На правах рукописи |
ВОЙТОВА
КСЕНИЯ ВАСИЛЬЕВНА
ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Новосибирск – 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.
Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук, профессор |
Официальные оппоненты: | доктор ветеринарных наук, профессор |
кандидат ветеринарных наук | |
Ведущая организация: | ГНУ Всероссийский научно-исследова-тельский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук |
Защита состоится « 24 » мая 2011 г. в «12-00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (3–44–62.
С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «___» ________ 2011 г.
 |
Ученый секретарь
диссертационного совета
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Респираторные болезни являются важной причиной экономического ущерба в молочном скотоводстве. Они приводят к падежу или снижению скорости роста животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия ( и соавт., 1976; и соавт., 2000; , 2002; и соавт., 2002; и соавт., 2003; и соавт., 2008; , 2009; D. G. Bryson, 2000; K. A. Brogden et al., 2002).
Одним из этиологических агентов респираторных болезней является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота (РСИ КРС) регистрируется во всех странах мира с интенсивным типом ведения животноводства
(M. Elvander, 1996; L. E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; A. F. Antonis et al., 2010; B. W. Brodersen, 2010; C. Luzzago et al., 2010). Первые сообщения о ней в нашей стране относятся к 1975 году ( и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы (1976), и соавт. (1988), (1989), (2004), (2008) и других исследователей.
В настоящее время актуальным является изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в хозяйствах по производству молока, особенно с наличием импортированного скота, а также разработка эффективных методов диагностики болезни с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий.
Вирусологическая диагностика болезни малоэффективна, поэтому преимущество имеют молекулярные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (E. J. Dubovi, 1993; J.-F. Valarcher et al., 2007). Разработка ОТ-ПЦР для выявления РСВ КРС во многих странах началась в конце прошлого столетия. В литературе имеются сообщения о выявлении вируса в пробах биоматериала от больных животных (S. Vilcek et al., 1994; L. E. Larsen et al., 1999; V. Valentová et al., 2003; R. S. Almeida et al., 2005; M. Boxus et al., 2005; J.-F. Valarcher et al., 2007; E. Timsit et al., 2009; O. Angen et al., 2009).
На момент начала наших исследований в РФ законченных разработок в этом направлении не было.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка полимеразной цепной реакции для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение ее диагностической и экономической эффективности.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири с учетом наличия в них импортированного и местного скота по результатам серологических исследований;
2. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ОТ-ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также – влияние сроков хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах на пригодность к исследованию в ОТ-ПЦР;
3. Изучить диагностическую и экономическую эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях, установить частоту выявления РСВ в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.
Научная новизна. Показано широкое распространение РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. Разработана ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F, показана ее высокая эффективность при диагностике болезни в производственных условиях. Определены оптимальные сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования ОТ-ПЦР в диагностике РСИ КРС в качестве основного вирусологического метода в комплексе с серологическими исследованиями, что будет способствовать оптимизации противоэпизоотических мероприятий.
Материалы диссертации представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли РСВ в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций: «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол от 01.01.2001 г.)
Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).
Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на: международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИиТИБП, «Научные основы производства биологических препаратов», Щелково, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; XIV международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России», посвященной 80-летию УГАВМ, Троицк, 2009; VI международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии, «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010; XIII международной научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Новосибирск, 2010; VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010 г.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована одним рисунком и 10 таблицами. Список литературы включает 246 источников, в том числе 188 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Результаты изучения распространения и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него;
2. Результаты разработки и изучения эффективности полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для диагностики РСИ КРС в производственных условиях.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 2008–2011 гг. в лаборатории биотехнологии – диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.
Изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в Сибири. В связи с тем, что плановые исследования на вирусные инфекции не предусмотрены нормативной документацией, при изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований.
Исследовали 538 проб сыворотки крови от телят до 6-месячного возраста, 584 пробы от нетелей, телок и коров. Постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) проводили с помощью набора для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (, Москва).
