Приложение 6-1 к извещению от _________ №____
Набор реагентов для количественного определения концентрации свободного трийодтиронина (fТ3) в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа
Назначение: количественное определение концентрации свободного трииодтиронина (fТ3) в человеческой сыворотке. Считается, что уровни fT3 отражают количество Т3, доступного клеткам, и могут, таким образом, определять клинический метаболический статус Т3.
Введение
Трииодотиронин - тиреоидный гормон, большей частью
(> 99.5%) находится в связанном с белками состоянии (1,2). Основной транспортный белок - тироксинсвязывающий глобулин (ТСГ). Однако, полагают, что за биологическую активность ответственна только свободная (несвязанная часть) Т3. Далее, концентрации белков-переносчиков изменяются в различных клинических состояниях, например, таких, как беременность. При нормальной тиреоидной функции при изменении концентрации транспортных белков уровень общего Т3 также изменяется, а концентрация fТ3 остается постоянной. Таким образом, концентрации fТ3 более надежно коррелируют с клиническим статусом, чем уровни общего Т3.
Беременность, употребление контрацептивов или эстрогенотерапия приводят к повышению уровней общего Т3, в то время как концентрации свободного Т3 остаются практически неизменными.
Технология ИФА обеспечивает оптимальную чувствительность при минимуме технических приемов при прямом определении fТ3. В этом методе в ячейки планшета сначала добавляются стандарты, исследуемые образцы и контроли. Затем добавляется ферментный-Т3 конъюгат, и реактивы перемешиваются. Происходит конкурентная реакция между трииодтиронином образца и ферментным коньюгатом за ограниченное количество мест связывания антител, иммобилизованных в ячейках.
После окончания инкубации связавшийся с антителами ферментный-Т3 конъюгат отделяется от несвязавшегося аспирацией. Активность фермента в лунках определяется количественно в реакции с субстратным реактивом по развивающейся окраске раствора.
Использование различных стандартов fТ3 позволяет построить график зависимости активности фермента от концентрации. Сравнивая активность неизвестного образца, можно рассчитать концентрацию fТ3 в нем.
Принцип метода
Конкурентный ИФА для fT3
Настоящие реагенты, требующиеся для твердофазного иммуноферментного анализа включают иммобилизованные Т3-антитела, Т3-ферментный коньюгат и нативный Т3-антиген. Ферментный коньюгат не должен связываться с белками сыворотки, особенно с ТСГ и альбумином. Метод достигает этой цели.
При смешивании иммобилизованных антител, ферментного Т3-коньюгата и сыворотки, содержащей свободный антиген Т3, между нативным свободным Т3 антигеном и ферментным коньюгатом происходит конкурентная реакция за ограниченное число мест связывания. Взаимодействие иллюстрируется следующим уравнением:
ka
EnzAg + Ag + AbC. W. AgAbC. W. + EnzAgAbC. W AgAbC. W.
k-a
Abc. w - моноспецифичные иммобилизованные антитела (постоянное количество)
Ag - нативный свободный антиген (переменное количество)
EnzAg – антиген-ферментный коньюгат (постоянное количество)
AgAbc. w. - комплекс антиген-антитело
EnzAgAbc. w. - комплекс антиген-ферментный коньюгат - антитело
Ka - константа скорости ассоциации
K-a - константа скорости диссоциации
K = Ka / K-a = константа равновесия
После достижения равновесия фракция связанных антител отделяется от несвязанных антигенов декантацией или аспирацией. Активность фермента во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации нативного свободного антигена. При использовании нескольких стандартов с известным значением концентрации антигена строится калибровочная кривая, по которой вычисляется концентрация неизвестных образцов.
Реагенты для 96-луночного планшета
А. Стандарты человеческой сыворотки - 1 мл во флаконе - значки A-F
Шесть флаконов стандартов сыворотки для свободного Т3 с примерными концентрациями 0 (A), 0.4 (B), 1.2 (C), 4,5 (D), 8.0 (E) и 18 (F) пг/мл. Хранить при 2-8оС. Содержат консерванты. Точные концентрации указаны на этикетках, специфичных для данного лота.
Для единиц СИ: 1 пг/мл х 1.536 = пмоль/л
B. Ферментный коньюгат – 10.5 мл во флаконе - значок E
Один флакон, содержащий коньюгат трииодтиронин-пероксидаза хрена в растворе бычьего альбумина -
стабилизирующей матрице. Содержит консервант. Хранить при 2-8оС.
