Приложение 6-2
Набор реагентов для количественного определения концентрации свободного тироксина (fT4) в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа
НАЗНАЧЕНИЕ
Количественное определение концентрации свободного
тироксина (free T4) в человеческой сыворотке.
ВВЕДЕНИЕ
Тироксин - важный тиреоидный гормон, циркулирует в крови
в основном в связанном белками-переносчиками виде.
Основным из них является тироксин-связывающий глобулин
(ТСГ). Однако, только свободная (несвязанная) часть
тироксина ответственна за биологическую активность.
Концентрации белков-переносчиков изменяются при многих
клинических состояниях, таких, например, как беременность.
При нормальной тироидной функции при изменении
концентрации белков-переносчиков уровень общего
тироксина изменяется, а уровень свободного тироксина
остается постоянным. Таким образом, уровни свободного
тироксина лучше коррелируют с клиническим статусом, чем
уровни общего тироксина.
Например, возможно повышение общего тироксина выше
нормальных значений, связанное с беременностью, приемом
оральных контрацептивов и эстрогенов, в то же время уровни
свободного тироксина остаются в диапазоне нормы.
Маскировка патологической тиреоидной функции может
также встречаться при состояниях гипер - и гипотиреоза при
изменениях в концентрации тироксин-связывающего
глобулина (ТСГ). Общий T4 может быть повышен или
понижен при изменении ТСГ таким образом, что остается в
нормальном диапазоне. В этой ситуации концентрация
свободного T4 более адекватно отражает клинический статус
пациента.
Методология ИФА обеспечивает клиницистов оптимальной
чувствительностью при минимуме необходимых технических
манипуляций. В этом методе в микроячейки добавляются
сначала стандартные сыворотки, пробы пациента или
контроли. Затем добавляется ферментный коньюгат-Т4, и
реакционная смесь перемешивается. Происходит
конкурентная реакция между ферментным коньюгатом и
свободным тироксином за ограниченное число антител,
связанных со стенками микропланшета.
После завершения необходимого инкубационного
периода антитела, связавшие ферментный-Т4 коньюгат,
отделяются от несвязавшегося коньюгата промывкой.
Активность фермента на поверхности ячеек измеряется
реакцией с подходящим субстратом.
Использование стандартов fT4 с известными различными
концентрациями позволяет построить калибровочную
кривую. Концентрации FT4 в неизвестных образцах
находятся по этой калибровочной кривой.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Настоящие реагенты, требующиеся для твердофазного
иммуноферментного анализа, включают
иммобилизованные антитела, коньюгат фермент-
антиген и естественный антиген.
При смешивании иммобилизованных антител,
ферментного коньюгата и сыворотки, содержащей
нативный свободный антиген, между нативным
свободным антигеном и коньюгатом фермент-антиген
происходит конкурентная реакция за иммобилизованные
места связывания антител. Взаимодействие
иллюстрируется следующим уравнением:
ka
EnzAg + Ag + AbC. W. AgAbC. W. + EnzAgAbC. W.
k-a
AbC. W. = моноспецифические иммобилизованные
антитела (постоянное количество)
Ag = нативный антиген (переменное количество)
EnzAg = коньюгат фермент-антиген (постоянное
количество)
AgAbC. W. = комплекс антиген-антитело
EnzAg AbC. W. = комплекс коньюгат фермент-антиген
-антитело
ka = константа скорости ассоциации
k-a = константа скорости диссоциации
K = ka / k-a = константа равновесия
После достижения равновесия фракция, связанная
антителами, отделяется от не связавшегося антигена
декантацией или промывкой. Активность фермента во
фракции, связанной антителами, обратно
пропорциональна концентрации нативного антигена. При
использовании нескольких стандартов с известным
значением концентрации антигена строится
калибровочная кривая, по которой вычисляется
концентрация неизвестных образцов.
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ 96-луночного ПЛАНШЕТА
А. Калибраторы - 1 мл во флаконе - значки A-F
Шесть флаконов стандартных сывороток с
концентрациями тироксина примерно* О (А), 0.4 (В), 1.1
(С), 2.2 (D), 4.1 (Е) и 8.0 (F) нг/дл. Хранить при 2-8°С.
Содержат консервант. * Точные концентрации,
зависящие от лота, приведены на этикетках флаконов.
Для перевода единиц: 1 нг/дл x 12,9 = пмоль/л
В. Ферментный реагент -13 мл во флаконе значок E
Один флакон, содержащий коньюгат тироксина с
пероксидазой хрена в бычьем сывороточном альбумине.
Содержат консервант. Хранить при 2-8°С.