При изучении распространения болезни использовали серологический метод. Исследовали пробы сыворотки крови, отобранные от животных однократно. Высчитывали средний процент проб, содержащих антитела к вирусу, от числа поступивших из хозяйств с наличием или отсутствием вспышек респираторных болезней.
С целью установления сероконверсии к вирусу, свидетельствующей об его активной циркуляции, исследовали парные пробы сыворотки крови телят, нетелей и коров, отобранные с интервалом 30 дней. Полученные пробы хранили при минус 20ºС и исследовали одновременно.
Исследования проводили в 27 хозяйствах трех регионов Сибири: Тюменской и Новосибирской областей и Красноярского края с наличием или отсутствием импортного скота.
Праймеры для ОТ-ПЦР. Поиск праймеров осуществляли на основе анализа полного генома штамма РСВ КРС А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/GenBank/GenBankSearch. html), при помощи пакета программного обеспечения “Lasergen”, Alignment-serves и CLUSTAL. Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F, обладающего высокой консервативностью. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе “Vector NTI Suitе” с последовательностями генома вируса парагриппа-3 (ПГ-3) КРС.
Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.
ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик». Продукты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор-UVT-1». Положительными считались пробы, дающие полосу фрагмента кДНК, соответствующую 381 п. н. Исследования проводили в трех повторностях.
Штаммы и изоляты вирусов. В работе использовали два штамма РСВ КРС: РС-Б № 3, представленный проф. , и К-18, выделенный в ГНУ ИЭВСиДВ.
В опытах по изучению специфичности ОТ-ПЦР дополнительно использовали вирус ПГ-3 (штамм ПТК), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (штамм ВК-1), вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм), герпесвирус КРС 1-го типа (штамм Оренбург), аденовирус КРС 1 типа (штамм BV-10), риновирус КРС 1-го типа (штамм SD-1), неинфицированные культуры клеток Vero и ТЭБ.
Выделение РНК и получение кДНК вируса. Выделение РНК вируса осуществляли стандартным способом с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили при помощи коммерческого набора «Реверта-L» производства того же института. В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [pH 8.3], 3 мМ MgCl2, 75 mM KC1, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ), и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат при 37ºС на 30 минут. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ОТ-ПЦР.
Проверка чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР. Для определения чувствительности реакции контрольный штамм вируса РСБ № 3 титровали методом 10-кратных разведений до 10–7 ТЦД50/мл, каждое разведение исследовали в ОТ-ПЦР. Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами.
Для изучения эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях исследовали 273 пробы биоматериала. В том числе: 45 проб носовых выделений, 24 – трахеального и бронхиального экссудатов, 180 – бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы биоматериала транспортировали в лабораторию в замороженном состоянии или в транспортной среде в течение не более 24 часов с момента их отбора. При отсутствии возможности доставки проб в течение указанного срока, их замораживали однократно и транспортировали в лабораторию в термосе со льдом.
Пробы органов и тканей перед исследованием растирали в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10%-ые суспензии на физиологическом растворе, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученные суспензии исследовали в ОТ-ПЦР. Смесь переносили в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветленного супернатанта. Густые пробы носовых выделений и экссудата разводили стерильным физиологическим раствором (примерно 1:5). Полученную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.
Изучение влияния сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР. Полученные суспензии внутренних органов, а также выделенной РНК, фасовали в пластиковые пробирки, помещали на длительное хранение при плюс 4ºС и минус 18ºС. Срок наблюдения составлял 12 месяцев. Через каждые 30 дней пробы извлекали и подвергали исследованию в ОТ-ПЦР.
Бактериологические исследования. Выделение и типизацию бактерий сем. Pasteurellaceae проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц (Москва, 1992).
Экономическую эффективность лечебно-профилактических мероприятий определяли согласно методическим рекомендациям по определению экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденным ГУВ МСХ и П РФ 21.02.1997 г. Дополнительно использовали методические рекомендации по оценки социально-экономической эффективности применения метода биочип-диагностики во фтизиатрии (Москва, 2009).
Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05. Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».
Подробные методики исследований приведены по мере изложения материалов собственных исследований в начале соответствующих подразделов.