С. Микропланшет с нанесенными антителами - 96 ячеек - значок
Один микропланшет, покрытый овечьей анти-Т3 сывороткой и упакованный в пакет с осушителем. Хранить при 2-8оС.
D. Концентрат промывочного буфера - 20 мл - значок
Один флакон, содержащий ПАВ в фосфатном буфере. Содержит консервант. Хранить при 2-30оС.
E. Cубстрат А - 7 мл - значок SA
Один флакон, содержащий ТМБ в буфере. Хранить при 2-8оС.
F. Cубстрат B - 7 мл - значок SB
Один флакон, содержащий перекись водорода в буфере. Хранить при 2-8оС.
G. Cтоп-раствор - 6 мл - значок STOP
Один флакон, содержащий кислоту (1N HCl). Хранить при 2-30оС.
Замечание 1. Не используйте реагенты с истекшим сроком годности.
Замечание 2. Открытые реагенты стабильны 60 дней при хранении от 2 до 8 оС.
Замечания и предостережения
Набор предназначен только для диагностики in vitro.
Не для использования в качестве лекарственного средства для людей или животных.
Потенциально опасный биоматериал. Матрицей стандартов и контролей является человеческая сыворотка. Используемая в наборе сыворотка отрицательна на ВИЧ и поверхностный антиген гепатита В и протестирована методами, одобренными FDA. Однако, поскольку не существует методов, дающих полную гарантию отсутствия инфекционных агентов, с реагентами следует обращаться с осторожностью как с потенциально опасным биоматериалом, как рекомендуется для любых образцов крови.
Сбор и хранение образцов
Соберите образцы в пробирки. Должны соблюдаться обычные меры предосторожности. Отделите эритроциты центрифугированием и используйте сыворотку для определения fТ3. Образцы могут храниться при 2-8оС до 48 часов. Для более длительного хранения ( до 30 дней ) можно замораживать пробы до -20оС. Для анализа в дублях требуется 0.10 мл сыворотки.
Перекрестные реакции антител Т3 к различным веществам оценивались добавлением мешающих веществ в различных концентрациях к сывороточной матрице. Кросс-реактивность рассчитывалась как отношение между дозой мешающего вещества и дозой Т3, требуемого для замещения этого количества вещества.
Вещество Перекрестные Концентрация
реакции
I-Т3 1.0000 -
I-Т4 <0.0мкг/мл
Иодотирозин <0.0мкг/мл
Дииодотирозин <0.0мкг/мл
Дииодотиронин <0.0мкг/мл
Фенилбутазон <0.0мкг/мл
Салицилат Na <0.0мкг/мл
Материалы, поставляемые с набором
1. Шесть флаконов стандартов свободного Т3 в человеческой сыворотке.
2. Один флакон Т3-ферментного коньюгата.
3. Один 96-луночный микропланшет, покрытый антителами.
4. Один флакон концентрата промывочного буфера
5. Один флакон субстрата А
6. Один флакон субстрата B
7. Один флакон стоп-раствора
8. Инструкции
Требуемые материалы, не поставляемые с набором
1. Микродозаторы на 50 мкл с точностью не хуже 1.5%
2. Диспенсеры на 100 и 300 мкл с точностью не хуже 1.5%
3. Диспенсеры переменного объема на 1-20 мл для приготовления субстрата.
4. Цилиндры мерные на 20-200 мкл и мкл для разбавления промывочного буфера, коньюгата и субстрата.
5. Микропланшетный вошер
6. Микропланшетный ридер с длиной волны 450 нм и 620 нм.
7. Пробирки для приготовления субстрата.
8. Фильтровальная бумага для высушивания микроячеек.
9. Пластиковая пленка для инкубирования.
10. Вакуумный осушитель для стадии промывки.
11. Таймер.
12. Контрольные материалы
Приготовление реагентов.
1. Промывочный раствор. Вылейте содержимое концентрата промывочного буфера в 1000 мл сосуд. Разбавьте до 1000 мл дистиллированной водой. Хранить при комнатной температуре до истечения срока годности, обозначенного на этикетке концентрата. Кристаллический осадок в концентрате промывочного буфера может быть устранен при нагревании на водяной бане при 37.С или хранением при комнатной температуре.
