Изучение фотохимической активности гуминовых кислот, выделенных из почв разной глубины горизонта А методом люминесценции

Изучение фотохимической активности гуминовых кислот, выделенных из почв разной глубины горизонта А методом люминесценции.

*, **

* Институт химической кинетики и горения СО РАН, 630090 Новосибирск

** Институт почвоведения и агрохимии СО РАН, 630055 Новосибирск

е-mail: *****@***kinetics. *****

Аннотация

С помощью метода люминесценции изучена фото активность водных растворов гуминовых кислот ГК, выделенных из чернозёма и солонцовой почв с разной глубины R. Показано, что фотохимическая активность обоих образцов выше для ГК, выделенных из приповерхностных слоёв почвы. Обращается внимание на факт монотонного изменения фотохимической активности от величины оптической плотности. Этот факт объясняется в рамках представлений о «тепловой бане».

Введение

Гумус (и в частности гуминовые кислоты ГК) играет решающую роль в образовании агрохимически важной структуры почвы и во многом определяет её физические и химические свойства. ГК независимо от их происхождения представляют собой высокомолекулярные азотсодержащие органические кислоты, молекулы которых содержит ароматические группировки. Анализ результатов, полученных многочисленными прямыми и косвенными методами, позволил создать общую картину строения макромолекулы гуминовой кислоты: наличие ядра (ароматический углеродный скелет) и периферии (полисахаридно-полипептидные цепи) [1,2]. Характерной особенностью макромолекул гуминовых кислот является их полидисперсность и вариабельность по элементному и молекулярному составу [1,2].

Почвы, находящиеся в сельскохозяйственном использовании, всегда подвержены прямому воздействию солнечного света и поэтому ГК, как компоненты почв, должны и действительно претерпевают заметные фотохимические превращения [1-3]. Фотохимическая активность ГК заметным образом зависит от типа почв, из которых они были выделены [3]. Актуальность изучения фотохимических свойств ГК особенно выросла в последнее время в связи с проблемой деградации почв из-за совместного действия на неё солнечной радиации и различных поллютантов [4]. В связи с этим изучение закономерностей перераспределения энергии фотовозбуждения собственно в молекулах ГК является одной из важнейших фундаментальных задач. Следует также заметить, что вопрос о перераспределении энергии фото возбуждения между различными группами флуорофоров в молекулах ГК выходит за рамки рассмотрения только этих объектов. Он является одним из центральных при изучении многочисленных фотохимических и фотофизических процессов, имеющих место в сложных молекулярных ансамблях (зрительные пигменты, лазерные среды, фотосинтезирующие молекулы и т. д.) [5].

При изучении фотохимической активности почв всегда принималось, что по всей глубине R горизонта А (глубина R = 0-15 см) фотофизические и фотохимические свойства почвы неизменны. Однако в последнее время появились сообщения о том, что даже в пределах этого горизонта электронные свойства молекул ГК претерпевают заметные изменения [6,7]. Из этих результатов в принципе следует, что фотохимическая активность молекул ГК также может претерпевать изменения в пределах горизонта А.

Целью настоящей работы было изучение фотохимической активности ГК, выделенных из горизонта А одной почвы, но разной глубины R с «шагом» 2-5 см. Анализ фотохимической активности проводился методом люминесценции, одним из наиболее чувствительных и интенсивно применяемых в последнее время методов изучения химической структуры молекул ГК [4,8,9]. К его достоинствам следует отнести экспрессность и простоту приготовления образцов. Кроме того, принципиальным достоинством этого метода относительно метода абсорбции является наличие в спектре люминесценции характеристических полос в определённом спектральном диапазоне. Наблюдение за трансформациями спектров люминесценции образцов ГК, выделенных из одного типа почв, позволяет получать информацию об изменении электронного состояния ГК при изменении условий содержания и обработки почв [9]. Параметры полос люминесценции дают непосредственную информацию об изменении степени сопряжения в гуминовой кислоте (по изменению положения максимума полосы или величины первого момента) [9], об изменении степени полидисперсности образца [10] и т. д. Перечисленные изменения могут проходить под воздействием различных факторов и, в частности, благодаря фотохимическим превращениям. В целом информация о фотохимических трансформациях структуры ГК, получаемая методом люминесценции, может значительно дополнить таковую, получаемую с помощью методов электронной [3] и ИК [11] спектроскопии, импульсного фотолиза [12]) или хроматографии [13]), что безусловно должно способствовать развитию физико-химического почвоведения.