С. Микроячейки, покрытые антителами — 96 ячеек значок
Один 96-луночный планшет, покрытый анти-Т4
сывороткой, упакованный в пакет из алюминиевой фольги с
осушителем. Хранить при 2-8°С.
D. Концентрат промывочного буфера - 20 мл - значок
Один флакон, содержащий ПАВ в фосфатном буфере.
Содержит консервант. Хранить при 2-30°С.
Е. Субстрат А - 7 мл во флаконе - значок SA
Один флакон, содержащий ТМБ в буфере. Хранить при 2-8°С.
F. Субстрат В - 7 мл во флаконе - значок SB
Один флакон, содержащий перекись водорода в буфере.
Хранить при 2-8°С.
G. Стоп-раствор — 8.0мл во флаконе - - значок STOP
Один флакон, содержащий сильную кислоту (1N HC1).
Хранить при 2-8°С.
H. Инструкция
Замечание 1. Не используйте реагенты с истекшим сроком
годности.
Замечание 2. Открытые реагенты стабильны 60 дней при
хранении от 2 до 8 °С.
Замечание 3. Все реагенты предназначены для одного
планшета.
Требуемые материалы, не поставляемые с набором
1. Микродозаторы на 50 мкл с точностью не ниже 1,5%
2. Диспенсеры на 100 и 300 мкл с точностью не ниже 1,5%
3. Микропланшетный вошер
4. Микропланшетный ридер с длиной волны 450 нм и 620 нм.
5. Фильтровальная бумага для высушивания
микропланшета.
6. Пластиковая пленка для инкубирования.
7. Вакуумный осушитель для стадии промывки.
8. Таймер.
9. Контрольные материалы поставляются ,
Москва, многоканальный)
ЗАМЕЧАНИЯ И ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ
Набор предназначен только для диагностики in vitro. Не для
использования в качестве лекарственного средства для людей
или животных.
Потенциально опасный биоматериал. В материалах набора
используется человеческая сыворотка. Используемая в наборе
сыворотка не содержит поверхностный антиген гепатита В и
антитела u1082 к ВИЧ (HIV 1&2) и гепатиту С, протестирована
методами, одобренными FDA. Однако, поскольку не
существует методов, дающих полную гарантию отсутствия
инфекционных агентов, с реагентами следует обращаться с
осторожностью как с потенциально опасным биоматериалом,
как рекомендуется для любых образцов крови.
СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Сбор и хранение образцов
Соберите образцы венопункцией в пробирки. Должны
соблюдаться обычные меры предосторожности. Для
достоверного сравнения с установленным нормальным
диапазоном необходимо отбирать утренние образцы натощак.
Соберите кровь в пробирки с красной маркировкой для
венозной крови без добавок или разделяющего геля. Позвольте
крови свернуться. Отделите эритроциты центрифугированием
и используйте сыворотку для определения fT4.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
1. Промывочный раствор. Вылейте содержимое
концентрата промывочного буфера в 1000 мл сосуд.
Разбавьте до 1000 мл дистиллированной водой.
Хранить при комнатной температуре (20-27оС) до 60
дней.
2. Рабочий раствор субстрата - готовится
непосредственно перед анализом. Определите
количество требуемого реагента и смешайте равные
доли Субстратов А и В в подходящей емкости.
Например, для двух стрипов по 8 ячеек каждый
смешайте по 1 мл (небольшое превышение
необходимого количества, остатки полученной смеси
нельзя сохранять до следующего анализа). Раствор
может быть использован в течение 60 дней при
условии хранения при 2-8оС.
Замечание: если рабочий раствор субстрата приобрел
голубую окраску – он не подходит для постановки.
МЕТОДИКА
Перед началом анализа все реагенты, стандарты и контроли
должны достичь комнатной температуры (20-27.С).
1. Выберите необходимое количество лунок для
образцов, стандартов и контролей для постановки в
дублях. Верните неиспользуемые стрипы в алюминиевый
пакет и закройте его. Храните при 2- 8°С.
2. Добавьте 50 мкл стандартов, контролей и образцов в
соответствующие ячейки.
3. Добавьте 100 мкл рабочего реагента 1 (раствор
ферментного коньюгата u1058 Т4) в каждую ячейку.
4.Осторожно перемешайте содержимое планшета в
течение 20-30 секунд и накройте его.
5. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре. **
6. Удалите содержимое ячеек декантацией или
аспирацией. Промокните планшет чистой
фильтровальной бумагой.
7. Добавьте 300 мкл промывочного буфера (см. раздел
«Приготовление реагентов») и удалите его. Повторите
процедуру еще два раза (общее количество циклов
промывки - 3). Для этой процедуры лучше использовать
автоматический или ручной вошер в соответствии с
инструкциями производителя приборов (избегайте
образования воздушных пузырьков).
