Введение

ВВЕДЕНИЕ

Настоящий лабораторный практикум предусматривает выполнение студентами шести лабораторных работ по дисциплине «Технология производства дрожжей» согласно специализации 260204 «Технология бродильных производств и виноделие».

Объем пятой работы – 4 академических часа, остальных – по
6 часов.

Целью данного лабораторного практикума является изучение методов микробиологического и физико-химического контроля в производстве хлебопекарных дрожжей.

Три лабораторных работы посвящены микробиологическому контролю производства. Меласса анализируется расширенным методом, позволяющим оценить качественный и количественный состав микрофлоры, в том числе технически вредной. Хлебопекарные прессованные дрожжи анализируются упрощенным способом. Кроме того, приводятся методики производственного контроля, позволяющие путем микроскопирования оценить физиологическое состояние маточных и товарных дрожжей.

Четвертая работа предусматривает моделирование непрерывного способа культивирования дрожжей. Пятая и шестая направлены на освоение студентами основных физико-химических методов анализа хлебопекарных прессованных и сушеных дрожжей.

Работы, выполняемые студентами в рамках настоящего практикума, служат закреплению теоретических знаний по дисциплине «Технология производства дрожжей», кроме того, методики микробиологического контроля могут быть использованы в лабораторных практикумах и научно-исследовательских работах по дисциплинам специализации.

Также представленные лабораторные работы могут быть использованы в практикуме по общей биотехнологии студентами специальности 240901 «Биотехнология» всех форм обучения.

1 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

ПОДГОТОВКА СРЕД И ПОСУДЫ

ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

МЕЛАССЫ И ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ

1.1 Приборы, реактивы, материалы

1) Колба плоскодонная на 500 мл – 2 шт.;

2) колба плоскодонная на 250 мл – 10 шт.;

3) банка на 250 мл с микробиологической крышкой – 5 шт.;

4) пробирка химическая – 12 шт.;

5) чашки Петри – 28 шт.;

6) пипетки на 1,2 и 10 мл;

7) фарфоровая ступка с пестиком;

8) шпатель Дригальского – 4 шт.;

9) цилиндр мерный 100 мл;

10) воронка;

11) петля микробиологическая;

12) плита электрическая;

13) баня водяная;

14) термостат на 30 ºС;

15) холодильник;

16) шкаф сушильный;

17) весы технические;

18) автоклав;

19) вода дистиллированная;

20) мел;

21) среда питательная селективная (ГРМ-агар);

22) агар-агар микробиологический;

23) калия дигидроортофосфат;

24) калия нитрат;

25) сульфат магния;

26) сульфат железа (II);

27) лизин – 1,5 г;

28) глюкоза;

29) реактив Грисса;

30) нистатин;

31) 0,1 н раствор гидроксида натрия;

32) раствор фенолфталеина 1 %-ный;

33) метиленовый синий по Лёффлеру;

34) 0,5 %-ный раствор йода;

35) спирт этиловый;

36) бумага фильтровальная;

37) марля;

38) вата;

39) кружки из плотного картона (вырезаются по малому диаметру чашек Петри) – 12 шт.;

40) хлорамин;

41) порошок моющий;

42) перчатки резиновые;

43) маркер, пишущий по стеклу;

44) бумага для заворачивания посуды;

45) нитки хлопчатобумажные;

46) дрожжи прессованные – 80 г;

47) меласса – 64 г;

48) молоко обезжиренное – 60 мл;

49) сахар-песок – 24 г.

1.2 Подготовка и стерилизация питательных сред

1.2.1 Среды на основе дрожжевой воды

Дрожжевая вода. В 1 литре водопроводной воды кипятить 15 ми-нут 80 г прессованных или 20 г сушеных дрожжей, затем профильтровать через бумажный фильтр, разлить в посуду и стерилизовать при
0,7 атм 20 минут. При необходимости после стерилизации раствор про-фильтровать.

Дрожжевая вода с 10 % сахарозы. К дрожжевой воде добавить 10 % сахарозы и 3 % мела. В две банки на 250 мл внести по 100 мл данной среды (для исследования мелассы на наличие молочнокислых бактерий рода Leuconostoc). Стерилизовать автоклавированием при
0,5 атм в течение 20 минут.

Дрожжевая вода с 4 % сахарозы. К дрожжевой воде добавить
4 % сахарозы. В 2 химические пробирки внести по 10 мл дрожжевой воды с 4 % сахарозы (для исследования мелассы на самозакисание); в
2 химические пробирки внести по 6 мл дрожжевой воды с 4 % сахарозы (для исследования хлебопекарных дрожжей на наличие B. subtilis). Стерилизовать автоклавированием при 0,5 атм в течение 20 минут.

1.2.2 Твердые питательные среды для исследования

микробиологических показателей мелассы

1) для выявления общего количества микроорганизмов – 75 мл питательной среды на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар). Среда готовится следующим образом: 2,9 г сухой питательной среды растворить в 75 мл дистиллированной воды и, помешивая, довести до кипения. Профильтровать через марлевый фильтр и разлить в стерильные флаконы. Стерилизовать автоклавированием 15 мин при 1 атм (121 ºС);

2) для выявления несовершенных дрожжей готовят синтетическую среду с лизином. Состав среды (в г): глюкоза – 50; лизин – 3; КН2РО4 – 1; МgSO4 – 1; FeSO4 – следы.

Каждый компонент растворяют в воде отдельно, смешивают в указанном порядке и доводят водой до 1 л. Внимание! Необходимо сделать пересчет компонентов, исходя из того, что требуется не 1 л, а 75 мл среды.

В полученную жидкую синтетическую среду вносят агар (1,5 %), расплавляют и разливают в стерильные флаконы. Среду стерилизуют 20 мин при 0,5 атм;

3) для выявления кислотообразующих бактерий приготовить 75 мл питательной среды на основе гидролизата рыбной муки с 2 % мела.

Приготовление стерильного мела. Мел мелко растертый или размолотый, насыпают в стерильные пробирки или колбочки и стерилизуют в сушильном шкафу при 160 ºС в течение часа;

4) для выявления гнилостных бактерий используется молочный агар. В 60 мл обезжиренного молока внести 2 % микробиологическо-
го агар-агара, довести до кипения, профильтровать через марлевый фильтр, перенести в колбу. Стерилизовать 20 мин при 0,5 атм;

5) для выявления спорообразующих бактерий 50 мл питательной среды на основе гидролизата рыбной муки.

1.2.3 Твердые питательные среды для исследования

микробиологических показателей хлебопекарных дрожжей

1) для выявления общего количества микроорганизмов приготовить 75 мл питательной среды из гидролизата рыбной муки;

2) для выявления общего количества бактерий приготовить 75 мл питательной среды из гидролизата рыбной муки c нистатином (нистатин добавляется в боксе);

3) для выявления кислотообразующих бактерий приготовить 75 мл питательной среды из гидролизата рыбной муки с 2 % мела;

4) для выявления спорообразующих бактерий приготовить 75 мл питательной среды из основы гидролизата рыбной муки.

Каждую среду стерилизовать в отдельной колбе, закрыв ее ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком. На бумажном колпачке подписать состав, назначение, режим стерилизации и дату приготовления среды, а также свою фамилию и инициалы.

1

1.3 Подготовка и стерилизация посуды

Чашки Петри, пипетки, колбы, банки вымыть губкой с хозяйственным мылом. В случае сильных загрязнений приготовить раствор хозяйственного мыла в дистиллированной воде такой концентрации, чтобы при застывании образовывалась масса консистенции холодца. В таком растворе посуду довести до кипения (можно в ведре в автоклаве). Затем посуду промыть водопроводной и ополоснуть дистиллированной водой. Высушить в сушильном шкафу.