2. Рабочий раствор субстрата - готовится непосредственно перед анализом.
Определите количество требуемого реагента и смешайте равные доли Субстратов А и В в подходящей емкости. Например, для двух стрипов по 8 ячеек каждый смешайте по 1 мл (небольшое превышение необходимого количества). Раствор должен быть использован в день приготовления.
Методика.
Перед началом анализа все реагенты, стандарты и контроли должны достичь комнатной температуры (20-30оС).
1. Выберите необходимое количество лунок для образцов, стандартов и контролей для постановки в дублях. Верните неиспользуемые стрипы в алюминиевый пакет и закройте его. Храните при 2-8оС.
2. Добавьте пипеткой по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемых образцов в соответствующие лунки.
3. Добавьте пипеткой по 100 мкл ферментного конъюгата Т3 в каждую лунку.
4. Хорошо перемешайте микропланшет в течение 20-30 секунд и накройте его пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое ячеек декантацией или аспирацией. Промокните плашку на фильтровальной бумаге, если использовалась декантация.
7. Добавьте 300 мкл промывочного буфера (см. раздел «Приготовление реагентов») и удалите его. Повторите процедуру еще два раза (общее количество циклов промывки - 3). Для этой процедуры лучше использовать автоматический или ручной вошер в соответствии с инструкциями производителя приборов (избегайте воздушных пузырьков).
8. Добавьте пипеткой по 100 мкл рабочего раствора субстрата в каждую лунку (см. «Приготовление реагентов»). Всегда добавляйте реагенты в одной и той же последовательности, чтобы избежать различий во времени реакции в разных ячейках.
9. Всегда добавляйте реагенты одним и тем же способом, чтобы избежать различий по времени реакции.
10. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
Остановите развитие окраски добавлением в каждую ячейку 50 мкл стоп-раствора и перемешайте ячейки в течение 15-20 секунд. Всегда добавляйте реагенты в одной и той же последовательности, чтобы избежать различий во времени реакции в разных ячейках.
11. Измерьте величины поглощения содержимого ячеек на 450 нм (измерение проводите при референсной длине волны 620-630 нм – это позволит уменьшить ошибку). Измерения должны быть проведены в течение 30 минут после добавления стоп-раствора.
Каждая лаборатория должна использовать контроли, соответсвующие гипотиреозу, эутиреозу и гипертиреозу для мониторинга правильности теста. Эти контроли должны исследоваться как неизвестные образцы в каждой серии анализа. Должны строиться карты контроля качества для отслеживания характеристик поставляемых реагентов. Каждая лаборатория должна установить приемлемые характеристики набора. К числу других параметров, за которыми следует следить, относится 80, 50 и 20% интерсепт стандартной кривой для воспроизводимости изо дня в день между анализами. И, наконец, максимум абсорбции должен согласовываться с предыдущими экспериментами. Значительные отклонения от установленных характеристик могут свидетельствовать об изменениях в условиях эксперимента или разложении реагентов набора. Для установления причины изменений должны быть использованы свежие реагенты.
Результаты
Для определения концентрации fТ3 в неизвестных образцах используется калибровочная кривая.
1. Запишите значения оптической плотности для всех ячеек как показано в примере 1.
2. Для построения калибровочной кривой используйте средние из двух оптических плотностей для каждого стандарта в зависимости от концентрации fТ3 в пг/мл.
3. Проведите оптимальную калибровочную кривую.
4. Определите неизвестные концентрации fТ3 в контролях и образцах, используя калибровочную кривую, построенную по средним значениям оптической плотности для каждого образца. В приведенном ниже примере средняя абсорбция 1.799 пересекает стандартную кривую при 1.2 пг/мл.
Пример 1.
Ячейка Стандарт Опт. плотность
1 0.0 пг/мл 2.350
2 0.0 пг/мл 2.403
3 1,7 пг/мл 1,934
4 1,7 пг/мл 1,925
5 3,5 пг/мл 1.624
6 3,5 пг/мл 1.641
7 7 пг/мл 1,043
8 7 пг/мл 1,000
9 15 пг/мл 0.629
10 15 пг/мл 0.620
11 20.0 пг/мл 0.460
12 20.0 пг/мл 0.453
Неизвестный O. D. Среднее Конц.