Личное участие. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д. б.н., профессор , с. н.с. , с. н.с., к. в.н. и , которым автор выражает глубокую благодарность.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС
в хозяйствах региона Сибири
Результаты исследований показали, что в настоящее время РСИ КРС имеет широкое распространение в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства региона Сибири. Однако инфицированность животных по различным административным территориям несколько различается.
Так, серопозитивность животных к вирусу составила в среднем по Тюменской области 66,6%, Новосибирской – 43,8; по Красноярскому краю – 38,4%.
По результатам обследования хозяйств Новосибирской области установили, что у 92,6% телят до 30-дневного возраста отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Серопозитивность телят 1–6-месячного возраста составила 25,5%, а средние титры антител – 2,1±0,33 lg2, телят от 6 месяцев и старше – 50,0% (2,4±0,67 lg2), телок – 66,7% (5,2±0,14 lg2), а коров и быков – 76,3% (4,5±0,09 lg2). Средние титры антител у животных всех половозрастных групп составили 3,02±0,47 lg2.
Инфицированность животных вирусом была выше в хозяйствах Тюменской области, что, возможно, связано с интенсивным типом ведения животноводства (с высокой молочной продуктивностью и концентрацией животных на единицу площади) и наличием импортного скота.
Серопозитивность телят до 30 дней составила 45,7%, а величина средних титров антител – 1,9±0,42 lg2, телят 1–6-месячного возраста – 29,9% (1,81±0,06 lg2), телок – 100% (5,4±0,43 lg2), нетелей – 82,6% (5,1±0,02 lg2), коров и быков – 86,7% (4,8±0,19 lg2). Величина средних титров антител у животных всех половозрастных групп составила 3,8±0,43 lg2.
Более высокая инфицированность животных этого региона связана, вероятно, с более активной циркуляцией вируса среди телок и нетелей, завезенных в хозяйства по импорту (телки – 5,4±0,43 lg2; нетели – 5,1±0,02 lg2).
Особый интерес представляли три крупных хозяйства Красноярского края, куда не было ввоза импортного скота. Серопозитивность животных всех обследованных категорий составила в среднем 38,4%. В том числе: телят до 30 дней – 34,6% с величиной средних титров антител – 2,5±0,72 lg2, телят 1–6-месячного возраста 20,4% (1,5±0,03 lg2). Установлено, что 35,5% телят до 30 дней не имели колостральных антител. Серопозитивность коров составила 75%, однако титры антител к вирусу у них достигали значений 7,4±0,21 lg2, что было выше, чем у животных этой категории в хозяйствах Новосибирской и Тюменской областей (4,5±0,09 lg2 и 4,8±0,19 lg2 соответственно). Разница достоверна при Р<0,05.
Титры антител к вирусу у телят до одного месяца были также выше (2,5±0,72 lg2), чем у животных этих областей (0,9±0,57 и 1,9±0,42 lg2 соответственно). Это можно объяснить тем, что на момент исследований в данных хозяйствах регистрировали вспышки респираторных болезней среди телят до 6-месячного возраста и коров.
Таким образом, уровень серопозитивности к вирусу повышался с возрастом животных, а титры антител достоверно повышались к 12-ти месяцам и старше. Высокие титры антител к вирусу у коров, вероятно, являлись следствием его активной циркуляции среди этой категории животных, являющейся источником возбудителя для неимунных телят.
Сероконверсию (4 – 32-кратное повышение титров антител) к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4–6 месяцев и коров. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).
Течение болезни и характер клинических признаков условно разделили на три формы.
Первая – сверхострая форма инфекции характеризовалась угнетением животного, повышением температуры тела до 42ºС, снижением молочной продуктивности у коров, выделением обильной пены из ротовой полости, хрипами, кашлем, конъюнктивитами и высокой летальностью.
На вскрытии регистрировали интерстициальную пневмонию вплоть до полного разрушения паренхимы, бронхиты, увеличение и геморрагическое воспаление легочных лимфоузлов и легочную или бронхиальную эмфизему. Гибель животных наступала в течение нескольких дней, несмотря на проводимое лечение.