8. Добавьте пипеткой по 100 мкл рабочего раствора
субстрата в каждую лунку (см. «Приготовление
реагентов»). Всегда добавляйте реагенты в одной и
той же последовательности, чтобы избежать различий
во времени реакции в разных ячейках.
Не встряхивайте планшет после добавления
субстрата!
9. Инкубируйте при комнатной температуре 15 минут.
10. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую ячейку и
аккуратно перемешайте 15-20 секунд. Всегда
добавляйте реагенты одним и тем же способом, чтобы
избежать различий по времени реакции.
11. Измерьте величины поглощения содержимого ячеек
на 450 нм (измерение проводите при референсной длине
волны 620-630 нм — это позволит уменьшить ошибку).
Измерения должны быть проведены в течение 30
минут после добавления стоп-раствора.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна использовать контроли,
соответствующие гипотиреозу, эутиреозу и гипертиреозу для
мониторинга правильности теста. Эти контроли должны
исследоваться как неизвестные образцы в каждой серии
анализа. Должны строиться карты контроля качества для
отслеживания характеристик поставляемых реагентов. Каждая
лаборатория должна установить приемлемые характеристики
набора. Значительные отклонения от установленных
характеристик могут свидетельствовать об изменениях в
условиях эксперимента u1080 или разложении реагентов набора. Для
установления причины изменений должны быть использованы
свежие реагенты.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для определения концентрации fT4 в неизвестных образцах
используется калибровочная кривая.
1. Запишите значения оптической плотности для всех ячеек
как показано в примере 1.
2. Для построения калибровочной кривой используйте
средние из двух оптических плотностей для каждого
стандарта в зависимости от концентрации fT4 в нг/дл.
3. Проведите оптимальную калибровочную кривую.
4. Определите неизвестные концентрации fT4 в контролях и
образцах, используя калибровочную кривую,
построенную по средним значениям оптической
плотности для каждого образца.
Пример 1
Рисунок 1
* Данные в примере 1 и на рис. 1 приведены только для
иллюстрации и не должны использоваться вместо
калибровочной кривой, полученной в каждом
исследовании.
ПАРАМЕТРЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА
1. Оптическая плотность Калибратора 0 нг/мл >
1.3
2. Четыре из шести контролей качества должны
укладываться в установленные интервалы.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
А. Характеристики процедуры анализа
1) Для воспроизводимости результатов важно, чтобы
время реакции поддерживалось постоянным в
каждой ячейке.
2) Пипетирование образцов не должно превышать 10
минут.
3) Если используется больше, чем один планшет,
рекомендуется повторять калибровочную кривую.
4) Добавление раствора субстрата инициирует
кинетическую реакцию, которая останавливается
при добавлении стоп-раствора. Следовательно,
добавление субстрата и стоп-раствора должно
проводиться в одинаковой последовательности для
устранения различий во времени реакции в разных
лунках.
5) Измерение оптической плотности на ридере
проходит вертикально. Не прикасайтесь ко дну
микроячеек.
6) Плохая промывка ячеек может приводить к
невоспроизводимым результатам.
7) Используйте компоненты из одного лота. Не
смешивайте реагенты из разных серий.
В. Интерпретация результатов
Если для обработки результатов теста используется
компьютер, то точность стандартов - не более 10%.
1) Для анализа не должны использоваться высоко
липемичные, гемолизированные или
контаминированные образцы.
2) Если значение пробы пациента выше, чем значения
высшего калибратора (например, >7,4 нг/мл) Не
пытайтесь разводить пробы. TBG вариации в разных
матриксах не позволяют проводить серийное разведение
fT4.
3) Концентрация fT4 в сыворотке зависит от множества
факторов: функция щитовидной железы и ее регуляция,
концентрация тироксин связывающего глобулина (TBG) и
связывание тироксина с TBG. Таким образом,
определение одной лишь концентрации общего Т4 не
является достаточным для оценки клинического статуса.
4) Уровни общего Т4 могут быть повышены при
беременности, приеме оральных контрацептивов.
5) Понижение концентрации общего Т4 наблюдается при
болезнях, связанных с потерей белка, например,
заболевания печени, приеме тестостерона,
дифенилгидантоина или салицилатов. Сведения об
интерференции различных лекарств и условиях,
влияющих на содержание общего тироксина вы можете
найти в специальных изданиях по лабораторной
диагностике.
