Изучение противоопухолевых свойств полипренолов,
выделенных из пихты
Проблемой, остающейся актуальной до сегодняшнего дня, является повышение эффективности терапии злокачественных новообразований. Несмотря на значительные достижения, связанные с применением в онкологии цитостатиков, высокая токсичность, недостаточная избирательность и эффективность действия имеющихся химиотерапевтических препаратов заставляет исследователей обращаться к поиску иных средств и методов воздействия на опухоль.
Активное развитие в последние годы получило изучение фармакологической активности полипренолов и их производных, представителей большой группы полиизопреноидов. Ряд уникальных аспектов терапевтического приложения этих веществ удалось найти химикам и фармакологам, большинство биологически активных соединений запатентовано. Особое внимание изучению свойств полипренолов и их производных уделяют такие японские фирмы как «Санкио», «Эйсаи», «Курараи». Уже сейчас известна выраженная противоязвенная и гипотензивная активность этих соединений, выявлены их свойства восстанавливать функцию печени при различных воспалениях и аномалиях в жировом и углеводном обмене. Запатентованы препараты этой группы в качестве средств для лечения анемии, диабета, атеросклероза, для профилактики и терапии болезней, обусловленных иммунодефицитом, для лечения тяжелых инфекционных заболеваний. Экспериментальные данные зарубежных исследователей свидетельствуют о выраженной противоопухолевой активности изопренолов.
В различных странах мира применяются различные тест-системы для скрининга и последующей оценки противоопухолевых препаратов. В нашей стране используется более 30 модельных систем перевиваемых и спонтанных опухолей мышей, крыс, кроликов. Кроме того, в некоторых случаях проводятся исследования цитотоксической активности вещества in vitro в различных модельных системах. Карцинома легких Льюиса и меланома В-16 являются обязательными системами тестирования. Непосредственное антибластомное действие препаратов оценивают по критерию роста опухолевых культур. Анализ параметров метастазирования может дать ключ к разгадке механизмов действия препаратов: возможность косвенного воздействия на развитие опухолевого процесса через гемостаз или противоопухолевый иммунный ответ. Распространенные в последние десятилетия сочетанные, комбинированные введения препаратов также позволяют оценить данные модели. Усиление воздействия уже апробированных цитостатиков или снижение их побочных эффектов также являются актуальными проблемами современной экспериментальной онкологии.
В связи с вышесказанным в НИИ фармакологии ТНЦ РАМН проведено изучение влияния полипренолов, полученных из пихты сибирской, на развитие опухоли и способность увеличивать эффективность цитостатической терапии на модели асцитной опухоли Эрлиха, перевиваемой мышам. В НИИ онкологии ТНЦ РАМН исследована противоопухолевая и антиметастатическая активность полипренолов из пихты и водного углекислотного экстракта пихты.
Исследование противоопухолевой активности проводили на 86 беспородных мышах-самках с исходной массой 20 – 23 г и 315 мышах-самцах линии C57BL/6 с исходной массой 18 – 22 г. Животные первой категории (конвенционные линейные мыши) полученные из коллекционного фонда НИЛ экспериментального биомедицинского моделирования ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
Влияние полипренолов из пихты на эффективность лечения циклофосфаном мышей с аденокарциномой Эрлиха.
Эксперимент проведен на 36 беспородных мышах-самках. Аденокарциному Эрлиха (АКЭ) перевивали по 7,5 млн. опухолевых клеток внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора. Лечение полипренолами начинали через 24 часа после перевивки опухоли и продолжали в течение 8 суток внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг (разведение в 0,2 мл соевого масла). Циклофосфан вводили однократно через 72 часа после перевивки опухоли внутримышечно в ударной дозе 125 мг/кг. Контрольные животные получали соответствующее количество соевого масла. По окончании опыта животных умерщвляли методом дислокации шейного отдела позвоночника, определяли объем осадка опухолевых клеток, подсчитывали процент торможения роста опухоли. Об эффективности препарата судили сравнивая результаты в контрольной и опытных группах. Результаты обрабатывали с использованием непараметрического метода Вилкоксона-Манна-Уитни.
В результате эксперимента выявлено, что циклофосфан в выбранном режиме введения не влиял на развитие АКЭ у мышей, уменьшение объема опухолевых клеток оказалось не достоверным (табл. 1).
При лечении животных с опухолью только полипренолами отмечено значительное ингибирующее действие препарата на рост АКЭ: объем опухолевых клеток у животных этой группы уменьшился в 2,1 раза по сравнению с этим показателем в контроле (табл. 1.)
В то же время, комбинирование циклофосфана с полипренолами еще больше увеличило эффективность лечения мышей с АКЭ: в данной группе у животных объем опухолевых уменьшился в 2,4 раза по сравнению с контролем (табл. 1).
Таким образом, в эксперименте на мышах с аденокарциномой Эрлиха выявлено противоопухолевое действие полипренолов, а также показана эффективность их использования с цитостатиком циклофосфаном для лечения животных.
Влияние полипренолов (без долихолов) на развитие аденоракциномы Эрлиха у мышей.
