прозрачный основной раствор ферментного препарата может храниться в течение 1 суток при температуре от +2 °С до -40 °С;

– рабочий раствор ферментного препарата готовят, разбавляя основной раствор так, чтобы в 5 мл содержалось количество фермента, достаточное для гидролиза 20…70 % крахмала в принятых условиях. Количество основного раствора препарата, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора, находят по таблице 2.

2.3 Проведение анализа

Все пипетки, используемые при испытании, должны иметь ватные тампоны.

Для анализа берут 2 колбы. В них наливают по 40 мл 2 %-ного раствора картофельного крахмала (субстрат) и помещают в термостат с температурой 50 °С ± 0,5 °С. Выдерживают 5…10 минут, одновременно выдерживают в термостате рабочий раствор фермента.

К раствору крахмала добавляют 20 мл рабочего ферментного раствора, доведенного до той же температуры, перемешивают и выдерживают при 50 оС 30 мин. По истечении этого времени колбу с содержимым вынимают из термостата и добавляют в нее 2 мл термостатированного 1 н раствора соляной кислоты для инактивации фермента. Для осаждения белков и осветления приливают 2 мл 30 %-ного раствора сульфата цинка, а после перемешивания – 2 мл раствора гексациано-(II)-ферроата калия (K4Fe(CN %-ного).

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в другую колбу наливают последовательно 20 мл ферментного раствора, 2 мл 1 н раствора соляной кислоты, по 2 мл растворов сульфата цинка и гексациано-(II)-ферроата калия и 40 мл субстрата.

Содержимое обеих колб фильтруют. В фильтратах (контрольном и испытуемом) определяют поляризацию на сахариметре любой марки в поляризационной кювете длиной 200 мм. После измерения получают значения поляризации: Пк (контрольный раствор) и По (исследуемый, опытный раствор). Разность между значениями величины угла вращения плоскости поляризации контрольного и исследуемого растворов (ΔП) показывает снижение степени поляризации, которое пропорционально количеству образовавшихся в процессе ферментативной реакции низкомолекулярных углеводов.

Значение ΔП должно быть не менее 0,2о и не более 2,5о при определении на поляриметрах с нормальной сахарной шкалой.

Осахаривающую активность (, ед./г) определяют по уравнению

(7)

где а – масса солода в реакционной среде, мг;

0,050 и 0,0114 – постоянные коэффициенты, выведенные на основе экспериментальных данных.

Допустимые отклонения в параллельных определениях должны составлять не более 1,0 %.

При анализе концентрированных препаратов и поверхностных культур плесневых грибов применяют формулу

(8)

где а – масса ферментного препарата в реакционной среде, мг.

При анализе глубинной культуры применяют формулу

(9)

где V – количество ферментного препарата в реакционной среде, мл,

0,051; 1; 0,0102 – постоянные коэффициенты, выведенные на основе экспериментальных данных.

3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ ПО МЕТОДУ ВИЛЬШТЕТТЕРА И

ВАЛЬДШМИДТ-ЛЕЙТЦА В МОДИФИКАЦИИ

3.1 Сущность метода

Метод Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с рН 7,3…7,5 1 г препарата или 1 см3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 º С.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч в принятых условиях опыта.

3.2 Реактивы

– фосфатный буферный раствор с рН 7,3…7,5;

– 5 %-ный раствор желатина (субстрат) – 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15…20 см3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливают 20…25 см3 буферного раствора температурой 70…80 ºС и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см3, к нерастворившейся части добавляют еще 20…25 см3 буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Так повторяют до полного растворения желатина. Охлажденный до 40 ºС раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина должен храниться в холодильнике при температуре от 2 до 5 ºС и может быть использован для анализа в течение 2 сут. Перед анализом раствор желатина нагревают до 40 ºС на водяной бане;

– 1 %-ный спиртовой раствор тимолфталеина – 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96 %-ном спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см3 и после растворения доводят до метки, закрывают пробкой и хранят в тёмном месте;

