Использование сконструированных in vitro про-моторов для регуляции гена аминотрансфера-зы e. coli и их изучение

О. А. СУСЛОВА, 1В. Г. ДОРОШЕНКО

Московский инженерно-физический институт (государственный университет)

1, Москва

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СКОНСТРУИРОВАННЫХ in vitro ПРОМОТОРОВ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ E.coli И ИХ ИЗУЧЕНИЕ

Данная работа связана с исследованием такого механизма, как регуляция экспрессии генов, которая является одной из наиболее значимых при конструировании новых микроорганизмов, продуцирующих биологически активные вещества. Нашей задачей было интегрировать в хромосому E.coli перед геном tyrB, кодирующим трансаминазу [1], три различных по силе промотора и использовать полученные конструкции для выбора подходящей активности этого гена для конструирования штаммов-продуцентов аминокислот.

Современное конструирование штаммов-продуцентов биологически активных веществ методами метаболической инженерии основано на использовании известных механизмов регуляции жизнедеятельности микроорганизма, на основе которого получают данный продуцент [2]. Одним из уровней такой регуляции является регуляция экспрессии генов [3].

Ранее в лаборатории для конструирования продуцентов на основе бактерии E.coli была получена библиотека промоторов, различающихся по активности. В эту библиотеку были включены как известные сильные промоторы некоторых генов E.coli и фагов, размножающихся на этой бактерии, так и специально полученные ослабленные или усиленные варианты этих промоторов. Использование нескольких промоторов различной силы для активации одного и того же гена, белковый продукт которого в продуценте катализирует одну из реакций цепи биосинтеза его продукта, позволяет подбирать оптимальный для каждого конкретного процесса уровень экспрессии данного гена. Данная библиотека промоторов была создана на плазмиде [4], производной известной плазмиды pBR322, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat), по уровню устойчивости к которому оценивали силу промотора. Между кодирующей рамкой гена cat и клонированным промотором был вставлен терминатор транскрипции TthrL, благодаря которому удалось клонировать сильные промоторы на многокопийной плазмиде.

Перед нами была поставлена задача интегрировать в хромосому E.coli перед геном tyrB три различных по силе промотора, промотор фага λ PL и два его специально полученных ослабленных варианта (обозначенные как PL–II и PL-III) из данной библиотеки. Ген tyrB кодирует трансаминазу, которая катализирует последние стадии биосинтеза некоторых аминокислот. Полученные конструкции предполагалось использовать для выбора подходящей активности этого гена при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот.

Все три промотора PL , PL –II, PL-III были интегрированы перед геном tyrB в хромосому штамма E.coli, лизогенного по фагу λ, с помощью Red системы фага λ. Штамм, лизогеный по фагу λ использовался для того, чтобы обеспечить «молчащее» состояние гена tyrB , возможная сильная активация которого после интеграции вышеперечисленных промоторов, могла бы не допустить отбора требуемых интегрантов. Перед промоторами, в качестве маркера для отбора колоний на чашках, был также интегрирован ген cat. После получения штаммов E.coli(λ+), содержащих PL - tyrB, PL–II - tyrB, PL-III - tyrB, перечисленные конструкции были перенесены с помощью трансдукции фагом Р1 в штамм E.coli MG1655. Измерение активности трансаминазы в полученных штаммах показало, что промоторы PL–II и PL-III сообщали гену tyrB одинаковую активность (9 + 2 ед/мкг белка), которая была в два раза меньше активности PL - tyrB (21 + 2 ед/мкг белка), в то время как данные промоторы в составе плазмиды сообщали клеткам различные уровни устойчивости к хлорамфениколу: PL-III - cat – 25 мкг/мл, а PL –II - cat -150 мкг/мл. Конструкция PL – cat соответствовала при этом уровню устойчивости к хлорамфениколу, более 400 мкг/мл.

Для объяснения наблюдаемых различий в сравнительных активностях промоторов PL–II и PL-III, подставленных перед генами cat и tyrB, исследовали их транскрипцию in vitro. Оказалось, что в полученных конструкциях PL–II – cat, PL-III – cat и PL–II - tyrB, PL-III - tyrB транскрипция инициируется с различных регуляторных элементов. Возможно также, что наличие терминатора между геном cat и промоторами стабилизирует транскрипцию.

Список литературы

1.  Pittard A. J. Biosynthesis of the aromatic amino acids // DC: ASM Press. 1996.

2.  Дебабов микроорганизмов на заре XXl века // Биотехнология. 2005.

3.  Hung She-pin, Badi P., Hatfield G. Wesley Global gene expression profiling in Esherichia coli // The Journal of Biological Chemistry. 2002.

4.  , , Машко и исследование стабильности векторных молекул для экспрессии гетерологичных генов под контролем высокоэффективных промоторов и колифагов // Биотехнология. 1988.