28 чашек Петри завернуть по 2 шт (16 чашек Петри для исследований микробиологических показателей мелассы, 12 чашек Петри – для исследований пекарских дрожжей). 12 картонных кружков (для поверхностных посевов хлебопекарных дрожжей) завернуть по 3 шт. в бумагу.

Каждую пипетку завернуть в бумагу либо поместить в металлические, или стеклянные пеналы, или в тканевые мешочки по 20…30 штук. Фарфоровую чашку завернуть вместе с вложенным в нее пестиком. 3 шпателя Дригальского завернуть в бумагу поштучно.

2 банки на 250 мл закрыть микробиологическими крышками с вложенной в них ватой (для взвешивания проб мелассы на определение общего количества микрофлоры).

1 химическую пробирку (для отбора мелассы при анализе на нитритобразующие бактерии) закрыть ватно-марлевой пробкой.

В 2 колбы вместимостью 500 мл внести по 200 мл дистиллированной воды; закрыть ватно-марлевыми пробками, сверху бумажными колпачками (для исследования мелассы на самозакисание).

В 3 банки на 250 мл внести по 100 мл дистиллированной воды, закрыть микробиологическими крышками с вложенной в них ватой
(2 банки для разведения мелассы водой в соотношении 1:10, 1 – для разведения нистатина).

В 8 химических пробирок внести по 10 мл дистиллированной воды, закрыть их ватно-марлевыми пробками и общим бумажным колпачком (1 пробирка – для разведения мелассы при определении нитритобразующих бактерий; 6 пробирок – для приготовления разведений мелассы; 1 пробирка – для разведения пекарских дрожжей).

Посуду стерилизовать при 121 ºС (1,0 атм) 1 час.

2 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСЛЕДОВАНИЯ МЕЛАССЫ

2.1 Теоретическая часть

Обычно проводятся исследования мелассы на наличие семи групп микроорганизмов.

1) Общее количество микроорганизмов определяют двумя способами: прямым – методом предельных разбавлений с последующим посевом на сусловый агар с содержанием 8 % сухих веществ и косвенным – по пробе мелассы на самозакисание.

Дрожжи дают на поверхности среды белые или сероватые колонии, чаще всего с ровным краем, блестящие или матовые. Также колонии могут быть морщинистые с ворсинчатым краем, в глубине среды – чечевидные, с крестообразными выростами, разрывающими агар. Под микроскопом видны крупные овальные или продолговатые клетки с почками, иногда клетки соединены в цепочки.

2) Несовершенные дрожжи выявляют посевом на среду с лизином.

К несовершенным дрожжам относятся: дикие дрожжи родов Candida (С. parapsilosis, C. clausseni, C. tropicalis, C. mycoderma, С. gillermondii), Torula (T. nigra и др.), Rodotorula (*****bra и др.), Torilopsis sp. Они представляют значительную опасность для дрожжевого производства.

Дикие дрожжи конкурируют с культурными, развиваясь быстрее, потребляя большое количество сахара. Многие из них превращают сахар в органические кислоты.

Несовершенные дрожжи вызывают агглютинацию дрожжевых клеток, снижают стойкость прессованных дрожжей, ухудшают их консистенцию, подъемную силу и бродильную активность.

Несовершенные дрожжи выявляют посевом на синтетическую среду с лизином. Сахаромицеты на такой среде либо не растут, либо образуют мелкие точечные колонии. Несовершенные дрожжи, особенно род Candida, развиваются в виде крупных, гладких, морщинистых или исчерченных, плоских или возвышающихся колоний с ровными или извилистыми краями.

3) Кислотообразующие бактерии выявляют посевом на среду с мелом.

Молочнокислые бактерии: кокки или палочки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие. Молочнокислые, как и другие бесспоровые бактерии, погибают при температуре 70…75 ºС. Оптимальная температура роста для мезофильных видов – 20…30 ºС, для термофильных – 49…51 ºС. Наиболее часто встречаются молочнокислые бактерии родов Lactobacillus (L. plantarum, L. brevis, L. fermenti) и Leunconostoc (L. mesenteroides, L. dextranicum, L. agglutinans).

Палочки являются кислотообразующими, повышают кислотность сусла в процессе культивирования и снижают генеративную активность дрожжей.

Кислотообразующие бактерии выявляются посевом на агаризованную среду с мелом. В качестве среды можно использовать дрожжевой агар с 4 % сахарозы и мелом либо сусло-агар с 12 % сухих веществ и мелом. Кислотообразующие бактерии вырастают в виде мелких колоний диаметром от 0,5 до 1,5 мм, слегка опалесцируют, иногда полупрозрачны с ровным краем и обычно с гладкой поверхностью. Вокруг каждой колонии заметна зона просветления (диаметром от 0,5 до 2 мм). Под микроскопом видны довольно мелкие (от 1,3 до 1,5 мкм) диплококки, иногда соединенные в короткие цепочки. Колонии бактерий рода Lactobacillus правильной круглой формы, с гладкой, блестящей поверхностью, беловатые или сероватые, слегка опалесцирующие, полупрозрачные. Под микроскопом видны короткие палочки, расположенные одиночно, попарно или соединенные в цепочки.

4) Слизеобразующие кокки определяют по биологической пробе.

Молочнокислые слизеобразующие кокки (род Leunconostoc) представляют значительную опасность для дрожжевого производства. Лейконостоки – Leunconostoc mesenteroides и Leunconostoc dextranicum – синтезируют декстран, что приводит к сгущению приточной мелассы и затрудняет ее поступление в дрожжерастильные аппараты. Leunconostoc mesenteroides имеют слизистую капсулу, поэтому устойчивы к высокой температуре и кислотам. В жидких средах погибают при 110…120 ºС в течение 20 минут.

Leunconostoc agglutinans обладают способностью прилипать к дрожжам и склеивать (агглютинировать) их клетки в комки, которые оседают на дно аппаратов. Размножение дрожжей почти прекращается. Подъемная сила прессованных дрожжей, выращенных в присутствии лейконостоков, низкая.

Мелассу вносят в дрожжевую воду с 10 % сахарозы и мелом. При наличии лейконостока жидкая питательная среда ослизняется через двое суток.

5) Протеолитические бактерии выявляют посевом на молочный агар.

Гнилостные бактерии вызывают распад белковых веществ и проявляют свою деятельность как в аэробных, так и в анаэробных условиях. При метаболизме анаэробов накапливаются органические дурно пахнущие и ядовитые вещества.

К факультативным анаэробам относятся грамотрицательные, неспорообразующие бактерии семейства Enterobacteriaceae, представленного родами Escherichia (кишечная палочка – E. coli ), Proteus
(P. vulgaris и др.) и Enterobacter (Enb. aerogenes и др.), а также грамположительные неспорообразующие кокки семейства Micrococcus. К облигатным анаэробам относятся Clostridium putrificum, Clostridium sporogenes. Все они вызывают разложение белков, что приводит к быстрой порче прессованных дрожжей (разжижению) и появлению неприятно пахнущих продуктов гниения (сероводорода, индола, скатола и др.).

К аэробам относятся грамотрицательные, неспорообразующие палочки рода Pseudomonas (синегнойная палочка – P. aeruginosa и другие виды) и грамположительные, спорообразующие почвенные бактерии рода Bacillus (сенная палочка B. subtilis, B. mesentericus, B. Megatheri-um, B. mycoides и др.).

Гнилостные бактерии выявляют глубинным посевом на молочном агаре. И спорообразующие, и неспорообразующие гнилостные бактерии образуют вокруг своих колоний зону просветления в результате гидролиза казеина.

6) Спорообразующие бактерии выявляют двумя способами: посевом из прогретых проб и по биологической пробе.