– 96 %-ный этиловый спирт;

– основной раствор ферментного препарата готовят согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1, но вместо дистиллированной воды используют буферный раствор;

– рабочий раствор готовят исходя из предположительной протеолитической активности ферментного препарата;

– солодовую вытяжку готовят следующим образом: 40…50 г солода измельчают на кофемолке, растертую массу перемешивают, от нее берут навеску 20 г, которую взвешивают на технических весах в стакане 150…200 мл. Приливают 40 мл 0,5 %-ного раствора хлорида натрия и 60 мл дистиллированной воды, перемешивают стеклянной палочкой и выдерживают в воздушном термостате при 37 ºС в течение 60 мин. Затем содержимое стакана фильтруют сначала через полотняный, а затем через бумажный фильтр. Фильтрат используют в качестве основного раствора для получения рабочего раствора.

Рабочий раствор готовят путём разбавления дистиллированной водой до 25…50 мл различного количества основного раствора в зависимости от протеолитической активности исследуемого солода.

3.3 Проведение анализа

К 10 см3 5 %-ного раствора желатина с рН 7,3…7,5 приливают 2 см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50…100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором NaOH. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см3.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 4 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50…100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного раствора тимолфталеина, и титруют аналогично контролю.

Расчёт протеолитической активности ПС ведут по формуле

, (10)

где – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

– время протеолиза, ч;

– коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см3 жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле

(11)

где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см3 опытной пробы, см3;

– то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчёта количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

– поправка к титру щелочи.

3.4 Пример расчета

На титрование 1 см3 опытной пробы пошло 1,08 см3 0,1 н раствора NaOH, а на титрование 1 см3 контрольной пробы – 0,68 см3. Время ферментолиза было 3 ч. Поправка к титру NaOH Следовательно, мг.

Исходная 10 %-ная вытяжка была приготовлена из сырой поверхностной культуры с влажностью 50 %, фильтрат вытяжки из культуры в количестве 2 см3 был добавлен к 10 см3 5 %-ного раствора желатина, из реакционной смеси на анализ отобрали 1 см3. Схема разведения имеет вид

Подсчитываем (в ед. на 1 г культуры)

.

Если требуется пересчитать протеолитическую активность на сухое вещество культуры (ед./г), то расчёт ведётся по формуле

.

Если ведётся определение активности в очищенном препарате, то составляется соответствующая схема разведения и делается аналогичный расчёт.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Приготовление реактивов

А.1 Приготовление буферных растворов

Буферные растворы готовятся в соответствии с межгосударственным стандартом (ГОСТ 4919.2-77, СТ СЭВ 808-77).

Для приготовления буферных растворов используют дистиллированную воду, не содержащую углекислоты (дистиллированную воду кипятят в течение 20 мин, охлаждают и хранят в стеклянных бутылях, защищенных от диоксида углерода при помощи вставленных в резиновые пробки хлоркальциевых трубок, заполненных натронной известью).

Навески препаратов взвешивают с погрешностью не более 0,001 г. Для приготовления исходных растворов применяют калиброванные мерные колбы.

Исходные растворы после тщательного перемешивания переносят в сухие склянки с хорошо притертыми пробками.

Исходные растворы для приготовления буферных растворов отмеривают при 18…22 ºС при помощи бюреток высшего класса точности.

Исходные растворы хранят при комнатной температуре в местах, защищенных от попадания прямых солнечных лучей не более двух месяцев. При наличии в растворе помутнения и хлопьевидного осадка раствор следует заменить свежеприготовленным.

Рабочие буферные растворы хранению не подлежат.

При необходимости проверки рН какого-либо раствора, его измеряют на рН-метре, предварительно проверенном и откалиброванном по образцовым буферным растворам. Измеренное значение рН для рабочих буферных растворов должно отличаться от величин, указанных в таблицах не более чем на 0,1 рН.

А.1.1 Приготовление ацетатного буферного раствора

Для приготовления ацетатного буферного раствора используют следующие реактивы.

