А. В. ЕРШОВА

Научный руководитель – Ю. Н. ЗАХАРОВ, к. ф.-м. н., доцент

Нижегородский государственный университет им. Н. И.  Лобачевского

восстановление реальной динамики
процессов посредством сканирующей
микроскопии

При изучении функциональной активности клеток мозга методом флуоресцентной микроскопии актуальным является получение верных численных данных о динамике концентрации ионов кальция. При использовании ЛСКМ времена сканирования задаются и указываются программным обеспечением ПК, управляющим оборудованием. Однако без учета реального функционирования прибора можно неадекватно интерпретировать указанные параметры. Кроме того, характеристики из программного обеспечения нуждаются в калибровке для получения истинных значений. Было проведено изучение временных характеристик сканирования целых кадров, отдельных линий и точек кадра, установлено соотношение этих данных реальным. В полученном соотношении выделен линейный участок динамического диапазона и описаны нелинейные участки. Полученная информация позволяет делать верные выводы о результатах проводимых исследований.

В работе рассматривается проблема получения верных количественных данных экспериментов по исследованию процессов передачи сигналов в нейрон-глиальных сетях, проводимых на клетках гиппокампа мышей и крыс с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

При изучении функциональной активности клеток мозга методом флуоресцентной микроскопии актуальным является получение информации о динамике концентрации ионов кальция, которые играют большую роль в жизнедеятельности клеток и передаче информации.

В данном случае преимущество конфокальной микроскопии в том, что она обеспечивает увеличение контраста изображения, которое приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности флуоресценции до 256:1. Также в конфокальной микроскопии несколько улучшается разрешение в плоскости объекта (в 1.5 раза) и достигается высокое разрешение вдоль оптической оси [1].

Управление всей системой, получение, обработка и хранение изображений осуществляется компьютером. Процесс получения сканируемых изображений складывается из следующих стадий: позиционирования сфокусированного лазерного пучка на определенной точке объекта и перемещении его между отдельными точками строк растра. Времена сканирования задаются и указываются программным обеспечением (ПО) LSM 510 DuoScan. Освещение осуществляется в импульсном режиме, который включает в себя стадию затемнения, приходящегося на перестройку оптической системы от точки к точке. Поэтому без учета реального функционирования прибора указываемые параметры можно неадекватно интерпретировать. Таким образом, характеристики из программного обеспечения нуждаются в калибровке для получения истинных значений, необходимых при обработке изображений с целью получения количественной информации в изучаемых процессах.

Изучение временных характеристик сканирования выявило различие в скважности освещения поля объекта сканирующей системой микроскопа при различных значениях разрешения и ширины поля зрения, а также в зависимости от скорости сканирования. В полученном соотношении выделен линейный участок динамического диапазона и описаны нелинейные участки. К сожалению, не удается представить зависимость времени перестройки между отдельными строками от скорости сканирования, увеличения и дискретизации в виде простой функции, поэтому были составлены таблицы этих значений для случая построчного сканирования без изменения направления движения луча лазера и его возвратно-поступательного движения. Также измерено распределение времени облучения всего кадра и возврата к началу следующего кадра от устанавливаемых параметров сканирования. В результате установлено соотношение между реальными временными характеристиками сканирования и данными, приводимыми в окне интерфейса программного обеспечения, управляющего процессом сканирования.

Аналогичные проблемы возникают при попытке вычислить реальную мощность облучения объектов лазерами, так как приводимые в окне управления значения пропускания фильтра нелинейно связаны с выходной мощностью под объективом микроскопа. На самом деле нужно учитывать коэффициент пропускания всей оптической схемы, который зависит от длины волны и применяемого объектива. Также для этого было определено распределение мощности по отдельным линиями лазеров. Проведенные измерения позволяют определять реальные значения физических параметров микроскопа.

Список литературы

1. Webb R. H. Confocal optical microscopy // Rep. Prog. Phys. P.427-471.