Материалы и методы

Исследуемыми объектами ГК были образцы, выделенные из почв чернозёма, слабо выщелоченного целинной лесостепной зоны Алтайского края, сформированного под луговой степью и солонца среднестолбчатого лугово-степного, развитого под солонцеватой разнотравно-типчаково-пырейной степью Барабинской низменности.

Способы выделения ГК были стандартны [1] за исключением стадии очистки, из которой были исключены условия жёсткой обработки ГК. Перед выделением эти почвы в течение 20 лет содержались в виде монолитов под подстилкой дерново-сильнопод-золистой почвы со вторым гумусовым горизонтом, сформированной под типичной южно-таёжной растительностью (пихтовый лес с примесью кедра и берёзы). Условия трансплантации почв в рамках данного эксперимента и основные результаты опубликованы ранее [6].

Растворы ГК готовились на бидистиллированной воде. Качество бидистиллята было таковым, что интегральная интенсивность спектра флуоресценции органических примесей, которые всегда имеются в любой воде [14], всегда не превышала 2% от интегральной интенсивности спектра флуоресценции образцов ГК. Концентрация водных растворов ГК составляла 100 мг/л. Для лучшей растворимости и увеличения фотохимической активности использовали щелочную среду (рН=12.3) [3]. Растворы выдерживались на свету в течение 3 суток. Время проведения экспериментов – март, апрель 2002 года. Контрольные образцы хранились в темноте. Спектры флуоресценции были получены на N2 - лазерном спектрометре [15] в стандартных кварцевых кюветах объёмом 4 см3. Возбуждающий свет (диаметр лазерного пучка 3мм) проходил около стенки кюветы, которая обращена в сторону входной щели спектрометра и поэтому поправок на поглощение света люминесценции не проводилось. Воздух из образцов не удалялся. Спектры поглощения были получены на спектрометре «Brucker».

За величину коэффициента фотохимической активности aМR образца ГК с глубины R принимали величину

kМR = |[(М1исх – М1обл) / М1исх]R (КROD)-1| (1)

Здесь М1исх и М1обл - первые моменты спектров флуоресценции исходного и облучённого образцов соответственно. В (1)

М1 = SIili / SIi (2)

где Ii - интенсивность люминесценции на длине волны li.

КROD = 1 – 10-ODR (3)

ODR = (SODli)R / (SODli)0 (4)

(SODli)R и (SODli)0 – суммы коэффициентов поглощения в спектральном диапазоне 300 – 800нм для образцов ГК, выделенных с глубины R = Ri и R = 0-3 см соответственно. При определении величин Ii учитывали спектральную чувствительность установки. Которая определялась с помощью стандартной методики с применением сернокислого хинина.

За величину коэффициента фотохимической активности ajR образца ГК с глубины R принимали величину

kjR = |[(jисхR – jоблR) / jисхR] (КROD)-1| (5)

Здесь jисхR и jоблR – относительные квантовые выходы флуоресценции исходного и облучённого образцов с глубины R соответственно. (За величину квантового выхода принимали величину интегральной интенсивности спектра флуоресценции ГК). При этом

j0,СR = (SIi 0, С/ Ist) R (КRвозб

где (Ist)R – интенсивность (внутренний стандарт) линии комбинационного рассеяния воды (l = 381.6 нм).

КRвозб = 1 – 10-ODl = 337нм (7)

Величина относительного квантового выхода jR0 определялась из соотношения

jR0 = jR / j0 (8)

В (8) jR и j0 – квантовые выходы люминесценции с глубины R = Ri и R = 0-3 см соответственно.