Кислота уксусная, 99…100 %-ная, CH3COOH, молекулярная масса 60,05. Не требует предварительной подготовки.

Натрий уксуснокислый, CH3COONa·3H2O, молекулярная масса 136,08. Не требует предварительной подготовки.

Для приготовления исходного 0,2 М раствора уксусной кислоты 12,010 г препарата растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Для приготовления исходного 0,2 М раствора уксуснокислого натрия 27,216 г препарата CH3COONa·3H2O растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Из исходных растворов готовят ацетатные буферные растворы с рН от 2,8 до 6,0 в соответствии с таблицей А.1.

1 – Ацетатный буферный раствор с рН 2,8…6,0

рН	0,2 М раствор уксусной кислоты, мл	0,2 М раствор уксуснокислого натрия, мл
2,8	100,0	–
3,0	98,0	2,0
3,2	97,0	3,0
3,4	94,5	5,5
3,6	92,5	7,5
3,8	88,0	12,0
4,0	82,0	18,0
4,2	73,5	26,5
4,4	63,0	37,0
4,6	51,0	49,0
4,8	40,0	60,0
5,0	29,5	70,5
5,2	21,0	79,0
5,4	14,5	85,5
5,6	9,5	90,5
5,8	7,0	93,0
6,0	5,0	95,0

А.1.2 Приготовление фосфатного буферного раствора

Для приготовления буферных растворов применяют реактивы квалификации х. ч. и ч. д.а., специально подготовленные. Подготовка реактивов проводится следующим образом.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH2PO4, молекулярная масса 136,г препарата растворяют при нагревании до кипения в 150 мл воды. Раствор фильтруют горячим. При постоянном перемешивании фильтрат охлаждают до 10 ºС. Затем добавляют 150 мл этилового спирта. Выделившиеся при постоянном перемешивании фильтрата кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовавают в тех же условиях; кристаллы сушат до постоянной массы при 105…110  ºС. При наличии препарата с содержанием основного вещества в пределах 99,9…100,0 % предварительная подготовка вещества не проводится.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, Na2HPO4·12H2O, молекулярная масса 358,12. Существует два способа подготовки препарата.

а) 150 г препарата растворяют в 150 мл воды при нагревании до 100 ºС. Раствор фильтруют горячим и после охлаждения отфильтровывают выпавшие кристаллы. Перекристализацию повторяют при нагревании до 100 ºС. Перекристаллизованный препарат нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане при непрерывном перемешивании до полного высыхания препарата. Полученную соль высушивают в эксикаторе над плавленым хлористым кальцием в течение суток. В перекристаллизованном препарате (Na2HPO4·2H2O) проверяют содержание основного вещества. Для этого около 0,5000 г препарата растворяют в 50 мл воды, прибавляют 2…3 мл насыщенного раствора хлористого натрия и титруют 0,1 н раствором соляной кислоты в присутствии индикатора метилового красного. При необходимости вносят поправку в величину навески. 1 мл точно 0,1 н раствора соляной кислоты соответствует 0,0178 г Na2HPO4·2H2O.

б) 75 г препарата растворяют в 250 мл воды, нагретой до 60 ºС. Раствор фильтруют горячим, фильтрат охлаждают при постоянном перемешивании до 10 ºС. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовывают в тех же условиях. Полученную соль сначала высушивают при температуре не выше 30 ºС в течение 24 ч, затем продолжают высушивать в сушильном шкафу при 50 ºС в течение 3…4 ч, и, наконец, при 120 ºС ± 5 ºС до постоянной массы, не допуская расплавления соли. После высушивания соль имеет состав Na2HPO4.

После подготовки реактивов готовят исходные растворы калия фосфорнокислого однозамещенного и натрия фосфорнокислого двузамещенного.

Навеску безводного калия фосфорнокислого однозамещенного KH2PO4 массой 9,078 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного Na2HPO4·12H2O, массой 11,876 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Из исходных растворов готовят фосфатные буферные растворы с рН от 4,94 до 9,18 в соответствии с таблицей А.2.