13 1.пг/мл
14 1.866
Данные приведены в примере 1 только для иллюстрации и не должны использоваться для построения стандартной кривой.
Параметры контроля качества
Максимальная оптическая плотность (0 стандарт) = >1.2A
Ограничения метода
А. Качество набора
Образцы с микробиологическим ростом не могут использоваться в наборе. Также не должны использоваться сильно липимические или гемолизованные образцы.
Для воспроизводимости результатов важно, чтобы время реакции поддерживалось постоянным в каждой ячейке. Пипетирование образцов не должно превышать 10 минут. Если используется больше, чем один планшет, рекомендуется повторять калибровочную кривую.
Добавление раствора субстрата инициирует кинетическую реакцию, которая останавливается при добавлении стоп-раствора. Следовательно, добавление субстрата и стоп-раствора должно проводиться в одинаковой последовательности для устранения различий во времени реакции в разных лунках.
Измерение оптической плотности на ридере проходит вертикально. Не прикасайтесь ко дну микроячеек.
Плохая промывка ячеек может приводить к невоспроизводимым результатам.
В. Интерпретация результатов
Если для обработки результатов теста используется компьютер, то точность стандартов - не более 10%.
Известно, что различные лекарства влияют на связывание Т3 с белками-переносчиками тироидных гормонов или на метаболизм Т3 и усложняют интерпретацию результатов свободного Т3 (3).
Циркулирующие аутоантитела к Т3 и ингибиторы связывания гормонов также могут интерферировать (4).
Было показано, что гепарин влияет на концентрацию fТ3 in vivo и in vitro (5). Следовательно, не применяйте образцы, где использовался этот антикоагулянт.
При серьезных нетироидных заболеваниях оценка тироидного статуса становится очень сложной. Рекомендуется измерение ТТГ для оценки тироидной дисфункции (6).
Семейные дисальбуминемические состояния могут приводить к неправильным результатам при прямом измерении fТ3 (7).
НАБОР НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ СКРИНИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ.
Ожидаемые значения
Было проведено исследование эутиреоидной взрослой популяции для получения результатов на этом наборе. Результаты исследования показаны в таблице 1.
Таблица 1.
Ожидаемые значения для свободного Т3 в пг/мл
Взрослые Беременные
(110 обр.) (75 образцов)
Значение
Ст. Отклонение
Ожидаемый 1.4-
диапазон (+ 2 S. D.)
Важно иметь ввиду, что установленный диапазон значений, который можно ожидать у данной популяции “нормальных” людей с использованием данного метода зависит от множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности метода в руках лаборанта. По этим причинам каждая лаборатория должна установить свой собственный диапазон нормальных значений.
Характеристики набора
А. Воспроизводимость.
Воспроизводимость набора на fТ3 внутри серии и между сериями определялась в анализе пулов сывороток трех разных уровней. Число, значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для этих сывороток приведены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
Воспроизводимость внутри серии (значения в пг/мл).
Образец Число Знач. Ст. откл. Коэф. вар.
Низкий.9%
Нормальный1%
Высокий%
Таблица 3.
Воспроизводимость между сериями (значения в пг/мл).
Образец Число Знач. Ст. откл. Коэф. вар.
Низкий7%
Нормальный%
Высокий%
В. Точность.
Настоящий метод сравнивался с методом РИА. Использовались образцы от пациентов с гипо-, эу - и гипертиреозом (диапазон значений от 0.1 до 14 пг/мл). Общее число образцов было 85. Было получено уравнение линейной регрессии, и был рассчитан коэффициент корреляции для fТ3 ИФА в сравнении с референсным методом.
Полученные данные приведены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод Среднее (х) Уравнение Коэф. корр.
Этот метод 3,4 у=0,15+0.925(х) 0.955
Референсный 3,5
Только незначительное расхождение данного метода и референс-метода было найдено, что доказывают близкие средние значения. Уравнение регрессии и коэффициент корреляции показывают прекрасную согласованность методов.
С. Чувствительность.
Чувствительность метода - 0.05 пг/мл. Предел обнаружения определен статистически как концентрация, соответствующая значению оптической плотности нулевого стандарта (нг/дл) плюс 2σ (σ - стандартное отклонение) при 95% доверительном интервале.
И. о. начальника управления
