Приложение 6-3
Набор реагентов для количественного определения концентрации тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови
НАЗНАЧЕНИЕ
Количественное определение концентрации тиреотропного
гормона в человеческой сыворотке.
ВВЕДЕНИЕ
Измерение в сыворотке концентрации ТТГ, гликопротеина с
молекулярным весом 28 кД и секретируемого передней долей
гипофиза, является наиболее чувствительным из имеющихся
тестов для диагностики первичного и вторичного (гипофизарного)
гипотиреоза (1,2). Повышение в сыворотке концентрации ТТГ,
который первично отвечает за синтез и секрецию тиреоидных
гормонов, - ранний и чувствительный маркер снижения резервов
тироидов, и, в совокупности со сниженной концентрацией Т4,
является диагностическим критерием первичного гипотиреоза.
Рост уровня ТТГ демонстрирует классическую систему
отрицательной обратной связи между гипофизом и щитовидной
железой. Первичная недостаточность щитовидной железы
уменьшает секрецию тиреоидных гормонов, что по системе
обратной связи стимулирует освобождение ТТГ из гипофиза.
Кроме того, измерения ТТГ также полезны и для дифференциации
вторичного и третичного (гипоталамического) гипотиреоза от
первичного. Высвобождение ТТГ из гипофиза регулируется
тиреотропин-рилизинг фактором (ТРФ), который секретируется
гипоталамусом при прямом действии тиреоидных гормонов ТТГ и
Т4. Рост концентрации ТТГ и Т4 уменьшает ответ гипофиза на
стимулирующие эффекты ТРФ. При вторичном и третичном
гипотиреозе концентрации Т4 обычно низки, а уровни ТТГ низки
или нормальны. И в том и в другом случае дефицит ТТГ
вызывается как гипофизарной недостаточностью (вторичный
гипотиреоз), так и недостаточной стимуляцией гипофиза ТРФ
(третичный гипотиреоз). Тест стимуляцией ТРФ дифференцирует
эти состояния. При вторичном гипотиреозе ответ ТТГ на ТРФ
нормальный или задержанный, а резкий положительный ответ
получается при третичном гипотиреозе.
В дальнейшем появление иммуноферментных исследований
обеспечило лаборатории тестом с достаточной чувствительностью
для возможности дифференциации гипертиреоза от эутиреоза и
увеличило u1101 эффективность измерения ТТГ. Данный метод является
тестом второго поколения, который позволяет дифференцировать
состояние гипертиреоза от эутиреоза. Функциональная
чувствительность (<20% CV между анализами) при часовой
инкубации - 0.195 μМЕ/мл, а при двух часовой - 0.095μМЕ/мл (3).
В этом методе Стандарты ТТГ, пробы пациента или контроли
сначала добавляются в микроячейки, покрытые стрептавидином.
Затем добавляются биотинилированные моноклональные антитела
и фермент-меченые антитела (конъюгат), и реагенты
перемешиваются. Реакция между различными ТТГ-антителами и
нативным ТТГ образует сэндвичевый комплекс, который
связывается со стрептавидином в ячейках.
После завершения необходимого инкубационного периода
антитела, связанные с коньюгатом, отделяются от несвязавшегося
коньюгата промывкой. Активность фермента на поверхности
ячеек измеряется реакцией с подходящим субстратом.
Использование стандартов ТТГ с известными различными
концентрациями позволяет построить калибровочную кривую.
Концентрации ТТГ в неизвестных образцах находят по этой
калибровочной кривой.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Настоящие реагенты, требующиеся для иммуноферментного
анализа, включают высокоочищенные и специфичные антитела в избыточном количестве (фермент-конъюгированные и
иммобилизованные) для распознавания различных
индивидуальных эпитопов и естественный антиген. В процессе
анализа на поверхности микроячеек происходит иммобилизация
при взаимодействии стрептавидина, покрывающего ячейки, и
добавленных экзогенных биотинилированных анти-ТТГ антител.