2 – Фосфатный буферный раствор с рН 4,94…9,18

рН	Раствор Na2HPO4·12H2O, мл	Раствор KH2PO4, мл
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

А.2 Приготовление 0,1 н раствора гидроксида натрия

Все растворы гидроксида натрия хранят в полиэтиленовых флаконах или в склянках, покрытых парафином, или в склянках, защищенных от диоксида углерода при помощи вставленных в резиновые пробки хлоркальциевых трубок, заполненных натронной известью.

Сначала готовят насыщенный раствор щелочи. Если имеющийся в лаборатории гидроксид натрия частично покрыт слоем карбоната натрия, то перед растворением кусочки гидроксида натрия быстро обмывают водой. В фарфоровом стакане в 250 мл воды растворяют 250 г гидроксида натрия. Щелочь добавляют постепенно при перемешивании, чтобы избежать местного перегрева и образования труднорастворимого осадка.

После охлаждения раствор переливают в подготовленную посуду и выдерживают течение 15…20 суток до полного выпадения осадка углекислого натрия, нерастворимого в растворе гидроокиси натрия указанной концентрации. В отстоявшемся прозрачном растворе устанавливают содержание гидроокиси натрия титрованием, для чего 1 мл раствора разбавляют водой до 50 мл и титруют 1 н раствором кислоты (серной или соляной) в присутствии 1 капли индикатора метилового оранжевого. 1 мл точно 1 н раствора кислоты соответствует 0,04 г NaOH.

1 н; 0,2 н и 0,1 н растворы готовят соответствующим разбавлением объемов концентрированного раствора гидроокиси натрия, содержащих соответственно 40,0; 8,0 и 4,0 г NaOH.

Отмеренный объем раствора доводят водой до 1 л. Коэффициент поправки устанавливают титрованием кислотой соответствующей нормальности по метиловому оранжевому. 1 н раствор хранят в полиэтиленовом флаконе.

Для точной установки титра 0,1 н раствора NaOH по титрованному раствору HCl следует из бюретки отобрать в конические колбы вместимостью 250 см3 3…4 параллельные пробы по 35…30 мл 0,1 н раствора NaOH. В каждую колбу вносят 3…4 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором HCl до исчезновения розовой окраски. Затем добавляют 1…2 капли метилового оранжевого и продолжают титрование до перехода желтого окрашивания в оранжево-желтое.

Расчет для определения коэффициента поправки щелочи по соляной кислоте:

по фенолфталеину

,

по метиловому оранжевому

,

где – объем 0,1 н раствора NaOH, взятый на титрование, см3;

– объем 0,1 н раствора HC, израсходованное на титрование
с фенолфталеином, см3;

– объем 0,1 н раствора HC, израсходованное на титрование
с метиловым оранжевым, см3.

Расхождение между коэффициентами поправки щелочи, установленными по метиловому оранжевому и по фенолфталеину, свидетельствует о загрязненности щелочи карбонатами. Максимально допустимое расхождение 0,4 %.

Если приготовленный раствор щелочи будет использоваться для титрования кислот, то в 3…4 конические колбы вносят по 25…30 мл 0,1 н раствора HCl и титруют 0,1 н раствором NaOH в присутствии фенолфталеина с кипячением и повторным титрованием до неисчезающей в течение 1 минуты светло-розовой окраски. Такой коэффициент совпадает с коэффициентом, установленным по метиловому оранжевому и по исходному веществу в пределах допустимой ошибки. Бюретку, используемую для титрования щелочью, не следует использовать для титрования кислотой.

При отсутствии резких колебаний температур титр щелочей необходимо проверять не реже 1 раза в 3 месяца.

Концентрацию раствора можно также установить по его плотности в соответствии с таблицей А.3.