Вторая – острая форма, при которой у животных регистрировали бронхиты и интерстициальную бронхопневмонию. При всех клинических формах течение болезни осложнялось развитием вторичной микрофлоры (пастереллез) с выделением из легких павших и вынужденно убитых животных всех возрастов Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida. На вскрытии выявляли петехиальные кровоизлияния на миокарде и фибринозную бронхопневмонию.
В третьем случае болезнь у животных протекала субклинически.
В некоторых хозяйствах, неблагополучных по бронхопневмониям, произошло наслоение РСИ на хроническое течение сальмонеллеза и диплококковой септицемии у телят. Кроме этого у коров и телят регистрировали инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею-болезнь слизистых оболочек, что было подтверждено вирусологическими и ретроспективными серологическими исследованиями. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был очень высоким (до 128-кратного), что на наш взгляд, свидетельствует о его ведущей роли в этиологии массовых вспышек респираторных болезней.
Таким образом, респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в Сибири и носит энзоотический характер. На характер эпизоотической ситуации и проявления клинических признаков болезни влияет интенсификация молочного животноводства, концентрация животных на ограниченных территориях. Огромное значение имеет ввод новых животных в стадо, особенно поступающих по импорту. В крупных хозяйствах циркуляция вируса может быть непрерывной за счет транзитной инфекции у коров и телят, что обеспечивает постоянный риск возникновения повторных вспышек болезни.
2.2.2. Разработка ОТ-ПЦР для диагностики РСИ КРС
2.2.2.1. Подбор праймеров для постановки ПЦР
Для создания диагностической тест-системы осуществляли подбор специфических олигонуклеотидных праймеров, поиск которых проводили на основе анализа полного генома штамма вируса А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/GenBank/GenBankSearch. html). Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе “Vector NTI Suite”.
Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.
В результате были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидной последовательности 6308 – 6689 и 6309 – 6329 соответственно и фланкирующие последовательность гена гликопротеина F размером 381 пар оснований (п. о.).
2.2.2.2. Компоненты ПЦР
Реакционная смесь для проведения ПЦР содержит в 20 мкл: 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (60 мМ Tris-Hcl (pH 8,5 при 25°С), 1,5 мМ MgCl2; 25 мM KCl; 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100); 2,5 мкл 2,5мМ dNTP (смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов); по 5 мкл каждого праймера с концентрацией 1мМ; 1,25 ед. активности термостабильной Taq ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает деионизованная вода. В смесь вносили кДНК в объеме 5 мкл. Поверх смеси наслаивали 2 капли минерального масла. Все манипуляции по приготовлению реакционной смеси осуществляли на тающем льду.
2.2.2.3. Отработка оптимального режима амплификации
и проверка чувствительности ПЦР
С целью отработки оптимального режима амплификации в ПЦР рассматривали три различные схемы ее проведения. В качестве матрицы использовали штамм «РСБ №3» в разведениях 10–1 – 10–7.
Схема 1.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 15 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 15 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. В результате проведенной реакции все разведения вируса дали отрицательный результат.
Схема 2.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. Чувствительность ОТ-ПЦР при данной схеме составила 10–1ТЦД50/мл.
Схема 3.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. В данном случае чувствительность составила 10–5 ТЦД50/мл. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Чувствительность ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F
Схема | Результаты исследований в ОТ-ПЦР | ||||||
Разведения вируса, ТЦД 50/мл | |||||||
10–1 | 10–2 | 10–3 | 10–4 | 10–5 | 10–6 | 10–7 | |
1 | – | – | – | – | – | – | – |
2 | + | – | – | – | – | – | – |
3 | + | + | + | + | + | – | – |
Примечание: «+» – положительная проба; «–» – отрицательная проба.
Результаты показали, что наиболее оптимальным режимом проведения ОТ-ПЦР является схема № 3, обеспечивающая выявления РНК вируса в пределах разведения 10–5ТЦД50/мл.
Таким образом, нами был отработан оптимальный режим времени для проведения ПЦР, состоящий из следующих циклов: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты.