Спорообразующие бактерии представляют значительную опасность для дрожжевого производства, поэтому их особо выделяют в числе других гилостных микроорганизмов. К ним относятся бактерии рода Bacillus: подвижные, спорообразующие. Споры отличаются высокой термоустойчивостью (оптимальная температура прорастания 36…50 ºС). Поэтому выявляются эти бактерии высевом из прогретых проб. После кипячения в течение 10 мин вегетативные клетки погибают, их споры выдерживают кипячение, остаются жизнеспособными и при помещении в стерильную жидкую или агаризованную среду прорастают.

Бактерии рода Bacillus являются также нитритообразующими бактериями, редуцирующими нитраты в нитриты, содержание которых в концентрации 0,0005 % задерживает размножение дрожжей, а при увеличении концентрации до 0,02 % накопление биомассы снижается на 40…50 %. Стойкость дрожжей при хранении под влиянием нитритообразующих бактерий снижается, они вызывают разложение дрожжевых клеток и разжижение прессованных дрожжей. Нитриты образуются чаще всего при недостаточной аэрации среды, поэтому появление нитритов в дрожжерастильных аппаратах может являться косвенным показателем недостаточной аэрации.

Выявить способность спорообразующих бактерий к образованию нитритов можно при культивировании на среде с нитратами, которые эти бактерии восстанавливают до нитритов. Также способность образовывать нитриты можно определить по окраске реактива Грисса – при наличии нитритов в мелассе он окрашивается в красный цвет различной интенсивности.

2.2 Определение общего количества микроорганизмов

2.2.1 Приготовление проб для анализа

Две навески по 10 г мелассы отвешивают в стерильные банки по 250 мл на технических весах, добавляют 90 мл стерильной воды в каждую (разведение 1:10), хорошо перемешивают.

Далее готовят по два параллельных десятикратных разведения (102, 103, 104).

2.2.2 Метод предельных разбавлений

Этот метод широко используется в микробиологической практике. Исследуемая проба перед засевом разводится таким образом, чтобы возможен был количественный учет степени разведения и последующий подсчет клеток микроорганизмов (от 30 до 300 колоний на чашке Петри). Метод предельных разведений применяется не только для выделения чистых культур, но также для определения соотношения различных видов микроорганизмов в смешанной популяции и определения степени зараженности производственных субстратов посторонними микроорганизмами при проведении микробиологического и санитарного контроля производства.

Для метода предельных разведений нужно подготовить:

– пробирки со стерильной дистиллированной водой, разлитой по 9 см3;

– стерильные пипетки на 1 см3 (градуированные или пипетки Мора);

– стерильные чашки Петри;

– агаризованные питательные среды.

Если определяется общее число микроорганизмов в единице объема или в единице массы, то используют универсальные (стандартные среды): сусло-агар и мясопептонный агар (МПА), для определения вида микроорганизма применяют элективные среды. В данной лабораторной работе применяется ГРМ-агар.

После тщательного перемешивания из пробирок с разведени-
ями 102, 103, 104 отбирают стерильной пипеткой по 1 см3 суспензии клеток и вносят в чашки Петри. Затем туда же выливают 10…15 мл расплавленной и охлажденной до 50…55 ºС питательной среды, осторожно перемешивают круговыми движениями, после чего оставляют чашки для застывания среды. Чашки с посевами ставят в термостат при 30 ºС. Через 48…72 ч подсчитывают все выросшие колонии. Подсчитав количество колоний в одной чашке и допустив, что каждая колония выросла из одной клетки, подсчитывают, сколько микроорганизмов содержалось в 1 см3 (1 г) исследуемого материала. Для этого число колоний умножают на разведение. Учитывают те чашки, в которых выросло не более 300, но не менее 30 колоний (единица измерения – КОЕ/г).

2.3 Определение основных групп микроорганизмов мелассы

Для идентификации инфицирующей микрофлоры используют ча-шечный метод счета колоний, при этом исследуемую пробу разводят в соотношении 1:10 до такой степени, чтобы колонии, образуемые микробами на поверхности агаризованных питательных сред в чашках Петри, располагались на некотором расстоянии друг от друга для точности их подсчета.

Для определения общего числа микроорганизмов, молочнокислых бактерий, лейконостоков и других видов используют элективные питательные среды, состав которых учитывает физиологические особенности данной группы микроорганизмов.

Подсчитав отдельно колонии указанных групп микроорганизмов, инфицирующих мелассу, определяют процент каждой группы в общем количестве микроорганизмов.

2.3.1 Выявление несовершенных дрожжей

Определение несовершенных дрожжей осуществляют посевом на синтетическую среду с лизином. Высевают разведения 102, 103, 104. Выращивают посевы при температуре 30 ºС в течение 48 часов.

2.3.2 Определение количества кислотообразующих бактерий

Метод основан на способности кислотообразующих бактерий образовывать молочную кислоту. При посеве исследуемой пробы на питательную среду, состоящую из ГРМ-агара с 4 % мела, вокруг колонии кислотообразующей бактерии появляются прозрачные зоны растворения мела диаметром от 0,5 до 2 мм.

Делают разведения 102, 103, 104. Выращивают посевы при температуре 30 ºС в течение 48 часов. Подсчитывают число колоний, вокруг которых заметна зона растворения мела, и определяют их процентное содержание.

2.3.3 Исследование мелассы на слизеобразующие кокки

1 г мелассы вносят в банки со 100 мл дрожжевой воды с 10 % сахарозы и мелом, ставят в термостат при 30 ºС на 48 часов. При наличии лейконостока жидкая питательная среда ослизняется.

Для проверки способности агглютинировать (склеивать) дрожжевые клетки на предметное стекло наносят пипеткой одну каплю взвеси дрожжей (0,1 г прессованных дрожжей в 10 мл стерильной воды), туда же петлей наносят бактериальный материал и смешивают прямо на стекле. Если есть агглютинирующие бактерии, то наблюдается образование хлопьев.

2.3.4 Определение количества протеолитических бактерий

Метод основан на способности протеолитических (гнилостных) бактерий разлагать белки. Для определения количества протеолитических бактерий используют молочный агар. Разведения 10 и 102 высевают в чашки Петри, заливают молочным агаром, затем выращивают в термостате при 30 ºС в течение 48 часов.

Протеолитические бактерии учитывают по зонам просветления вокруг колоний за счет разложения казеина молока и определяют их процентное содержание.

2.3.5 Определение количества спорообразующих бактерий

высевом из прогретых проб

Метод основан на посеве предварительно прогретых проб. Пробирки с разведениями 10 и 102 выдерживают 10 мин в кипящей водяной бане. В чашки Петри вносят по 1 мл раствора, заливают агаризованной средой на основе рыбного гидролизата, перемешивают и дают застыть. После застывания чашку помещают в термостат при 37 ºС на 48 часов. Выросшие на чашке Петри колонии относят к спорообразующим бактериям.

Также присутствие B. subtilis можно выявить следующим образом: 2 мл разведенной мелассы (разведения 10 и 102) после выдерживания в кипящей водяной бане помещают в пробирки с 5 мл стерильной дрожжевой воды с 4 % сахарозы. Пробирки выдерживают в термостате при 37 ºС в течение 48 часов. При наличии B. subtilis на поверхности среды появляется типичная морщинистая пленка.

2.3.6 Биологическая проба на наличие нитритобразующих

бактерий

Для выявления этих бактерий следует предварительно довести рН исследуемого мелассного раствора до 7,0. Затем в стерильную пробирку отвесить 1 г мелассы, добавить 9 мл стерильной воды и ранее установленное количество 0,1 н раствора щелочи, пробирку закрыть ватной пробкой и термостатировать при 30 ºС.

Исследования проводят через 12, 16, 24, 36 и 48 ч. В чистую сухую пробирку наливают по 0,5 мл первого и второго раствора Грисса, нагревают на кипящей бане 1…2 мин и прибавляют по каплям 0,3 мл испытуемого мелассного раствора. Покраснение смеси указывает на наличие нитритов в среде. По интенсивности окрашивания судят о количестве нитритов (таблица 2.1).

