А. К. КОВАЛЕНКО, Т. А. ЯМПОЛЬСКАЯ1, Е. А. СЛИВИНСКАЯ1
Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»
1, Москва
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА gapA E. coli
Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) играет важную роль в гликолизе, обычном пути расщепления глюкозы, катализируя превращение глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бисфосфоглицерат. С целью дальнейшего исследования GAPDH, проведено клонирование гена gapА, кодирующего этот фермент. ДНК гена gapА наработана с использованием ПЦР и клонирована в составе экспрессионного вектора pKK223-3. Лигазной смесью трансформировали штамм HB101. Из полученных Apr-клонов методом щелочного лизиса выделены плазмиды, найдены рекомбинантные плазмиды с вставкой в 1 kb, в которых присутствие гена gapА подтверждено ПЦР. Секвенированием определена точная нуклеотидная последовательность полученного гена, и выбран клон, не содержащий мутации дикого гена. Активность GAPDH в полученном рекомбинантном штамме измерена спектрофотометрически по восстановлению субстрата NAD+ в NADH. Показано существенное увеличение активности в рекомбинантном штамме по сравнению с бесплазмидным.