2.2.2.4. Определение специфичности ОТ-ПЦР
Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Оценка специфичности ОТ-ПЦР для выявления респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота
Вирус (штамм, изолят) | Результаты ПЦР |
Респираторно-синцитиальный вирус КРС (РСБ № 3) | + |
Респираторно-синцитиальный вирус КРС (изолят К-18) | + |
Вирус ПГ-3 КРС (ПТК) | – |
Вирус ВД-БС КРС (ВК-1) | – |
Вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм) | – |
Герпесвирус КРС 1-го типа (Оренбург) | – |
Аденовирус КРС 1 типа (BV-10) | – |
Риновирус КРС 1-го типа (SD-1) | – |
Неинфицированная культура клеток Vero | – |
Неинфицированная культура клеток ТЭБ | – |
Примечание: «+» – положительный результат, «–» – отрицательный результат.
Из данных таблицы 2 видно, что при проведении ОТ-ПЦР на матрице РНК близкородственного вируса ПГ-3 КРС, вирусов вирусной диареи, классической чумы свиней, инфекционного ринотрахеита, адено - и риновирусов, а также – нуклеиновых кислот, выделенных из неинфицированных культур клеток Vero и ТЭБ, получены отрицательные результаты. Они подтверждают высокую специфичность реакции.
2.2.2.5. Влияние сроков хранения при различных температурных
режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР
Результаты проведенных исследований показали, что хранение вируссодержащих суспензий при минус 18ºС обеспечивает сохранность материала, полученного из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов – 4-х, бронхиального экссудата – 6-ти, а легких – 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса является минус 18ºС в течение 2–10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для исследований в ОТ-ПЦР являются пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.
2.2.3. Эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях
2.2.3.1. Частота выявления РНК вируса
из проб биоматериала от животных при вспышках
респираторных болезней
Целью данного раздела было изучение эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях при вспышках массовых респираторных болезней.
Результаты исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения
№ п/п | Вид биоматериала | Количество исследованных проб | Количество | Процент положительных проб от числа исследованных |
1 | Легкие | 171 | 29 | 20 |
2 | Лимфатические узлы | 10 | 2 | 20 |
3 | Носовые выделения | 45 | 6 | 13,3 |
4 | Экссудат из трахеи, бронхов, носовых синусов | 24 | 11 | 45,8 |
5 | Слизистая оболочка трахеи и бронхов | 14 | 2 | 14,3 |
6 | Бронхи | 9 | 3 | 33,3 |
Всего: | 273 | 51 | 19,4 |
Из данных таблицы 3 видно, что вирус чаще выявляли в пробах трахеального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких и легочных лимфатических узлов (20%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса было при условии отбора проб биоматериала на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировки их в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.
2.2.3.2. Частота выявления РНК вируса у животных
различных половозрастных групп
Исследовали 66 проб, полученных от телят до 1 месячного возраста, 137 – от телят в возрасте от 1-го до 6-ти месяцев, 3 – от телок, 5 – от нетелей и 62 – от коров. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Частота выявления РСВ КРС у животных различных половозрастных групп
Половозрастная группа животных | Количество | Выявлено | Процент положительных проб |
Телята от 10 дней до 1 месяца | 66 | 3 | 4,5 |
Телята от 1 мес. до 6 мес. | 137 | 27 | 19,7 |
Телки | 3 | 0 | 0 |
Нетели | 5 | 2 | 40,0 |
Коровы | 62 | 10 | 16,1 |
Всего: | 273 | 42 | 15,4 |
Из представленных данных видно, что наиболее часто вирус выявляли у телят до 6-месячного (19,7%), затем у коров при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии (16,1%) и телят до 10-дневного возраста (4,5%), что свидетельствует об их восприимчивости к инфицированию вирусом.
Таким образом, к инфицированию вирусом восприимчивы все категории животных, однако его чаще выявляли у телят до 6-месячного возраста и коров. Наличие генома вируса в пробах биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствует, по нашему мнению, о вовлечении в эпизоотический процесс этой категории животных.
Вирус также обнаруживали у нетелей (40%). Однако незначительное количество проб биоматериала от них не позволяет достоверно судить о вовлечении этой категории животных в эпизоотический процесс.