Таблица 2.1 – Выявление количества нитритов по окраске реактива Грисса

Цвет раствора	Количество нитритов
ярко-красный	очень много
красный	много
красно-розовый	довольно много
слабо-розовый	мало

По скорости образования нитритов в разбавленной мелассе (1:10) судят о степени ее пригодности для дрожжевого производства. Если в пробе с реактивами Грисса через 12…16 ч появляется даже слабо-розовое окрашивание, необходимо принять меры, предотвращающие рост бактерий.

3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ДРОЖЖЕЙ

3.1 Микроскопирование

При проведении микробиологического контроля дрожжей оценивают их физиологическое состояние на всех технологических стадиях производства. Микроскопирование производят методом раздавленной капли с прижизненной окраской метиленовой синью или применяют окрашенные фиксированные препараты.

При микробиологическом контроле засевных дрожжей перед подачей их в дрожжерастильные определяют:

1)  инфицированность дрожжей;

2)  общее количество клеток в 1 см3 среды;

3)  количество почкующихся клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

4)  количество мертвых клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

5)  морфологические характеристики и физиологическое состояние дрожжей (величину клеток, состояние протоплазмы, наличие вакуолей и включений);

6)  соотношение гликогенсодержащих клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения).

Контрольные показатели при микроскопической оценке засевных дрожжей следующие:

– количество почкующихся дрожжей – 15…25 %;

– количество мертвых клеток – 0,5…1 %;

– посторонних микроорганизмов – не более 1…2 клеток в поле зрения;

– клеток физиологически молодых – 20…25 %.

При определении степени инфицирования культуры количество посторонних микроорганизмов просчитывают не менее чем в пяти полях зрения.

3.1.1 Определение степени инфицированности дрожжей

В нескольких каплях стерильной воды размешивают петлю дрожжей. Для приготовления препарата каплю дрожжевой суспензии из средней пробы наносят на предметное стекло, добавляют каплю
метиленового синего и готовят препарат раздавленная капля. При микроскопировании не должны быть обнаружены подвижные формы
бактерий, микромицетов и диких дрожжей, неподвижные кислотообразующие бактерии допускаются в количестве не более 1…3 штук в поле зрения микроскопа.

Большее количество бактериальных клеток свидетельствует о наличии инфекции, которая может привести к значительному нарастанию кислотности сусла, так как бактериальная инфекция зрелых дрожжей обычно бывает кислотообразующей.

3.1.2 Определение общего количества дрожжевых клеток

Общее количество засевных дрожжей определяют методом прямого подсчета их в счетных камерах.

Перед взятием пробы дрожжи в дозаторе тщательно перемешивают, отбирают среднюю пробу, а из нее 10 см3 среды. Пробу, не фильтруя, разводят в 10 раз водой и тщательно взбалтывают в течение 1 мин. Затем тонкой пипеткой отбирают небольшую каплю дрожжевой суспензии и наносят ее на среднюю пластину камеры.

Подсчет дрожжевых клеток производят немедленно после отбора пробы, иначе количество дрожжевых клеток не будет соответствовать истинному.

Хорошие засевные дрожжи должны содержать 120…160 млн клеток в 1 см3 дрожжевой суспензии.

3.1.3 Определение количества почкующихся и мертвых

дрожжевых клеток

На предметное стекло наносят каплю дрожжей и каплю раствора метиленового синего (1:5000), накрывают покровным стеклом и отбирают излишек жидкости фильтровальной бумагой. Через две минуты препарат микроскопируют, подсчитывая количество всех дрожжевых клеток в поле зрения микроскопа, затем количество почкующихся клеток, затем только синих (мертвых – оболочка мертвых клеток пропускает краситель).

Подсчет повторяют не менее чем в пяти полях зрения микрос-копа.

Количество почкующихся и мертвых клеток выражают в %.

3.1.4 Определение физиологического состояния дрожжей

Вид дрожжевых клеток меняется в зависимости от возраста и условий выращивания.

Физиологически молодая дрожжевая клетка характеризуется наличием тонкой клеточной оболочки, гомогенной (однородной) протоплазмы, практически не содержащей вакуолей. Протоплазма плотно прилегает к оболочке клетки.

По количеству и величине вакуолей можно судить о возрасте дрожжевой клетки: количество и объем их увеличивается по мере созревания и у старой культуры занимает почти всю клетку.

Ослабленные и мертвые клетки обычно меньшего размера, темные, окрашенные, у клеток, подверженных лизису, нарушена оболочка, протоплазма окрашена и отходит от клеточной стенки.

Размножающаяся физиологически молодая культура дрожжей должна содержать не менее 25 % почкующихся клеток.

3.1.5 Определение гликогена в дрожжевых клетках

Гликоген – запасное питательное вещество дрожжей, содержание его в дрожжевой клетке непостоянно и изменяется в зависимости от ее возраста и состояния. В молодых клетках гликоген отсутствует, они окрашиваются йодом в светло-желтый цвет. По мере созревания дрожжей количество гликогена растет и к моменту сбраживания 2/3 сахаров сусла (когда засевные дрожжи готовы к инокуляции), его количество максимально. В нормальных зрелых дрожжах гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объема клетки и имеет вид красно-коричневых включений. Если гликогена меньше 1/4 объема клетки, его содержание считают недостаточным, а дрожжи – перезревшими или плохо упитанными (голодными). В 70 % зрелых производственных дрожжей должен содержаться гликоген.

Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю дрожжей и 2…3 капли 0,5 %-ного раствора йода. Капли смешивают, покрывают покровным стеклом, удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой.

Через 2…3 минуты цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, гранулы гликогена – в красно-коричневый.

3.2 Определение процентного содержания сахаромицетов
и посторонних микроорганизмов (упрощенный метод)

Пастеровской петлей, предварительно прокаленной и охлажденной, захватывают комочек дрожжей из середины брикета, переносят в 10 мл стерильной воды и тщательно размешивают.

В три стерильные чашки Петри заранее стерильно разлить нужную питательную среду, каждую чашку накрыть стерильным картонным кружком, затем крышкой. После застывания агара чашки перевернуть. Выдержать 5 мин. В перевернутом состоянии чашку поднять, быстро снять крышку, вытряхнуть картонный кружок и закрыть крышку.

Затем стерильной пипеткой внести 1 каплю дрожжевой суспензии на поверхность питательной среды и растереть каплю шпателем
Дригальского. Этим же шпателем остатки материала распределить на поверхность двух оставшихся чашек по методу истощающего посева.

Таким образом произвести посевы на питательную среду из гидролизата рыбной муки. Засеянные чашки поместить в термостат при температуре 30 ºС на 48 часов.

Выросшие колонии подсчитать в тех чашках, где их не более 50 и не менее 20. Рассчитать соотношение основной культуры и посторонних микроорганизмов.

3.2.1 Выявление общего количества бактерий методом высева

на твёрдые питательные среды с нистатином

Общее количество бактерий определяют методом -новой. Метод заключается в высеве на среды с нистатином. В качестве среды можно использовать дрожжевой агар с 4 % сахарозы, либо сусло-агар с 12 % сухих веществ.

Нистатин представляет собой антибиотик, обладающий ингибирующим действием на дрожжи и сильным противогрибковым действием, при этом он не влияет на рост бактериальной микрофлоры.

Колонии бактерий могут быть сухие, морщинистые или слизистые, плоские или бугристые, компактные или расплывчатые, крупные, беловато - или светло-коричневого цвета. Под микроскопом видны палочки, расположенные по одиночке или цепочками; при окраске бывают видны споры внутри клеток (в центре или на конце), а также неокрашенные овальные или круглые тельца (зрелые споры).