При смешивании моноклональных биотинилированных антител,
ферментного коньюгата и сыворотки, содержащей естественный
антиген, между нативным антигеном и антителами происходит
реакция (без конкуренции или пространственных затруднений) с образованием растворимого сэндвичевого комплекса.
Взаимодействие иллюстрируется следующим уравнением:
kaEnzAb(p)+AgTSH+BtnAb(m) EnzAb(p) - AgTSH - BtnAb(m)
k-a где
BtnAb(m) = биотинилированные моноклональные антитела
(избыточное количество);
AgTSH = нативный антиген (переменное количество);
EnzAb(p) = фермент-меченые поликлональные антитела
(избыточное количество);
EnzAb(p) - AgTSH - BtnAb(m) = сэндвичевый комплекс антиген-
антитело;
ka = константа скорости ассоциации;
k - а = константа скорости диссоциации.
Одновременно комплекс образуется в ячейках благодаря высокой
аффинности реакции стрептавидина и биотинилированных
антител. Это взаимодействие иллюстрируется ниже:
EnzAb(p)-AgTSH-BtnAb(m)
+ StreptavidinC. W. ⇒ immobilized complex
где
StreptavidinC. W. = стрептавидин, иммобилизованный на ячейках
Immobilized complex = сэндвичевый комплекс, связанный с
твердой поверхностью.
После достижения равновесия фракция, связанная с антителами,
отделяется от несвязавшихся антигенов декантацией или
промывкой. Активность фермента во фракции связанных антител прямо пропорциональна концентрации нативного антигена. При использовании нескольких стандартов с известным значением концентрации антигена строится калибровочная кривая, по
которой вычисляется концентрация неизвестных образцов.
РЕАГЕНТЫ НА 96 ОПРЕДЕЛЕНИЙ
А. Стандарты ТТГ - 1 мл во флаконе - значки A-G
Cемь флаконов референсной сыворотки с концентрациями ТТГ 0
(A), 0.5 (B), 2.5 (C), 5.0 (D), 10 (E), 20 (F) и 40 (G) мкМЕ/мл.
Хранить при 2-8оС. Содержат консервант.
Замечание: Стандарты на основе человеческой сыворотки были
прокалиброваны по 2-му Международному Стандарту ВОЗ 80/558.
B. ТТГ-ферментный реагент - 13 мл во флаконе - значок E
Один флакон, содержащий фермент-меченые аффинно очищенные
поликлональные козьи антитела, биотинилированные
моноклональные мышиные IgG в буфере, краситель и консервант.
Хранить при 2-8оС.
C. Планшет, покрытый стрептавидиномячеек -
значок⇓
Один 96-луночный микропланшет, покрытый стрептавидином и
упакованный в алюминиевую фольгу с осушителем. Хранить при
2-8°C.
D. Концентрат промывочного буфера – 20 мл - значок
Один флакон, содержащий ПАВ в фосфатном буфере. Содержит
консервант. Хранить при 2-30оС.
Е. Cубстрат А - 7 мл во флаконе - значок SA
Один флакон, содержащий ТМБ в буфере. Хранить при 2-8оС.
F. Cубстрат B - 7 мл во флаконе - значок SB
Один флакон, содержащий перекись водорода в буфере. Хранить
при 2-8оС.
G. Стоп-раствормл во флаконе - значок STOP
Один флакон, содержащий сильную кислоту (1N HCl).
Хранить при 2-30оС.
Замечание 1. Не используйте реагенты с истекшим сроком
годности.
Замечание 2. Открытые реагенты стабильны 60 дней при
хранении от 2 до 8 оС.
Замечание 3. Замечание 3. Все реагенты предназначены для
одного планшета.
Набор предназначен для диагностики in vitro
Не для использования в качествве лекарственного средства людьми
или животными
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ
Замечания и предостережения
Потенциально опасный биоматериал. В материалах набора
используется человеческая сыворотка. Используемая в
наборе сыворотка не содержит поверхностный антиген
гепатита В и антитела к ВИЧ (HIV 1&2) и гепатиту С,
протестирована методами, одобренными FDA. Однако,
поскольку не существует методов, дающих полную
гарантию отсутствия инфекционных агентов, с реагентами
следует обращаться с осторожностью как с потенциально
опасным биоматериалом, как рекомендуется для любых
образцов крови.
СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Образцами служит сыворотка крови. Должны соблюдаться
обычные меры предосторожности. Для сопоставимого сравнения
нормальных значений должна быть получена утренняя сыворотка
(натощак). Кровь следует собирать в пробирки с красной
маркировкой без добавок или геля-разделителя. Позвольте крови
свернуться. Для отделения сыворотки используйте центрифугу.
Образцы могут храниться при 2-8oC до 5 дней. Если образцы не
могут быть проанализированы за это время, они могут быть
заморожены до -20oC на период до 30 дней. Избегайте повторных
циклов заморозки и оттаивания. Для анализа в дублях требуется
0.100 мл образца.
Требуемые материалы, не поставляемые с набором
1. Микродозаторы на 50 мкл и 100 мкл с точностью не хуже 1.5%.
2. Диспенсеры на 100 и 300 мкл с точностью не хуже 1.5%.
3. Микропланшетный вошер.
4. Микропланшетный ридер с длиной волны 450 нм и 620 нм.
5. Диспенсер переменного объема ( мкл) для разбавления
реагентов.
6. Контейнер(ы) для смешивания реагентов (см. ниже).
7. Фильтровальная бумага для высушивания микроячеек.
8. Пластиковая пленка для инкубирования.
9. Вакуумный осушитель для стадии промывки.
10. Таймер.
11. Контейнер для хранения промывочного буфера.
12. Дистиллированная или деионизированная вода.
13. Контрольные материалы поставляются ,
Москва,
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
1. Рабочий промывочный буфер. Разбавьте содержимое
концентрата промывочного буфера до 1000 мл. Хранить при
комнатной температуре (20-27оС) до 60 дней.
2. Рабочий субстратный раствор. Определите количество
требуемого реагента и смешайте равные доли Субстратов А и
В в подходящей емкости. Например, для двух стрипов по 8
ячеек каждый смешайте по 1 мл (небольшое превышение
необходимого количества). Раствор может быть использован в
течение 60 дней при условии хранения при 2-8оС.
Замечание: не используйте Рабочий субстратный раствор, если он
приобрел голубую окраску.
ПРОТОКОЛ АНАЛИЗА
Перед началом анализа все реагенты, стандарты и контроли
должны достичь комнатной температуры (20-27оС).
1. Выберите необходимое количество лунок для образцов,
стандартов и контролей для постановки в дублях. Верните
неиспользуемые стрипы в алюминиевый пакет и плотно
закройте его. Храните при 2-8оС.
2. Добавьте 50 мкл стандартов, контролей и образцов в
соответствующие ячейки.
3. Добавьте 100 мкл ТТГ-ферментного реагента в каждую ячейку.
Очень важно добавлять все реагенты близко ко дну
микроячеек.
4. Осторожно перемешайте планшет в течение 20-30 секунд и
накройте его.
5. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре.**
6. Удалите содержимое ячеек декантацией или аспирацией.
Высушите _________планшет на фильтровальной бумаге
чтобы избежать различий во времени реакции в разных
ячейках.
Не встряхивайте планшет после добавления субстрата!
9. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
10. Остановите развитие окраски добавлением в каждую ячейку 50
мкл стоп-раствора и перемешайте ячейки в течение 15-20
секунд. Всегда добавляйте реагенты в одной и той же
последовательности, чтобы избежать различий во времени
реакции в разных ячейках.
11. Измерьте величины поглощения содержимого ячеек при 450
нм (референсная длина волны 620-630 нм). Измерения
должны быть проведены в пределах 30 минут после
добавления стоп-раствора.
** Для лучшей конечной чувствительности (< 0.5 мкМЕ/мл)
инкубируйте 120 минут при комнатной температуре. Стандарт
40 мкМЕ/мл не должен использоваться, так как его оптическая
плотность будет более 3 единиц. Выполните оставшиеся шаги.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна использовать контроли,
соответсвующие гипотиреозу, эутиреозу и гипертиреозу для
мониторинга правильности теста. Эти контроли должны
исследоваться как неизвестные образцы в каждой серии анализа.