За величину коэффициента фотохимической активности kaR (коэффициент изменения формы контура) образца ГК, выделенной с глубины R, принимали величину

kaR = (a45 облэкс / a45 исхэкс)ОDR-1 (9)

В (9)

a45облэкс = (Il =450нм / Il =490нм)обл; a45исхэкс = (Il =450нм / Il =490нм)исх (10)

где (Il =450нм и Il =490нм)обл, исх - экспериментально наблюдаемые интенсивности на l = 450 и 490 нм в спектрах флуоресценции облучённого и исходного образцов соответственно. Параметр формы контура a45 в спектрах флуоресценции можно рассматривать как аналог общепринятого параметра Е4 / Е6 (параметр цветности) для характеристики спектров поглощения ГК [2], определяемого отношением коэффициентов поглощения на длинах волн 450 и 650 нм соответственно. Принципиальным достоинством введения параметра a45 является то, что его применение при определении величины kR не требует учёта спектральной чувствительности спектрометра и поправки на поглощение света флуоресценции (см. Appendix).

Результаты

Форма спектров поглощения исходных растворов ГК (рис.1), выделенных из чернозёма и солонца, типична для ГК [1-3]: величины оптических плотностей монотонно уменьшаются с увеличением длины волны. При этом с ростом величины R форма спектра поглощения не меняется, а возрастает лишь величина оптической плотности. За время облучения изменений в спектрах поглощения установлено не было. (Также не было изменений в спектрах поглощения контрольных образцов растворов ГК). Изменения в спектре поглощения (уменьшение поглощения) становятся заметными лишь через 7 суток облучения. При этом форма спектра поглощения не меняется.

На рис.2 представлены спектры люминесценции растворов ГК, выделенных из чернозёма и солонца с разной глубины отбора образца почвы R. Чтобы не перегружать рисунки, приведены спектры ГК не для всех значений R, а только для трёх. Из представленных данных следует, что с ростом величины R форма контуров спектров флуоресценции ГК претерпевает заметные изменения: возрастает доля красной компоненты спектра, что выражается в росте величины М1 (рис.3а) и уменьшении величины a45. Кроме того заметно возрастает квантовый выход (рис.3в). Батохромный сдвиг в спектрах флуоресценции принято связывать с увеличением области сопряжения в молекуле-люминофоре [8,16]. Основываясь на этом положении, заключаем, что для обоих образцов ГК с ростом глубины степень сопряжения растёт.

На рис.4 представлены спектры флуоресценции исходных и облучённых водных растворов ГК, выделенных из чернозёма и солонца при R = 1-3 см и 0-3 см соответственно. (За время хранения в течение 3 суток изменений в спектрах флуоресценции контрольных образцов не наблюдалось. Также не наблюдалось изменений в спектрах флуоресценции образцов ГК за время получения спектра, которое составляло около 5 минут ). Из представленных данных видно, что для обоих образцов облучение приводит к заметному изменению формы контура флуоресценции: уменьшается доля красной компоненты (соответственно гипохромный сдвиг всего спектра флуоресценции) и падает квантовый выход.

Изменения параметров фотохимической активности в зависимости от R представлены на рис.5. Из представленных данных следует, что для ГК, выделенных из обоих типов почв, все величины коэффициентов фотохимической активности kМR, kaR и kjR уменьшаются с ростом R. Большая степень трансформации спектров флуоресценции образцов ГК, выделенных из приповерхностных горизонтов, относительно более глубоких горизонтов, означает большую фотохимическую активность этих образцов и, соответственно, большую фотостабильность образцов ГК, выделенных из более глубоких слоев почвы.

На рис.6 представлены зависимости коэффициентов фотохимической активности kaR, kМR и kjR от величины ODR. Из полученных данных следует, что фотохимическая активность монотонно уменьшается с ростом величины ODR.