Концентрация нистатина, полностью подавляющая рост дрожжей и дрожжеподобных грибов, равна 20 ед./1 см3 среды (при низкой активности антибиотика до 40…60 ед./1 см3).

Нистатин выпускается промышленностью с активностью, равной 2000…3000 ед./1 мг. Имеется две формы нистатина – водорастворимая и спирторастворимая; применять можно и ту и другую форму антибиотика, в первом случае – в виде водной суспензии, во втором – в виде спиртового раствора.

Нистатин нестоек при повышенной температуре и на свету, поэтому его нельзя стерилизовать, но он обычно выпускается стерильным. Хранить нистатин необходимо в темном, холодном месте. В таком виде он сохраняет активность около года. Растворы нистатина нестойки и могут храниться в холодном месте 2…3 суток, затем их активность снижается.

Готовится раствор или суспензия антибиотика в стерильной воде с таким расчетом, чтобы в 0,04 см3 (1 капле) раствора содержалась фунгицидная концентрация, достаточная для подавления роста дрожжей в 1 чашке Петри (в 25 см3 среды).

Примерное количество нистатина можно брать без взвешивания стерильным скальпелем.

В стерильные чашки Петри внести 0,1 см3 раствора антибиотика и далее все операции проводить как обычно. Используют питательную среду из гидролизата рыбной муки. Выращивают посевы при температуре 30 ºС в течение 48 часов. Выросшие колонии подсчитать в тех чашках, где их не более 50 и не менее 20. Рассчитать соотношение количества дрожжей и бактерий.

3.2.2 Выявление кислотообразующих бактерий

Произвести посевы на питательную среду из гидролизата рыбной муки. Засеянные чашки поместить в термостат при температуре 30 ºС на 48 часов.

Выросшие колонии подсчитать в тех чашках, где их не более 50 и не менее 20. Рассчитать соотношение основной культуры и кислотообразующих бактерий.

3.2.3 Выявление спорообразующих бактерий

Для выявления спорообразующих бактерий пробирку с суспензией дрожжей выдерживают 10 мин в кипящей водяной бане, после чего проводят поверхностный истощающий посев. Используют питательную среду из гидролизата рыбной муки.

Выросшие колонии подсчитать в тех чашках, где их не более 50 и не менее 20.

4 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСЛОВИЙ НЕПРЕРЫВНОГО
ДРОЖЖЕГЕНЕРИРОВАНИЯ

4.1 Приборы, реактивы, материалы

1) Качалка лабораторная;

2) баня водяная;

3) рефрактометр;

4) рН-метр;

5) сахарометр;

6) счетная камера Горяева;

7) колба плоскодонная на 500 мл – 2 шт;

8) марля медицинская;

9) бумага фильтровальная;

10) дрожжи хлебопекарные прессованные или сушеные;

11) жидкая питательная среда (синтетическая или натуральная) – 500 мл. Среда указывается преподавателем. Приготовление, реактивы и материалы см. п. 4.2.

4.2 Приготовление питательной среды

4.2.1 Синтетическая питательная среда на основе глюкозы

Состав питательной среды, г/л:

– глюкоза – 50,0;

– NH4H2PO4 – 2,0;

– KCl – 0,5;

– MgSO4´7H2O – 0,25;

– FeSO4 – 0,15;

– MnSO4 – 0,015;

– дрожжевой автолизат – 10 мл.

Среду стерилизовать 10 мин при 1 атм.

Приготовление дрожжевого автолизата. Дрожжевой автолизат используют как источник витаминов, аминокислот и других факторов роста, в частности, пуринов и пиримидинов. 40 г прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают 100 мл воды. Перемешивают до получения гомогенной массы, добавляют несколько кристаллов тимола или 1…2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50…55 ºС трое суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки и другие сложные вещества. Полученный автолизат хорошо перемешивают и кипятят 20 мин на слабом огне для свертывания нерасщепившихся белков и лучшего фильтрования. Фильтруют дрожжевой автолизат через бумажный фильтр, используя воронку Бюхнера. Фильтрат разливают в пробирки, стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Хранят в холодильнике.

4.2.2 Неохмеленное пивное сусло

В сусле содержатся аминокислоты, элементы нуклеиновых кислот, витамины (в основном группы В), безазотистые органические кислоты, минеральные соли, большое количество углеводов (до 20 %, из которых 80 % составляет мальтоза).

Применяют солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. 250 г солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48…50 ºС и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру постепенно повышают до 55…58 ºС и поддерживют ее на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т. е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и полипептидов. Экстракт отфильтровывают через вату или бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию сахаров, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (ºБ) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в растворе. Концентрация сахаров в свежеприготовленном сусле обычно достигает 16…18 ºБ. Для культивирования дрожжей используется сусло с концентрацией 6…8 ºБ. Сусло стерилизуют 20…30 мин при 0,5 атм.

Для лучшего роста к суслу добавляют 2 % дрожжевого автоли-зата.

4.2.3 Мелассное сусло

Мелассу взвешивают на технических весах, смешивают с водой в соотношении 1:3 и нагревают до температуры 75 ºС, затем насыпают 4 % суперфосфата и повышают температуру до 85 ºС при постоянном помешивании. Для подщелачивания используют 33 %-ный раствор гидроксида натрия, который вносят в количестве 0,8 % от объема исходной мелассы. Перед внесением щелочь разбавляют водой в 10…15 раз. После добавления щелочи к нагретой мелассе происходит выпадение осадка трикальцийфосфата, который увлекает за собой коллоиды мелассы и более крупные частицы, осадок быстро оседает на дно и
меласса осветляется. После этого к мелассе добавляют 2,5 % сернокислого аммония и 2 % суперфосфата в виде вытяжки (1 г суперфосфата
и 10 мл воды нагревают до кипения и фильтруют через бумажный фильтр) либо 1 % диаммонийфосфата, уменьшив соответственно
дозировку сульфата аммония. Мелассу перемешивают с питательными солями и фильтруют через бумажный фильтр на воронке Бюхнера.

Осветленную мелассную среду разводят водой до требуемой концентрации 5…8 % СВ по сахарометру и разливают в посуду. Мелас-сное сусло стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

4.2.4 Натуральная питательная среда на основе варенья

Варенье (любое) растворить в холодной воде. Массовая доля сухих веществ в полученном растворе должна составлять 8…10 %, объем раствора 500 мл. Раствор профильтровать через марлевый и бумажный фильтры, прокипятить, охладить до 30 ºС, разлить в две колбы по 250 мл и использовать в качестве питательной среды.

4.3 Ход эксперимента

Культивирование осуществляется в лабораторном культиваторе периодическим способом при температуре 28…30 ºС, постоянной аэрации и перемешивании. Начальный засев 0,5…1,0 % сушеных дрожжей или 1…3 % прессованных. Указывают расу дрожжей, их влажность в прессованном состоянии, возраст. Также указывают, из какого сырья получено сусло, его концентрацию и рН.

Микробиологические и физико-химические показатели в среде измеряют с шагом 30 мин в течение 5 часов. Концентрацию сусла определяют сахарометром при 20 ºС, рН – потенциометрически. Концентрацию дрожжевых клеток (млн КОЕ /мл) определяют с помощью камеры Горяева методом прямого подсчета.

Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях). Метод имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах производится учет всех клеток микроорганизмов без диффереренциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе 8…40 х.

Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные площадки. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рисунок 4.1а). Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рисунок 4.1б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла.

а – вид сверху; б – вид сбоку;

в – вид при малом увеличении микроскопа

Рисунок 4.1 – Счетная камера Горяева

Сетка разделена на определенное количество больших и маленьких квадратов, по разному сгруппированных (рисунок 1в).

Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат (АВСD), сторона которого равна 1/20 мм (0,05 мм), площадь его 1/400 мм2 (0,0025 мм2), а объем при высоте камеры 1/10 мм (0,1 мм) – 1/4000 мм3 (0,00025 мм3) или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСD состоит из 16 малых квадратиков.

Камера Горяева имеет площадь 9 мм2, объем камеры – 9 мм3 и разбит на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду).

Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна быть равномерно без пузырьков распределена по всей сетке, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец.

Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 40 х (в поле
зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов).

Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитываются все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают.

Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в пяти больших квадратах (80 малых) – 240 клеток, тогда в одном малом квадратике среднее количество клеток 240:80 = 3 пересчет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по формуле

где – число клеток в 1 мл суспензии;

– среднее число клеток в малом квадрате;

– глубина камеры, мм;

– площадь малого квадрата, мм2;

– разведение исходной суспензии;

1000 – коэффициент пересчета мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3).

Результаты работы оформляют в виде таблицы (таблица 4.1).

Таблица 4.1 – Количественный учет микроорганизмов

в камере Горяева

Разведение суспензии	Повторность определения	Количество клеток микроорганизмов в пяти больших квадратах счетной камеры	Общее число клеток в 80 малых квадратах	Среднее число клеток в 1 малом квадрате	Количество клеток в 1 мл исходной суспензии
1	2	3	4	5
0	1
2
1:10	1
2

4.4 Обработка результатов эксперимента

По экспериментальным данным строят графики зависимостей концентрации сухих веществ и рН питательной среды от времени. Также строят график динамики накопления биомассы (млн КОЕ/мл) от времени культивирования (ч).

На экспоненциальном участке полученной кривой рассчитывают максимальную удельную скорость роста (ч-1) исследуемого штамма дрожжей по формуле

Полученное таким образом значение максимальной удельной скорости роста дрожжей является основным для выбора условий непрерывного дрожжегенерирования. Известно, что непрерывные процессы культивирования микроорганизмов могут осуществляться стабильно, то есть с постоянной производительностью по биомассе и продуктам биосинтеза, лишь при условии равенства скорости разбавления среды в аппарате удельной скорости роста микроорганизмов .

При этом значение представляет собой отношение скорости протока среды через аппарат к его рабочему объему .

Исходя из вышесказанного оптимальная скорость разбавления, при которой достигается наивысшая продуктивность процесса, определяется условием

.

Используя это уравнение и экспериментальные данные, рассчитывают для дрожжегенератора непрерывного действия с определенным рабочим объемом значение скорости притока свежей питательной среды, оптимальное для данного штамма дрожжей, а также для условий аэрации, температуры и массобмена, при которых проводилось периодическое культивирование.

Для этого используют формулу

где – скорость притока, м3/час;

– рабочий объем дрожжегенератора, м3.

По результатам эксперимента кратко сформулировать вывод и дать практические рекомендации для производства.

5 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРЕССОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ

5.1 Приборы, реактивы, материалы

1) Весы третьего класса точности;

2) сушильный шкаф;

3) эксикатор;

4) металлическая форма для определения подъемной силы дрожжей;

5) бюретка;

6) бюксы металлические или стеклянные;

7) термостат (35 ºС);

8) стаканы стеклянные;

9) дрожжи хлебопекарные прессованные;

10) соль поваренная;

11) мука пшеничная II сорта;

12) вода дистиллированная;

13) гидроксид натрия 0,1 н;

14) фенолфталеин 1 %.

5.2 Теоретическая часть

Товарные хлебопекарные прессованные дрожжи должны соответствовать требованиям ГОСТ 171-81 (таблицы 5.1, 5.2).

Таблица 5.1 – Органолептические показатели качества прессованных дрожжей

Показатель	Характеристика
Цвет	Равномерный, без пятен, светлый, допускается сероватый или кремовый оттенок
Консистенция	Плотная, дрожжи должны легко ломаться и не мазаться
Запах	Свойственный дрожжам, не допускается запах плесени и другие посторонние запахи
Вкус	Свойственный дрожжам, без постороннего привкуса

Таблица 5.2 – Физико-химические показатели качества прессованных дрожжей

Показатель	Норма
Массовая доля влаги, %	не более 75
Подъемная сила (подъем теста до 70 мм), мин	не более 40
Кислотность 100 г дрожжей в пересчете на уксусную кислоту в день выработки, мг	не более 120
Кислотность 100 г дрожжей в пересчете на уксусную кислоту на 12-е сутки хранения при температуре от 0 до +4 ºС	не более 300
Стойкость, ч	не менее 60

На стойкость дрожжей при хранении оказывают влияние ряд факторов:

– влажность (с повышением влажности стойкость снижается);

– содержание резервных углеводов (в первую очередь, трегалозы, а также растворимых фракций гликогена);

– деятельность протеолитических ферментов, в восстановленной форме расщепляющих белки и ведущих к их автолизу;

– деятельность посторонних микроорганизмов.

Важнейшим показателем качества дрожжей является высокая ферментативная активность. Она может быть выражена подъемной силой дрожжей. Это суммарный показатель, являющийся результатом взаимодействия как ферментов дрожжей, так и ферментов муки, взятой для анализа.

По реакции дрожжевой клетки на изменение концентрации компонентов среды дрожжи делят на осмочувствительные и осмоустойчивые. С увеличением в тесте массовой доли сахара и жира возрастает осмотическое давление среды, в которой находятся дрожжи. Только хорошая осмоустойчивость дрожжей обеспечивает требуемый подъем сдобного теста. Дрожжи с осмочувствительностью в пределах 10…15 мин стойки при хранении и пригодны для сушки.

5.3 Физико-химические показатели прессованных дрожжей

(включенные в ГОСТ 171)

5.3.1 Определение массовой доли влаги по арбитражному

методу

Взвешивают две навески дрожжей, по 1,5 г каждая, в заранее высушенные бюксы.

Высушивание проводят в сушильном шкафу при 105 ºС до постоянной массы. Постоянной считают массу, если разница между двумя взвешиваниями не превышает 0,001 г.

Массовая доля влаги () в процентах определяется по формуле

где – масса навески с бюксом до высушивания, г;

– масса навески с бюксом после высушивания, г;

– масса бюкса, г.

5.3.2 Определение подъемной силы

Подъемную силу дрожжей устанавливают двумя методами: по скорости подъема теста в термостате, замешанного по определенной рецептуре и помещенного в формочку определенных размеров и уско­ренный – по скорости всплывания шарика теста.

Техника определения первого метода заключается в следующем.

280 г хлебопекарной пшеничной муки II сорта, 160 мл 2,5 %-ного раствора NaCl и металлическую форму, смазанную маслом, прогре­вают в термостате при 35 °С. Форма должна иметь в продольном и по­перечном разрезах трапецию следующих внутренних размеров, см: верхние основания 14,3 и 9,2, нижние – 12,6 и 8,5, высота – 8,5. На длин­ные борта ее навешивают поперечную металлическую перекладину, входящую в форму на 1,5 см.

Отвешивают 5 г дрожжей, переносят их в фарфоровую чашку, приливают 15…20 мл 2,5 %-ного раствора NaCl и перемешивают до ис­чезновения комочков. Разведенные дрожжи переносят в эмалирован­ную чашку, смывая постепенно оставшимся раствором NaCl. Затем добавляют муку и начинают замес. Вымешивают 5 мин.

Затем тесто переносят в форму, навешивают перекладину и ста­вят форму в термостат с температурой 35 °С.

Подъемная сила дрожжей характеризуется временем, прошед­шим с момента внесения теста в форму до момента прикосновения его к нижнему краю перекладины, т. е. подъемом на высоту 70 мм.