Должны строиться карты контроля качества для отслеживания
характеристик поставляемых реагентов. Каждая лаборатория
должна установить приемлемые характеристики набора. К числу
других параметров, за которыми следует следить, относится 80, 50
и 20% интерсепт стандартной кривой для воспроизводимости изо
дня в день между анализами. И, наконец, максимум абсорбции
должен согласовываться с предыдущими экспериментами.
Значительные отклонения от установленных характеристик могут
свидетельствовать об изменениях в условиях эксперимента или
разложении реагентов набора. Для установления причины
изменений должны быть использованы свежие реагенты.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для определения концентрации ТТГ в неизвестных образцах
используется калибровочная кривая.
1. Запишите значения оптической плотности для всех ячеек как
показано в примере 1.
2. Для построения калибровочной кривой используйте средние
из двух u1086 оптических плотностей для каждого стандарта в
зависимости от концентрации ТТГ в мкМЕ/мл.
3. Проведите оптимальную калибровочную кривую.
4. Определите неизвестные концентрации ТТГ в контролях и
образцах, используя калибровочную кривую, используя
средние значения оптической плотности для каждого образца.
В приведенном ниже примере средняя абсорбция 1.019
пересекает стандартную кривую при 15.3 мкМЕ/мл (см. рис.1)
ПРИМЕР 1
№
образца
№
ячейки
ОП
(абсорбция)
ОП,
среднее
концентрация,
мкМЕ/мл
A1 Стандарт А B1 00..000
Стандарт B DC11 00..003
Стандарт C FE11 00..117
Стандарт D HG11 00..336
Стандарт E BA22 00..774
Стандарт F C2 1.
D2 1.431
Стандарт G E2 2.633
F2 2.530
2.581 40
Контроль G2 0.382
H2 0.388
0.
Пациент AB33 11..002
Рисунок 1
*Данные приведены в примере 1 и на рис. 1 только для
иллюстрации и не должны использоваться для построения
стандартной кривой.
ПАРАМЕТРЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА
1. Оптическая плотность Калибратора 40 мкМЕд/мл > 1.3
2. Четыре из шести контролей качества должны
укладываться в установленные интервалы.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
A. Характеристики набора
1. Для воспроизводимости результатов важно, чтобы время
реакции поддерживалось постоянным в каждой ячейке.
2. Пипетирование образцов не должно превышать 10 минут.
3. Если используется больше, чем один планшет, рекомендуется
повторять калибровочную кривую.
4. Добавление раствора субстрата инициирует кинетическую
реакцию, которая останавливается при добавлении стоп-
раствора. Следовательно, добавление субстрата и стоп-
раствора должно проводиться в одинаковой
последовательности для устранения различий во времени
реакции в разных лунках.
5. Измерение оптической плотности на ридере проходит
вертикально. Не прикасайтесь ко дну микроячеек.
6. Плохая промывка ячеек может приводить к
невоспроизводимым результатам.
7. Все компоненты набора должны быть одного лота и должны
храниться в одинаковых условиях.
8. Для анализа не подходят сильно липемические или
гемолизованные образцы и образцы с выраженной
контаминацией.
В. Интерпретация результатов
1. Если для обработки результатов u1090 теста используется
компьютер, то точность стандартов - не более 10%.
2. Концентрация ТТГ в сыворотке зависит от множества
факторов: функции гипоталамуса, функции щитовидной
железы, ответа гипофиза на ТРФ. Таким образом, определение
одной лишь концентрации ТТГ не является достаточным для
оценки клинического статуса.
3. Уровни ТТГ в сыворотке могут быть повышены при приеме
некоторых лекарств. Отмечено, что прием домпериодона,
амиодарона, иодида, фенобарбитала и фенитоина повышает
уровни ТТГ.
4. Понижение уровней ТТГ может быть связано с приемом
пропранолола, метимазола, допамина, d-тироксина (4).