Обсуждение

1. Факт существенных изменений параметров спектра флуоресценции под действием облучения и отсутствие изменений в спектре поглощения может объясняться следующим. Спектры флуоресценции определяются параметрами спектра возбуждения (действия). Вид спектров возбуждения и поглощения для ГК принципиально различаются. В спектре возбуждения имеются характеристические полосы [8], в то время как в спектрах поглощения они отсутствуют (см. напр. рис.1). Окончательного объяснения этому факту в настоящее время нет. Можно думать, что спектр поглощения обусловлен наличием многочисленных фрагментов (центров) в макромолекуле ГК, а спектр флуоресценции обусловлен только некоторыми. Причём эти флуоресцирующие фрагменты должны находиться друг от друга пространственно достаточно далеко, ибо в противном случае благодаря большой величине константы скорости внутренней конверсии спектр поглощения и спектр возбуждения ГК будут совпадать, как это имеет место для молекул в конденсированной фазе (1 закон Вавилова или правило Каша [16,17]). Таким образом при фотохимических превращениях ГК изменения в спектре поглощения должны происходить лишь в какой-то его части, поскольку меняется только спектр возбуждения и поскольку вклад спектра возбуждения флуорофоров в общий спектр поглощения не велик, то и изменений в общем спектре поглощения наблюдаться не будет.

2. Квантовый выход любой фотохимической реакции jхим можно представить в виде [16,17]

jхим = Кхим / (Кхим + Кнх) (11)

В (11) Кхим и Кнх - вероятности (константы) возбуждённой молекулы претерпеть химические и нехимические превращения соответственно. Под Кнх обычно подразумеваются сумма нескольких релаксационных процессов. К таковым относятся: флуоресценция (радиационный переход S1 → S0), интеркомбинационный Кик (S1 → T1, нерадиационный переход) и внутренняя конверсия Квк (S1 → S0, нерадиационный переход). Таким образом

Кнх = Кфл + Кик + Квк (12)

Эти возможные (конкурирующие) переходы представлены для случая, когда химический процесс происходит из синглетного возбуждённого состояния.

Для обоих образцов ГК с ростом R имеет место возрастание М1 (рис.3а). Это означает, что молекулы ГК, выделенные из более глубокого горизонта, имеют более низкий первый возбуждённый электронный уровень S1 и, соответственно, меньшую величину энергетического зазора D = S1 – S0. Экспериментально для простых молекул установлено, что для ненасыщенных связей (считаем, что люминесценция молекул ГК обусловлена именно таким типом флуорофоров) с уменьшением энергетического зазора (S1 – S0) величина Кфл возрастает (квантовый выход флуоресценции растёт) [16]. Если принять, что для молекул ГК имеют место такие же закономерности, то из имеющихся данных по возрастанию М1 следует, что с ростом R Кфл должна возрастать. Действительно наши данные по прямому наблюдению Кфл показали, что она растёт с увеличением R (рис.5в).

Дополнительным подтверждением в пользу возрастание Кфл с увеличением R могут служить результаты по зависимости эффективности поглощения ОD от R (рис.1). Для простых молекул ОD ~ t-1 (t - радиационное время жизни) [17]. Считая это соотношение справедливым и для молекул ГК и учитывая, что t-1 ~ Кфл [16,17]), окончательно заключаем, что с увеличением R величина Кфл возрастает.

При уменьшении величины D величина энергетического зазора D1 = S1 – Т1 также уменьшается [18]. Величина Кик ~ exp (–D1/kT) [18]. Таким образом, с увеличением R (уменьшение D1) величина Кик растёт.

Величина Квк определяется плотностью колебательных уровней r состояния S0 на «высоте» S1 (Квк ~ r [18]). Величина r для сложных молекул, к которым без сомнения относятся молекулы ГК, на «высоте» S1 представляет собой квазиконтиниум [18] и практически не зависит от изменения положения S1, которое в нашем случае меняется очень незначительно (~ 2%). Следовательно, можно считать, что величина Квк с уменьшением величины S1 не меняется.

Таким образом, величина Кнх в знаменателе формулы (11) с увеличением R возрастает. Отсюда следует, что величина kR (аналог jхим в (11)) с ростом R должна уменьшаться, что и наблюдается экспериментально (рис.7). В принципе именно такого результата априори можно было ожидать: чем больше вероятность участия молекулы в радиационных переходах (рост квантового выхода флуоресценции), тем меньше вероятность участия в фотохимических реакциях [15].