2.2.3.3. Частота выявления генома РСВ КРС
и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала
от больных и инфицированных животных
Важным аспектом патогенеза болезни является подавление неспецифических механизмов иммунной защиты респираторного тракта, а также инициация и усиление бактериальной колонизации легких после первичного размножения возбудителя (A. F.S. Antonis et al., 2003; S. J. Fach et al., 2010). Вирус может вызывать бронхиты, пневмонии и эмфиземы легких самостоятельно, но главным его свойством является иммуносупрессия и формирование предрасположенности к возникновению бактериальных пневмоний, в частности, легочного пастереллеза (, 1984; A. M. Al Darraji et al., 1982; L. A. Babiuk et al., 1988; L. E. Larsen et al., 1999; L. Liu et al., 1999).
Целью наших исследований было изучение частоты выявления вируса в ассоциации с бактериями семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от животных различных половозрастных групп при вспышках массовых респираторных болезней в хозяйствах региона Сибири. Диагноз на пастереллез подтверждался в лаборатории биотехнологии-диагностический центр, а также в Тюменской областной и Красноярской краевой ветеринарных лабораториях.
Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5 – Частота выявления РСВ КРС и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от животных
n = 273
Вид | Выявлено положительных проб/% выявления | Новосибирская область | Тюменская область | Красноярский край |
РСВ КРС в моноварианте | 40/14,7 | 25/9,2 | 14/5,1 | 1/0,4 |
Pasteurellacae: Р. multocida M. haemolytica | 56/20,5 25 /9,2 31/11,4 | 31/11,3 21/7,7 10/3,7 | 18/6,6 4/1,5 14/5,1 | 7/2,6 – 7/2,6 |
РСВ + Pasteurellacae: Р. multocida M. haemolytica | 27/9,9 9/3,3 18/6,6 | 5/1,8 2/0,7 3/1,1 | 21/7,7 6/2,2 15/5,5 | 1/0,4 1/0,4 |
Всего проб: 273 | 123/45,1 | 61/22,3 | 53/19,4 | 9/3,3 |
Из представленных данных видно, что РСВ КРС в моноварианте присутствовал в,7%) пробах, полученных от больных животных из 27 хозяйств региона Сибири. Из них количество положительных проб составило по Новосибирской области 25 (9,2%), Тюменской области 14 (5,1%) и Красноярскому краю 1 (0,4%).
Выделение культур семейства Pasteurellacae в моноварианте составило 20,5% (56 проб), из них по Новосибирской области 11,3% (31 проба), Тюменской – 6,6 (18), Красноярскому краю – 2,6% (7 проб). Pasteurellae multocida присутствовала в 9,2% исследованных проб биоматериала, а Mannheimia haemolytica – 11,4%.
Выделение трех возбудителей в одной пробе биоматериала составило 9,9% от числа исследованных. Из них по Новосибирской области этот показатель составил 1,8%, Тюменской – 7,7 и Красноярскому краю – 0,4%.
Более высокая частота выделения бактерий семейства Pasteurellacae в моноварианте (20,5%), чем РСВ КРС (14,7%), на наш взгляд, связана с тем, что причиной возникновения вспышек «вторичного» пастереллеза в хозяйствах могли быть вирусы: прагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, а также другие факторы, понижающие резистентность респираторного тракта животных (стрессы, неудовлетворительные условия кормления и содержания животных).
Кроме этого большое значение может иметь несоблюдение правил отбора и транспортировки проб биоматериала в лабораторию, приводящее к инактивации вируса и получению ложноотрицательных результатов исследований. Поэтому истинную роль РСВ КРС в возникновении массовых вспышек респираторных болезней, в частности, пастереллеза крупного рогатого скота установить сложно.
2.2.3.4. Экономическая эффективность ОТ-ПЦР
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ОТ-ПЦР, позволяет эффективно выявлять геном вируса в пробах биоматериала различного происхождения от больных и инфицированных животных.
В отличие от большинства вирусных инфекций выделение РСВ КРС в культурах клеток не является стандартной лабораторной процедурой. Поэтому ОТ-ПЦР наиболее пригодна для диагностики болезни.