5. Генетические вариации или разложение интактного ТТГ на
субъединицы могут влиять на заявленные характеристики
антител и влиять на конечный результат. Такие образцы
обычно дают разные результаты на различных тест-системах в
зависимости от используемых антител.
НАБОР НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ СКРИНИНГА
НОВОРОЖДЕННЫХ
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Было проведено исследование взрослой эутиреозной популяции
для получения результатов на этом наборе. Результаты
исследования показаны в таблице 1. Использовался
непараметрический метод оценки (95% перцентиль).
Таблица 1.
Ожидаемые значения для ТТГ в мкМЕ/мл
Число 139
Низкий нормальный уровень 0.39
Высокий нормальный уровень 6.16
70% доверительный интервал для 2,5% перцентиля
Низкий уровень 0.28 – 0.53
Высокий уровень 5.60 – 6.82
Важно иметь ввиду, что установленный диапазон значений,
который можно ожидать у данной популяции “нормальных”
людей с использованием данного метода зависит от множества
факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и
точности метода в руках лаборанта. По этим причинам каждая
лаборатория должна установить свой собственный диапазон
нормальных значений.
Характеристики набора
А. Воспроизводимость.
Воспроизводимость набора на ТТГ внутри серии и между сериями
определялась при анализе контрольных сывороток трех разных
уровней. Число, значение, стандартное отклонение и коэффициент
вариации для этих сывороток приведены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
Воспроизводимость внутри серии (Значения в мкМЕ/мл)
Образец N X S. D. C. V.
пул 11%
пул 24%
пул 3.6%
Таблица 3
Воспроизводимость между сериями (в мкМЕ/мл)
Образец N X S. D. C. V.
пул 13%
пул 29%
пул 3.9%
* Измерения проводились в 10 экспериментах в дублях в течение 7
дней.
В. Точность.
Настоящий метод сравнивался с референсным
иммунохемилюминесцентным методом. Использовались образцы
от пациентов u1089 с гипо-, эу - и гипертиреозом (диапазон значений от
0.01 до 61 мкМЕ/мл). Общее число образцов было 241. Было
выведено уравнение линейной регрессии (y=mx+b) и был
рассчитан коэффициент корреляции для ТТГ ИФА в сравнении с
референсным методом.
Полученные данные приведены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод Среднее (х) Уравнение Коэф. корр.
Этот метод 4.54 y = 0.47 + 0.968 (x) 0.995
Референсный 4.21
Только незначительное расхождение данного метода и референс-
метода было найдено, что доказывают близкие средние значения.
Уравнение регрессии и коэффициент корреляции показывают
прекрасную согласованность методов.
С. Чувствительность.
Предел обнаружения определен статистически как концентрация,
соответствующая значению оптической плотности нулевого
стандарта (нг/дл) плюс 2σ (σ -стандартное отклонение) при 95%
доверительном интервале.
Для инкубации 1 час = 0.078 мкМЕ/мл.
Для инкубации 2 часа = 0.027 мкМЕ/мл
D. Специфичность
Перекрестные реакции метода к определенным веществам
оценивались при добавлении мешающих веществ в различных
концентрациях к сывороточной матрице. Кросс-реактивность
рассчитывалась как отношение между дозой мешающего вещества
и дозой ТТГ, необходимого для получения такой же
оптической плотности.
Вещество Перекрестные Концентрация
реакции
ТТГ 1.0000 -
ФСГ < 0.0ng/ml
ЛГ < 0.0ng/ml
ХГЧ < 0.0ng/ml
E. Корреляция между инкубацией 1 час и 2 часа
Проводилось сравнение методик с одно - и двухчасовой
инкубацией. Использовались 30 образцов в диапазоне 0.1 – 18.5
мкМЕ/мл. Было получено уравнение регрессии и коэффициент
корреляции для 2-х часовой методики (y) в сравнении с часовой
методикой (x). Показано, что методы великолепно коррелируют:
Y = 0.986 (x) + 0.119
Коэффициент корреляции: 0.998
Участник размещения заказа ________________
(должность) (подпись)