3 – Зависимость между плотностью раствора NaOH

и его концентрацией при температуре 20 ºС

Плотность раствора, г/см3	Концентрация раствора NaOH,
%	моль/л	г/л
1	2	3	4
1,000	0,159	0,0398	1,59
1,0005	0,602	0,151	6,04
1,010	1,04	0,264	10,56
1,015	1,49	0,378	15,12
1,020	1,94	0,494	19,76
1,025	2,39	0,611	24,44
1,030	2,84	0,731	29,24
1,035	3,29	0,851	34,04
1,040	3,74	0,971	38,84
1,045	4,20	1,097	43,88
1,050	4,65	1,222	48,88
1,055	5,11	1,347	53,88
1,060	5,56	1,474	58,96
1,065	6,02	1,602	64,08
1,070	6,47	1,731	69,24
1,075	6,93	1,862	74,48
1,080	7,38	1,992	79,68
1,085	7,83	2,123	84,92
1,090	8,28	2,257	90,28
1,095	8,74	2,391	95,64
1,100	9,19	2,527	101,1
1,105	9,64	2,664	106,6
1,110	10,10	2,802	112,1
1,115	10,55	2,942	117,7
1,120	11,01	3,082	123,3
1,125	11,46	3,224	129,0
1,130	11,92	3,367	134,7
1,135	12,37	3,510	140,4
1,140	12,83	3,655	146,2
1,145	13,28	3,801	152,0
1,150	13,73	3,947	157,9
1,155	14,18	4,095	163,8
1,160	14,64	4,244	169,8
1,165	15,09	4,395	175,8

Продолжение таблицы А.3

1	2	3	4
1,170	15,54	4,545	181,8
1,175	15,99	4,697	187,9
1,180	16,44	4,850	194,0
1,185	16,89	5,004	200,2
1,190	17,34	5,160	206,4
1,195	17,80	5,317	212,7
1,200	18,25	5,476	219,0
1,205	18,71	5,636	225,4
1,210	19,16	5,796	231,8
1,215	19,62	5,958	238,3
1,220	20,07	6,122	244,9
1,225	20,53	6,286	251,4
1,230	20,98	6,451	258,0
1,235	21,44	6,619	264,8
1,240	21,90	6,788	271,5
1,245	22,36	6,958	278,3
1,250	22,82	7,129	285,2
1,255	23,27	7,302	292,1
1,260	23,73	7,475	299,0
1,265	24,19	7,650	306,0
1,270	24,64	7,824	313,0
1,275	25,10	8,000	320,0
1,280	25,56	8,178	327,1
1,285	26,02	8,387	334,3
1,290	26,48	8,539	341,6
1,295	26,94	8,722	348,9
1,300	27,41	8,906	356,2
1,305	27,87	9,092	363,7
1,310	28,33	9,278	371,1
1,315	28,80	9,466	378,6
1,320	29,26	9,656	386,2
1,325	29,73	9,847	393,9
1,330	30,20	10,04	401,6
1,335	30,67	10,23	409,2
1,340	31,14	10,43	417,2
1,345	31,62	10,63	425,2
1,350	32,10	10,83	433,2
1,355	32,58	11,03	441,2
1,360	33,06	11,24	449,6
1,365	33,54	11,45	458,0
1,370	34,03	11,65	466,0
1,375	34,52	11,86	474,4
1,380	35,01	12,08	483,2
1,385	35,50	12,29	491,6
1,390	36,00	12,51	500,4

Продолжение таблицы А.3

1	2	3	4
1,395	36,49	12,73	509,2
1,400	36,99	12,95	518,0
1,405	37,49	13,17	526,8
1,410	37,99	13,39	535,6
1,415	38,49	13,61	544,4
1,420	38,99	13,84	553,6
1,425	39,49	14,07	562,8
1,430	40,00	14,30	572,0
1,435	40,51	14,53	581,2
1,440	41,03	14,77	590,8
1,445	41,55	15,01	600,4
1,450	42,07	15,25	610,0
1,455	42,59	15,49	619,6
1,460	43,12	15,74	629,6
1,465	43,64	15,98	639,2
1,470	44,17	16,23	649,2
1,475	44,69	16,48	659,2
1,480	45,22	16,73	669,2
1,485	45,75	16,98	679,2
1,490	46,27	17,23	689,2
1,495	46,80	17,49	699,6
1,500	47,33	17,75	710,0
1,505	47,85	18,00	720,0
1,510	48,38	18,26	730,4
1,515	48,90	18,52	740,8
1,520	49,44	18,78	751,2
1,525	49,97	19,05	762,0
1,530	50,50	19,31	772,4