6) Интерпретация результатов определения fT4 осложняется
также различными лекарственными средствами, которые
могут влиять на связывание Т4 с тироид транспортными
белками или влияющими на его метаболизм. При тяжелых
не-тироидальных заболеваниях (NTI) определение
тироида представляет особенную трудность поскольку
пациенты этой категории могут страдать от
сопутствующего первичного гипотироидизма или от
компенсаторного вторичного гипотироидизма. В таких
случаях можно порекомендовать чувствительные методы
определения TSH (запрашивайте в
соответствующий набор Monobind Кат. N
7) В редких случаях, ассоциированных со значительными
вариациями в альбумин связывающей способностью Т4-
таких как наследственная дисальбуминемическая
гипертироксинемия (FDH) – прямое определение fT4
может приводить к ошибочным выводам.
8) На определение могут повлиять циркулирующие антитела
к Т4 и ингибиторы связывания гормона.
9) Показано, что гепарин оказывает влияние на уровень fT4
in vivo и in vitro. Пробы пациентов проходящих
гепариновую терапию, должны отбираться перед
введением антикоагулянта.
НАБОР НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ СКРИНИНГА
НОВОРОЖДЕННЫХ.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Было проведено исследование взрослой эутиреоидной
популяции для получения результатов на этом наборе.
Результаты исследования показаны в таблице 1.
Таблица 1. Ожидаемые значения для FT4 в нг/дл
Взрослые
(89 образцов)
Значение (X) 1.4
Стандартное отклонение (σ) 0.3
Ожидаемый диапазон (±2 о) 0.8 – 2.0
Беременные
(31 образец)
1.5
0.37
Важно иметь ввиду, что установленный диапазон
значений, который можно ожидать у данной популяции
"нормальных" людей с использованием данного метода
зависит от множества факторов: специфичности метода,
тестируемой популяции и точности метода в руках
лаборанта. По этим причинам каждая лаборатория
должна установить свой собственный диапазон
нормальных значений.
ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
А. Воспроизводимость
Воспроизводимость набора на fT4 внутри серии и между
сериями определялась в анализе пулов сывороток трех
разных уровней. Число, значение, стандартное
отклонение и коэффициент вариации для этих сывороток
приведены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
Воспроизводимость внутри серии (Значения в нг/дл)
низкий средний высокий
Количество
(n)
20 20 20
среднее 0,550 1,740 3,250
1 S. D. 0,061 0,074 0,106
% C. V. 10,98 4,26 3,25
Таблица 3
Воспроизводимость между сериями (в нг/дл)
низкий средний высокий
Количество
(n)
10 10 10
среднее 0,480 1,410 3,490
1 S. D. 0,052 0,085 0,279
% C. V. 10,81 6,01 7,90
* Измерения проводились в 10 экспериментах в дублях в
течение 6 месяцев. При этом 3 лаборанта использовали 5
различных наборов реагентов.
В. Сравнение методов (точность).
Настоящий метод сравнивался с референсным
радиоиммунным методом. Использовались образцы
гипотироидных, эутироидных и гипертироидных
пациентов (диапазон значений от 0.1 до 8 нг/дл). Общее
число образцов было 197. Было выведено уравнение
регрессии и рассчитан коэффициент корреляции для fT4
ИФА в сравнении с референсным методом. Полученные
данные приведены в таблице 4.
Monobind_fT4_(Cat#) Version 6(120105)
Таблица 4.
Метод
«х» (ИФА)
«у»
(Референсный)
Среднее (х) Уравнение
1.63 у=0.0917+0.9339х
1.61
Только незначительное расхождение данного метода и
референс-метода было найдено, что доказывают близкие
средние значения. Уравнение регрессии и коэффициент
корреляции показывают прекрасную согласованность методов.
С. Чувствительность.
Метод имеет чувствительность 0.05 нг/дл. Предел
обнаружения определен статистически как концентрация,
соответствующая значению оптической плотности нулевого
стандарта (нг/дл) плюс 2σ (ст -стандартное отклонение) при
95% доверительном интервале.
D. Специфичность.
Влияние перекрестных реакций оценивалось при добавлении
мешающих веществ в различных концентрациях к сыворотке.
Кросс-реактивность рассчитывали как соотношение между
дозой интерферирующего вещества к дозе тироксина,
необходимого для замещения одинакового количества метки.
Вещество Пер. реакции Концентрация
1 - тироксин 1.0000 -
d-тироксин 0.9мкг/дл
d-трииодтиронин 0.0мкг/дл
мкг/дл
Иодотирозин 0.0мкг/мл
Дииодотирозин 0.0мкг/мл
Дииодотиронин 0.0мкг/мл
TBG N/D 40 мкг/мл
Альбумин N/D 40 мкг/мл
Фенилбутазон N/D 10 мкг/мл
Фенитоин N/D 40 мкг/мл
салицилаты N/D 500 мкг/мл
Участник размещения заказа _________________
(подпись)