В связи с этим целью настоящего раздела являлось определение экономической эффективности ОТ-ПЦР в сравнении с выделением вируса в культуре клеток, осуществляемым микрометодом.
Экономический анализ эффективности метода ПЦР в условиях диагностической лаборатории заключался в сравнительной оценке эффективности и требуемых денежных затрат на его проведение при сопоставлении с микрометодом выделения вируса в культуре клеток.
При подсчете принимали во внимание прямые затраты.
Составляющие прямых затрат при постановке ОТ-ПЦР:
1. расходы на синтез олигонуклеотидных праймеров (0,6 руб./10 проб);
2. расходы на приобретение набора для выделения РНК (180 руб./10 проб);
3. набор для проведения обратной транскрипции (ОТ) (180 руб./10 проб);
4. пластик (наконечники, пробирки типа Эппендорф, ПЦР-пробирки) 200 руб./10 проб;
5. tag-ДНК полимераза (17,5 руб./10 проб);
6. dNTP (15 руб./10 проб);
7. агароза для электрофореза (3 руб./10 проб);
8. буферный раствор (20 руб./10 проб);
9. затраты рабочего времени на постановку реакции на 10 проб – 4 часа;
10. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник – 11160 руб./мес., лаборант-исследователь – 5196 руб./мес.).
При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы – 8 часов. Итого 160 час.
11160 руб. за 160 час., а за 4 час. – 279 руб.
5196 руб. за 160 час., а за 4 час. – 129,9 руб.
Итого: 279 + 129,9 = 408,9 руб.
Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:
0,6 + 180 + 180 + 200 + 17,5 + 15 + 3 + 20 + 408,9 = 1025 руб.
Составляющие прямых затрат при выделении вируса в культуре клеток:
1. расходы на приобретение питательных сред и растворов (Версена, глютамина, трипсина) – 3600 руб./10 проб;
2. расходы на приобретение эмбриональной сыворотки – 300 руб./10 проб;
3. пластик (культуральные матрасы, планшеты 24-луночные, наконечники, фильтры) – 150 руб./10 проб;
4. расходы на получение специфической гипериммунной сыворотки крови – 300 руб./10 проб;
5. расходы на приобретение жидкого азота – 10 руб./10 проб;
6. Затраты рабочего времени на исследование 10 проб биоматериала – 36 час.
7. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник – 11160 руб./мес., лаборант-исследователь – 5196 руб./мес.).
При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы – 8 часов. Итого 160 час.
11160 руб. за 160 час., а за 36 час. – 2511 руб.
5196 руб. за 160 час., а за 36 час. – 1169,1 руб.
Итого: 2511+1169,1 = 3680,1 руб.
Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:
3600 + 300 + 150 + 300 + 10 + 3680,1 = 8040,1 руб.
Метод ОТ-ПЦР при диагностике РСИ КРС экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток (8040,1/ 1025) в 7,8 раза.
Данный метод дает возможность проведения анализа в течение 2 суток, а метод выделения вируса в культуре клеток занимает от 45 до 75 суток и более. Поэтому ОТ-ПЦР по срокам проведения в 22,5 – 37,5 раз быстрее.
Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод, что разработанная и апробированная нами ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота
обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может эффективно использоваться в комплексе диагностических мероприятий, а также служить основным вирусологическим методом диагностики болезни у животных различных половозрастных групп.
3. ВЫВОДЫ
1. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в молочных хозяйствах Сибири и носит энзоотический характер. Серопозитивность животных к вирусу в среднем по трем административным территориям находилась в пределах 38,4–66,6%. У взрослого скота она достигала 76,3–86,7%, а у молодняка до 6 месяцев 20,4– 29,9%. В среднем у 54,3–92,6% телят до 30 дней отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Титры антител у телят достоверно повышались к возрасту 12 месяцев и старше, свидетельствуя о переболевании в возрасте 4–10 месяцев.
2. Средние титры антител к вирусу у животных в хозяйствах с наличием импортированного скота были выше, чем у животных без него. В период вспышек болезни циркуляция вируса среди животных разных половозрастных групп происходила более активно, особенно среди нетелей, завезенных по импорту, и коров (нетели – 5,4±0,43 lg2; коровы – 5,1±0,02 lg2). При вспышках болезни сероконверсию к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4–6 месяцев и коров (4 – 32 кратное повышение титров антител). Уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).