3. Полученные монотонные зависимости коэффициентов фотохимической активности ГК от эффективности поглощения (рис.6) не являются тривиальными. Информация о систематических исследованиях зависимостей квантовых выходов фотохимических реакций от величины поглощения отсутствует, поскольку априори ожидать какой-либо корреляции между этими параметрами не представляется возможным. Действительно из имеющихся данных для простых молекул изменение коэффициента экстинкции (например, увеличение), вызванное химическим введением в молекулу какого-либо заместителя, может сопровождаться как ростом, так и падением фотохимической активности [13]. Таким образом, для простых молекул какая-либо корреляция полностью отсутствует. Это отсутствие связано с принципиальной разной перестройкой электронной структуры молекулы при введении разных заместителей.

Для объяснения наблюдаемой монотонной зависимости между фотохимической активностью ГК и эффективностью поглощения мы предлагаем использовать представления об эффекте «тепловой бани» для сложной молекулы (см. напр.[4]). Они заключаются в том, что для сложной молекулы, состоящей из нескольких флуорофоров, имеет место взаимодействие между флуорофорами, имеющими дискретный спектр, с физическими системами, имеющими непрерывный спектр. Для молекул ГК эффект «тепловой бани» может заключаться в том, что имеет место взаимодействие поглощающего уровня и поля фононов, образуемых колебаниями атомов всей молекулы. При наличии эффекта «тепловой бани» в молекуле нельзя выделять конкретный электронный уровень, поскольку имеется «обобщённый» терм, образованный многочисленными взаимодействующими электронными и колебательными уровнями основного состояния. Таким образом, каждая молекула ГК может характеризоваться своим «обобщённым» флуоресцирующим термом, определяемым эффектом «тепловой бани», который, в конечном счёте, зависит от конкретной химической структуры молекулы. Для сложной молекулы присоединение (отщепление) химических фрагментов качественно не меняет сложности молекулы ГК и не лишает её уникального свойства – наличия эффекта «тепловой бани». При присоединении (отщеплении) происходит лишь количественное изменение параметров состояния «тепловой бани». По-видимому, именно эти монотонные количественные изменения в параметрах состояния «тепловой бани» молекулы ГК при возрастании R приводят, к монотонным изменениям как в коэффициенте поглощения, так и эффективности фотохимического превращения, что, в конечном счёте, и обуславливает наблюдаемую монотонную зависимость фотохимической активности ГК от коэффициента поглощения. Таким образом, наличие монотонных зависимостей коэффициентов фотохимической активности от ODR (рис.6) можно рассматривать как проявление эффекта «тепловой бани».

4. Метод фотохимического зондирования можно оказаться полезным для дифференциации ГК количественно. Например, если данные рис.2 аппроксимировать функцией типа y = a + bx, то каждый образец ГК может быть охарактеризован индивидуальными параметрами a и b. Следует также заметить, что чувствительность метода фотохимического зондирования можно сделать сколь угодно высокой, поскольку можно варьировать глубину превращения исходного раствора за счёт изменения интенсивности возбуждающего света и времени облучения. Это обстоятельство с точки зрения дифференциации видов (сортов) ГК несомненно обуславливает преимущество данного метода перед другими, чувствительность которых всегда постоянна и которой при малых различиях в свойствах ГК может оказаться недостаточно для выявления этих различий.

Основные выводы

1.  Показано, что с увеличением глубины отбора пробы почвы, степень сопряжения выделенной из неё макромолекулы ГК возрастает.

Фотохимическая активность ГК, выделенных из горизонта А, уменьшается с увеличением глубины забора пробы и ростом эффективности поглощения.