А.3 Приготовление растворов индикаторов

Растворы готовят из индикаторов, тонкорастертых в агатовой или фарфоровой ступке.

Метиловый оранжевый

В интервале рН 3,0…4,4 окраска изменяется от красной к желтой.

0,1 г препарата растворяют в 80 мл горячей воды и по охлаждении доводят объем раствора водой до 100 мл.

Фенолфталеин

В интервале рН 8,2…10,0 окраска изменяется от бесцветной к красно-фиолетовой.

1 г препарата растворяют в 80 мл этилового спирта и доводят объем раствора водой до 100 мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Рухлядева, определения активности гидролитических ферментов / , . – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. – 288 с.

2. Грачева, практикум по технологии ферментных препаратов: учебное пособие для вузов / [и др.]. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. – 240 с.

3. Карпенко, практикум по общей технологии бродильных производств / , , . –М.: Московский государственный университет пищевых производств, 1997. – 36 с.

4. Фертман, контроль бродильных производств / , . – М.: Пищевая промышленность, 1969. – 356 с.

5. Лурье, и микробиологический контроль в кондитерском производстве: справочник / , , .– М.: КолосС, 2003. – 416 с.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….	3
1 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ………………..	4
1.1  Определение амилолитической активности ферментов солода ……………………………………….…	4
1.1.1 Сущность метода………………………………..	4
1.1.2 Реактивы……………………………………….…	5
1.1.3 Проведение анализа………………………….….	6
1.2 Определение амилолитической активности микробных ферментных препаратов…………..…………..	8
1.2.1 Теоретическое обоснование…………………….	8
1.2.2 Реактивы………………………………………….	8
1.2.3 Проведение анализа…………………………..…	9
2 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ СОЛОДА ИЛИ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ…..	11
2.1 Сущность метода…………………………………..	11
2.2 Реактивы……………………………………………	14
2.3 Проведение анализа……………………………….	15
3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ПО МЕТОДУ ВИЛЬШТЕТТЕРА И ВАЛЬДШМИДТ-ЛЕЙТЦА В МОДИФИКАЦИИ……………………………………………….	17
3.1 Сущность метода…………………………………..	17
3.2 Реактивы……………………………………………	17
3.3 Проведение анализа……………………...………..	18
3.4 Пример расчета……………………………………	19
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Приготовление реактивов…………………	20
А.1 Приготовление буферных растворов……………….…	20
А.1.1 Приготовление ацетатного буферного раствора………………………………………………..	20
А.1.2 Приготовление фосфатного буферного раствора………………………………………………..	21
А.2 Приготовление 0,1 н раствора гидроксида натрия………………………………………………….	23
А.3 Приготовление растворов индикаторов…………	27
ЛИТЕРАТУРА……………………………………………………	28

Учебное издание

Скиба Екатерина Анатольевна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ, ОСАХАРИВАЮЩЕЙ
И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ СОЛОДА
И ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Лабораторный практикум

для студентов специальности 260204

«Технология бродильных производств и виноделие»

и 240901 «Биотехнология» всех форм обучения

Редактор

Технический редактор

Подписано в печать 27.05.09. Формат 60´84 1/16

Усл. п. л. 1,74. Уч.-изд. л. 1,88

Печать – ризография, множительно-копировальный

аппарат «RISO TR -1510»

Тираж 50 экз. Заказ 2009-53

Издательство Алтайского государственного

технического университета

г. Барна

Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ

Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ

7