3. Диагностическая ОТ-ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям высоко консервативного гена гликопротеина F РСВ КРС, обладала высокой чувствительностью и специфичностью. Она достоверно выявляла РНК исследованных штаммов вируса. В результате амплификации кДНК вируса синтезировался фрагмент 381 п. о. Чувствительность реакции составила 10–5 ТЦД50/мл. Выделенная РНК, используемая в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР, сохраняла свою активность в течение 2–10 месяцев при минус 18ºС.
4. Методом ОТ-ПЦР установлено, что к инфицированию вирусом восприимчивы все половозрастные группы животных. В среднем вирус присутствовал в 15,4% исследованных проб биоматериала, полученных от крупного рогатого скота при вспышках болезни. Частота выявления генома вируса от телят до 6-месячного возраста составила 19,7%, а от коров 16,1% при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии. Выявление генома вируса в 4,5% проб биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствовало о вовлечении их в эпизоотический процесс.
5. Вирус чаще выявляли в пробах трахеального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких (20,0%), легочных лимфатических узлов (20,0%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса в пробах биоматериала происходило при их отборе на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировке в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.
6. РСВ КРС в моноварианте присутствовал в 14,6%, Pasteurella multocida – в 9,2, а Mannheimia haemolytica – в 11,4% проб биоматериала от больных животных. Одновременное выделение трех возбудителей в одной пробе было равным 9,9%.
7. ОТ-ПЦР экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток в 7,8 раза, а по срокам постановки в 22,5–37,5 раза. Время исследования 50 проб биоматериала составляло 48 часов, что по срокам постановки превосходило традиционный метод выделения вируса в 37,5 раз (45–75 суток и более).
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. В крупных хозяйствах молочного направления, неблагополучных по респираторным болезням крупного рогатого скота, необходимо проводить диагностические исследования с целью установления этиологической роли респираторно-синцитиального вируса согласно методическим рекомендациям «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденным подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол от 01.01.2001 г.);
2. Для диагностики болезни использовать «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатогоскота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499) в комплексе с серологическими методами исследований.
5. Список работ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Глотов, эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока / , , // Ветеринария. – 2010. – № 7. – С. 21–25.
2. Глотова, и типирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого при помощи скота ОТ-ПЦР / , , // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. – №– С. 59–64.
3. Строганова, обнаружения и идентификации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / , // Вестник КрасГАУ. – 2011. – № 3. – С. 128–133.
4. Войтова, РСИ КРС в молочно-товарных хозяйствах / , , // Научные основы производства биологических препаратов: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию института (Щелково, 9–10 декабря, 2009), ВНИиТИБП – Щелково, 2009. – C. 242–245.
5. Глотов, вируса респираторно-синцитиальной инфекции из проб биоматериала / , , // Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России: материалы XIV междунар. науч.-практ. конф. молодых учёных и специалистов, посвящ. 80-летию академии: – Троицк, 2009. – С. 25–27.
6. Глотов, условий хранения биоматериала на результаты ПЦР при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / , , // Актуальные вопросы ветеринарии: материалы II Сибирского ветеринарного конгресса (25–26 февраля 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 311–312.
7. Войтова, выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в пробах биоматериала от крупного рогатого скота методом ПЦР / , // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных: тр. IV междунар. науч. конф. молодых учёных (пос. Краснообск 22–23 апреля 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 34–37.
8. Глотов, диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами / , , // Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана: XIII междунар. науч.-практ. конф. (Улаанбаатар, 6–7 июня 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 85–90.
9. Глотов, ПЦР для индикации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота / , , // Там же. – С. 91–93.
10. Войтова, метода ПЦР для изучения распространения респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Сибири / , , // Молекулярная диагностика – 2010: VII Всеросс. науч.-практ. конф. с международным участием (24–26 ноября 2010). – Москва, 2010. – С. 79–80.