Appendix

В (9) при определении величин kaR отсутствуют поправки на поглощение света люминесценцией Кпогл и коэффициент спектральной чувствительности Ксч. Эти поправки вносить для определения величины kR не следует в связи со следующим. В самом деле величины истинной интенсивности Iист флуоресценции на определённой длине волны должны быть получены умножением наблюдаемой экспериментально Iэкс на поправочные коэффициенты Кпогл и Ксч:

Iист450 = Iэкс450Кпогл450Ксч450 ; Iист490 = Iэкс490Кпогл490Ксч

По определению для aист должны иметь

aист = Iист450 / Iист490 = Iэкс450Кпогл450Ксч450 / Iэкс490Кпогл490Ксч

И окончательно для отношения величин aоблист и aисхист получаем

aоблист ( Iэкс450Кпогл450Ксч450)обл ( Iэкс490Кпогл490Ксч490 )исх aоблэкс

——— = ————————— —————————— = ——— = kaR (14)

aисхист (Iэкс490Кпогл490Ксч490)обл (Iэкс450Кпогл450Ксч450)исх aисхэкс

В (14) принято, что (Кпогл450)обл = (Кпогл450)исх и (Кпогл490)обл = (Кпогл490)исх, поскольку спектры поглощения после облучения не претерпевают изменений, а величины Ксч вообще не зависят от качества образца.

Работа была частично поддержана грантами РФФИ № и № .

Подписи к рисункам

Рис.1. Спектры поглощения водных растворов ГК в зависимости от R. а – чернозём; б - солонец.

Рис.2. Спектры флуоресценции водных растворов ГК в зависимости от R. а – чернозём; б – солонец.

Рис.3. Зависимости изменений первого момента М1, коэффициента формы a45 и относительного квантового выхода jRO от R. Квадраты – чернозём; кружки – солонец.

На оси абсцисс «усы» указывают размер «шага» забора пробы почвы.

Рис.4. Зависимость спектров флуоресценции водных растворов ГК от облучения. а - чернозём, R = 1-3 см; б – солонец, R = 0-3 см. Флуоресценция исходного раствора – сплошная линия; флуоресценция раствора через 3 суток облучения – пунктирная линия.

Рис.5. Зависимость коэффициентов фотохимической активности водных растворов ГК, выделенных из почв разной глубины. Квадраты – чернозём; кружки – солонец.

Рис.6. Зависимость коэффициентов фотохимической активности водных растворов ГК, выделенных из почв разной глубины, от величины оптической плотности ODR. . Квадраты – чернозём; кружки – солонец.

Рис.7. Зависимость коэффициента фотохимической активности kaR от относительного квантового выхода флуоресценции jRO. Квадраты – чернозём; кружки – солонец.

Литература

1.  . Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. Москва: МГУ.1990.С.325.

2.  . Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Ленинград: наука,1980.С.288.

3.  . Роль фотохимических реакций в образовании гумуса. Автореферат диссер. МГУ, 1975.

4.  O. Trubetskaya, O. Trubetskoj, G. Guyot, F. Andreux, C. Richard. // Organic Geochemistry, 2002,33(3),213.

5.  . // ЖФХ, 2001,75(2),303.

6.  , . // Почвоведение,1995,3,277.

7.  , А. Сагдиев, . // Химия в интересах устойчивого развития, 2003, 5, 539.

8.  N. Senesi, Т. М.Miamo, М. Provenzano, G. Brunetti. // Soil Sci. 1991,152(4),259.

9.  , , . // Химия в интересах устойчивого развития. 2000,8,815.

10.  . // Химия в интересах устойчивого развития, 2003, 5, 554.

11.  J.-H. Aguer, C. Richard. // J. Photochem. Photobiol. A, 1996,(93),193.

12.  J. F.Power, D. K.Sharma, C. H.Langford, R. Bonneau, J. Joussot-Dubien. // Photochemistry and Photobiology, 1986, 44(1),11.

13.  J.-H. Aguer, C. Richard.// Chemosphere,1999,38(10),2293.

14.  , , . // Химия в интересах устойчивого развития. 1999,4,45.

15.  , // ЖФХ,1986, 54(6),1216.

16.  J. G.Calvert, J. N.Pitts. Photochemistry. J. Wiley & Sons, Inc. New York, London, Sydney. 1966.

17.  П. Паркер. Введение в фотолюминесценцию растворов. Москва: Иностр. лит. 19С.

18.  , . Теория безизлучательных переходов в многоатомных молекулах. Москва: Наука.1983.280С.