Ускоренный метод

Отвешивают 0,31 г дрожжей, переносят их в фарфоровую чашку и приливают 4,8 мл 2,5 %-ного NaCl, нагретого до 36 ºС, перемешивают. К полученной смеси добавляют 7 г муки, замешивают тесто и придают ему форму шарика. Шарик опускают в стакан с водой, нагретой до температуры 35 ºС, и помещают в термостат с той же температурой.

Подъемная сила характеризуется временем, прошедшим с момента опускания шарика в воду до момента его всплытия. Время подъема шарика в минутах умножают на коэффициент 3,5.

5.3.3 Определение кислотности арбитражным методом

Навеску дрожжей 10 г растирают в стакане с 50 мл дистиллированной воды и титруют 0,1 н раствором едкого натра в присутствии индикатора фенолфталеина до появления розового окрашивания.

Кислотность дрожжей (мг на 100 г), рассчитывают по формуле

где – количество раствора едкого натра, пошедшее на нейтрализацию пробы, мл;

6 – количество уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н раствора едкого натра, мг.

5.3.4 Определение стойкости

Стойкость дрожжей выражают в часах. Это время, прошедшее с момента помещения дрожжей в термостат с температурой 35 ºС до их полного размягчения.

Пачку дрожжей (1 кг), предварительно охлажденную до температуры 4 °С, помещают в термостат с температурой 35 °С и хранят до полного размягчения.

5.3.5 Определение осмочувствительности

Под осмочувствительностью понимают способность дрожжей не снижать ферментативную активность в среде с повышенным осмотическим давлением.

Метод определения осмочувствительности основан на сравнительной оценке подъемной силы в тесте без соли и в тесте с повышенным содержанием соли. Разница в подъемной силе дрожжей, в зависимости от осмотического давления среды, выраженная в минутах, характеризует осмочувствительность.

Для определения осмочувствительности отвешивают две навески дрожжей по 0,31 г каждая.

К первой навеске добавляют 4,8 мл водопроводной воды с температурой 35 ºС и 7 г муки, замешивают тесто и формируют его в виде шарика. Ко второй навеске дрожжей добавляют 4,8 мл 3,35 %-ного раствора хлористого натрия и 7 г муки. Формируют шарик. Обе навески опускают в стакан с теплой водой. Отмечают время, которое потребовалось шарикам для всплытия. Это время умножают на коэффици-ент 3,5.

Разница между полученными значениями подъемной силы для теста без соли и теста с повышенным содержанием соли равна осмочувствительности дрожжей.

6 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СУШЕНЫХ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ

6.1 Приборы, реактивы, материалы

1) Весы третьего класса точности;

2) сушильный шкаф;

3) эксикатор;

4) металлическая форма для определения подъемной силы дрожжей;

5) бюретка;

6) термостат (35 ºС);

7) бюксы металлические или стеклянные;

8) стаканы стеклянные;

9) дрожжи хлебопекарные сушеные;

10) соль поваренная;

11) мука пшеничная II сорта;

12) вода дистиллированная;

13) гидроксид натрия 0,1 н;

14) раствор фенолфталеина 1 %-ный;

15) формалин;

16) метиленовый синий по Лёффлеру;

17) 0,5 %-ный раствор йода.

6.2 Теоретическая часть

Прессованные дрожжи как скоропортящийся продукт непригодны для дальних перевозок и длительного хранения. Чтобы решить эту проблему производят сушеные дрожжи.

Сушеные дрожжи имеют влажность 8…10 %, благодаря этому могут храниться длительное время. Качество сушеных дрожжей зависит от исходного качества прессованных дрожжей, а также режимов сушки.

Хорошие сушеные дрожжи можно получить из прессованных дрожжей, имеющих следующие показатели:

– содержание сухих веществ – 30 %;

– содержание трегалозы – 11…12 %;

– подъемная сила – 35…40 %;

– стойкость при хранении – 72 ч;

– выживаемость клеток при высушивании – не менее 70 %.

Оптимальным режимом сушки, позволяющим максимально сохранить первоначальную ферментативную активность прессованных дрожжей, является интенсивный отвод влаги. Высушивание происходит тем быстрее, чем больше площадь соприкосновения сушильного агента с высушиваемым материалом, выше температура теплоносителя, ниже его влажность, больше скорость движения.

По показателям качества сушеные хлебопекарные дрожжи выпускаются двух сортов (таблица 6.1).

Таблица 6.1 – Качество сушеных хлебопекарных дрожжей

Сорт	Показатели
Влажность, %	Подъемная сила, мин	Стойкость при хранении, мес.
высший	8	70	12
первый	10	90	5

6.3 Физико-химические показатели сушеных дрожжей

6.3.1 Определение массовой доли влаги

В предварительно высушенные и взвешенные бюксы взвешивают навески сушеных дрожжей (по 2 г) и высушивают до постоянной массы при 105 ºС. Массовую долю влаги в процентах определяют по формуле

где – масса навески с бюксом до высушивания, г;

– масса навески с бюксом после высушивания, г;

– масса бюкса, г.

6.3.2 Определение подъемной силы

В стаканчик взвешивают 2,5 г сушеных дрожжей, добавляют к ним 30 мл водопроводной воды, нагретой до температуры 35 ºС. Смесь помещают в термостат при той же температуре на 30 минут. Затем размноженные дрожжи смешивают с 15 г пшеничной муки II сорта и вновь ставят в термостат на 2 часа.

Одновременно в термостат помещают 265 г муки того же сорта, 130 мл воды, в которой растворено 4 г NaCI, и стандартную форму, смазанную растительным маслом.

Через 2 ч производят замес теста в течение 5 мин, затем перено­сят его в форму и далее поступают так же, как при определении подъ­емной силы прессованных дрожжей.

6.3.3 Определение стойкости при хранении

Взвешивают 0,5 г сушеных дрожжей, помещают их в колбу на 250 мл, приливают 100 мл дистиллированной воды и оставляют в покое на 30 минут при комнатной температуре.

Далее содержимое колбы перемешивают и титруют 0,1 н раствором едкого натра в присутствии индикатора фенолфталеина до слабо-розового окрашивания. Затем туда же добавляют 5 мл 40 %-ного нейтрального формалина и вновь титруют до слабо-розового окрашивания.

Общее количество 0,1 н раствора едкого натра, затраченное на оба титрования, является величиной показателя «сумма кислот», вымытых из клеток в силу увеличения проницаемости клеточных оболочек во время высушивания.

Стойкость дрожжей при хранении определяют в зависимости от показателя «сумма кислот» по таблице 6.2.

Таблица 6.2 – Определение стойкости сушеных дрожжей

Длительность хранения дрожжей, мес.	Сумма кислот, мл, 0,1 н раствора гидроксида натрия
Более 12	до 1,1
6…12	1,1…1,3
4…5	1,4…1,5
Не более 3	1,6…1,7
Хранению не подлежат	более 1,7

6.4 Микробиологические показатели сушеных дрожжей

6.4.1 Перечень исследований

При проведении микробиологического контроля сушеных дрожжей оценивают их физиологическое состояние на всех технологических стадиях производства. Микроскопирование производят методом раздавленной капли с прижизненной окраской метиленовой синью или применяют окрашенные фиксированные препараты.

При микробиологическом контроле определяют:

1) инфицированность дрожжей;

2)  количество почкующихся клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

3)  количество мертвых клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения);

4)  морфологические характеристики и физиологическое состояние дрожжей (величину клеток, состояние протоплазмы, наличие вакуолей и включений);

5)  соотношение гликогенсодержащих клеток (в % к общему количеству клеток дрожжей в пяти полях зрения).

6.4.2 Определение количества отмерших клеток

Отобранную для анализа пробу сушеных дрожжей (0,1 г) вносят в пробирку со стерильным солодовым суслом плотностью 8 % СВ. Пробирку ставят в термостат при температуре 30 ºС на 4 часа. За это время все жизнеспособные клетки, содержащиеся в пробе, успевают выйти из состояния анабиоза и начинают почковаться. Из подмоложенных дрожжей приготавливают препарат, который окрашивают разбавленным раствором метиленового синего по Лёффлеру. Приготовленный препарат просматривают под микроскопом при увеличении в 400…600 раз. Отмершие клетки окрашиваются в синий цвет, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана клетки свободно пропускают краску, ожившие клетки остаются бесцветными.

Просчитывают пять полей зрения, в каждом из которых подсчитывают общее количество клеток и отдельно считают окрашенные. Вычисляют количество отмерших клеток по отношению к общему количеству, материнскую клетку с неотделившейся почкой считают за одну клетку.

Активные сушеные дрожжи должны содержать не более 30 % отмерших клеток.

Остальные исследования микробиологических показателей проводят согласно п. 3.1

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Приготовление реактивов

Метиленовый синий (или метиленовый голубой) по Лёффлеру

К 100 мл 96 %-го этилового спирта прибавляют 10 г метиленовой сини (в порошке) и оставляют на 1…2 сут в термостате при 37 ºС. Периодически склянку с красителем встряхивают.

К 30 мл насыщенного раствора добавляют 100 мл 0,01 %-ного раствора гидроксида калия, подогретого до 37 ºС. Этот раствор теплым профильтровать.

При таком способе приготовления не образуется мелких кристаллов красителя.

Реактив Грисса

Раствор 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты. Добавляют 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор устойчив в течение месяца.

Раствор 2: 0,1 г α-нафтиламина растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды. Остужают и добавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор α-нафтиламина фильтруют и хранят не более недели.

До момента употребления растворы хранятся отдельно в темных склянках. Перед употреблением растворы смешивают в равных частях.

Приготовление реактива Грисса из сухого препарата: отвешивают 1 г препарата и растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

1 %-ный раствор фенолфталеина

В интервале рН 8,2…10,0 окраска изменяется от бесцветной к красно-фиолетовой.

1 г препарата растворяют в 80 мл этилового спирта и доводят объем раствора водой до 100 мл.

0,5 %-ный раствор йода

0,5 г металлического йода и 1 г йодида калия (KJ) растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят раствор во флаконе из темного стекла с плотно притертой крышкой.

ЛИТЕРАТУРА

1. Новаковская, технолога дрожжевого производства / .– М.: Пищевая промышленность, 1972. – 289 с., ил.

2. Крикунова, указания к выполнению лабораторных работ по технологии хлебопекарных дрожжей (для студентов специальности 2705.00 и 2705.03) / , , . – М.: Издательский комплекс МГУПП, 1998. –
37 с.

3. Римарева, контроль спиртового и ферментного производств / , . – М.: Россельхозакадемия, 2005. – 200 с.

4. Практикум по микробиологии: учебное пособие / под ред.
. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. – 307 с.

5. Градова, практикум по общей микробиологии / [и др.]. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 131 с.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………...	3
1 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. ПОДГОТОВКА СРЕД И ПОСУДЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕЛАССЫ И ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ………………………………………………………...…	4
1.1 Приборы, реактивы, материалы ………………………....	4
1.2 Подготовка и стерилизация питательных сред................	5
1.2.1 Среды на основе дрожжевой воды……………….	5
1.2.2 Твердые питательные среды для исследования микробиологических показателей мелассы..…………	5
1.2.3 Твердые питательные среды для исследования микробиологических показателей хлебопекарных дрожжей............................................................................	6
1.3 Подготовка и стерилизация посуды..………………..…...	7
2 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСЛЕДОВАНИЯ МЕЛАССЫ……………………………………...	8
2.1 Теоретическая часть ……………………………………...	8
2.2 Определение общего количества микроорганизмов……	11
2.2.1 Приготовление проб для анализа………………...	11
2.2.2 Метод предельных разбавлений …………………	11
2.3 Определение основных групп микроорганизмов мелассы……………………………………………………...…	12
2.3.1 Выявление несовершенных дрожжей……………	12
2.3.2 Определение количества кислотообразующих бактерий………………………………………………….	12
2.3.3 Исследование мелассы на слизеобразующие кокки……………………………………………………...	13
2.3.4 Определение количества протеолитических бактерий………………………………………………….	13
2.3.5 Определение количества спорообразующих бактерий высевом из прогретых проб…………………	13
2.3.6 Биологическая проба на наличие нитритобразующих бактерий…………………………..	13
3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ДРОЖЖЕЙ...............................................................…	15
3.1 Микроскопирование……………………………………....	15
3.1.1 Определение степени инфицированности дрожжей……………………………………………….….	15

3.1.2 Определение общего количества дрожжевых клеток…………………………………………………….	16
3.1.3 Определение количества почкующихся и мертвых дрожжевых клеток……………….....................	16
3.1.4 Определение физиологического состояния дрожжей…………………………………………………..	16
3.1.5 Определение гликогена в дрожжевых клетках….	17
3.2 Определение процентного содержания сахаромицетов и посторонних микроорганизмов (упрощенный метод)……....	17
3.2.1 Выявление общего количества бактерий методом высева на твёрдые питательные среды с нистатином……………………………………………....	18
3.2.2 Выявление кислотообразующих бактерий……....	19
3.2.3 Выявление спорообразующих бактерий……........	19
4 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСЛОВИЙ НЕПРЕРЫВНОГО ДРОЖЖЕГЕНЕРИРОВАНИЯ………………..	20
4.1 Приборы, реактивы, материалы……………………..	20
4.2 Приготовление питательной среды…………………	20
4.2.1 Синтетическая питательная среда на основе глюкозы…………………………………………….…….	20
4.2.2 Неохмеленное пивное сусло………………..……..	21
4.2.3 Мелассное сусло………………………………..….	21
4.2.4 Натуральная питательная среда на основе варенья…………………………………………………....	22
4.3 Ход эксперимента………………………………………….	22
4.4 Обработка результатов эксперимента………………..…..	25
5 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРЕССОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ…………………..………………………………………..	26
5.1 Приборы, реактивы, материалы. …………………………	26
5.2 Теоретическая часть. …………………………………...…	26
5.3 Физико-химические показатели прессованных дрожжей (включенные в ГОСТ 171)………………………………….....	27
5.3.1 Определение массовой доли влаги по арбитражному методу…………………………………...	27
5.3.2 Определение подъемной силы ………………	28
5.3.3 Определение кислотности арбитражным методом…………………………………………………..	29
5.3.4 Определение стойкости………………………...…	29
5.3.5 Определение осмочувствительности………….….	29

6 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СУШЕНЫХ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ…………………….	30
6.1 Приборы, реактивы, материалы………………….……….	30
6.2 Теоретическая часть. …………………………………...…	30
6.3 Физико-химические показатели сушеных дрожжей…….	31
6.3.1 Определение массовой доли влаги…………….…	31
6.3.2 Определение подъемной силы……………………	31
6.3.3 Определение стойкости при хранении…………...	32
6.4 Микробиологические показатели сушеных дрожжей…..	32
6.4.1 Перечень исследований……………………...……	32
6.4.2 Определение количества отмерших клеток……...	33
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Приготовление реактивов………………….…	34
ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………….…	35

Учебное издание

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ДРОЖЖЕЙ

Лабораторный практикум

для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных
производств и виноделие» и 240901 «Биотехнология»

всех форм обучения

Редактор

Технический редактор

Подписано в печать 29.01.10. Формат 60´84 1/16

Усл. п. л. 2,27. Уч.-изд. л. 2,44

Печать – ризография, множительно-копировальный

аппарат «RISO TR -1510»

Тираж 50 экз. Заказ 2010-19

Издательство Алтайского государственного

технического университета

г. Барна

Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ

Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ

7