Эксперимент проведен на 50 беспородных мышах-самках при условиях, аналогичных вышеописанным. Однако, в качестве дополнительной использовали контрольную группу животных, которым вводили дистиллированную воду. В отличие от предыдущего опыта применяли полипренолы, очищенные от долихолов.
Установлено, что применение циклофосфана в данном режиме для лечения мышей с АКЭ не привело к торможению роста опухоли, объем опухолевых клеток при этом оказался даже несколько больше, чем в контрольных группах (табл. 2).
Изолированное введение полипренолов мышам с АКЭ не оказало влияния на развитие опухоли (табл. 2).
В то же время, при совместном использовании циклофосфана с полипренолами для лечения мышей с АКЭ отмечено выраженное ингибирующее действие на развитие опухоли: объем опухолевых клеток у животных этой группы уменьшился в 1,3 и 1,5 раза по сравнению с масляным и водным контролями соответственно (табл. 2).
Таким образом, в эксперименте на мышах с АКЭ выявлено, что комбинирование циклофосфана с полипренолами (без долихолов) приводит к значительному торможению роста опухоли.
Анализируя проведенные эксперименты, следует отметить, что полипренолы, не очищенные от долихолов, обладали выраженной противоопухолевой активностью, а также существенно повышали эффективность цитостатического лечения. Обращает на себя внимание тот факт, что полипренолы, очищенные от долихолов, самостоятельной противоопухолевой активностью не обладали, однако, в сочетании с циклофосфаном приводили к ингибиции роста аденокарциномы Эрлиха у мышей, правда меньше, чем полипренолы с долихолами.
Таблица 1
Влияние полипренолов из пихты на эффективность лечения циклофосфаном беспородных мышей-самок
с аденокарциномой Эрлиха
Группа животных | Доза и режим введения препарата | Объем опухолевых клеток (X±m), мл | Торможение роста опухоли, % |
Контроль масляный | 0,2 мл внутрижелудочно | 1,03±0,21 | – |
Циклофосфан | 125 мг/кг внутримышечно однократно на 4-е сутки после перевивки | 0,82±0,14 | 20 |
Циклофосфан + полипренолы | 125 мг/кг внутримышечно однократно на 4-е сутки после перевивки 100 мг/кг внутрижелудочно в течение 8 дней ежедневно, начиная через 24 ч после перевивки | 0,43±0,11*** | 58 |
Полипренолы | 100 мг/кг внутрижелудочно в течение 8 дней ежедневно, начиная через 24 ч после перевивки | 0,50±0,07* | 51 |
ПРИМЕЧАНИЕ: * – различия достоверны в сравнении с контролем при Pu<0,05
** – различия достоверны в сравнении с группой, получавшей циклофосфан, при Pu<0,05.
Таблица 2
Влияние полипренолов (без долихолов) на эффективность лечения циклофосфаном беспородных мышей-самок
с аденокарциномой Эрлиха
Группа животных | Доза и режим введения препарата | Объем опухолевых клеток (X±m), мл | Торможение роста опухоли, % |
Контроль водный | 0,2 мл внутрижелудочно | 1,74±0,10 | – |
Контроль масляный | 0,2 мл внутрижелудочно | 1,61±0,20 | 7,5 |
Циклофосфан | 125 мг/кг внутримышечно однократно на 4-е сутки после перевивки | 1,83±0,30 | +5 |
Циклофосфан + полипренолы | 125 мг/кг внутримышечно однократно на 4-е сутки после перевивки 100 мг/кг внутрижелудочно в течение 8 дней ежедневно, начиная через 24 ч после перевивки | 1,16±0,10*** | 33 |
Полипренолы | 100 мг/кг внутрижелудочно в течение 8 дней ежедневно, начиная через 24 ч после перевивки | 1,77±0,20 | 0 |
ПРИМЕЧАНИЕ: * – различия достоверны в сравнении с контролем масляным при Pu<0,05
** – различия достоверны в сравнении с контролем водным при Pu<0,05.
Влияние полипренолов, ацетатов полипренолов и водного экстракта пихты сибирской на развитие гематогенно-метастазирующей карциномы легких Льюиса (LLC).
В опыте было задействовано 158 мышей-самцов линии C57BL/6. Для перевивки использовали стерильно выделенные клетки по 1 млн. в 0,2 мл среды RPMI-1640 подкожно в бедро правой задней лапки.
Противоопухолевое влияние оценивали по торможению роста опухоли, которое определяли с помощью массы или объема опухоли. Для определения метастазирования LLC легкие мышей выделяли на 20 – 25 сутки роста опухоли и помещали в физиологический раствор. Подсчитывали число и площадь метастатических колоний. Антиметастатическое действие препаратов оценивали, сравнивая следующие показатели в контрольной и опытной группах: частота метастазирования (процент животных с метастазами), среднее число метастазов на 1 животное, средняя площадь метастатических колоний в легких. По этим параметрам вычисляли индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %) и индекс торможения роста метастазов (ТРМ, %).
Исследуемые препараты вводили в широком диапазоне доз. Полипренолы в дозах 5, 50, 100 мг/кг, ацетаты полипренолов в дозах 5, 50, 100, 200 мг/кг, углекислотный водный экстракт пихты сибирской в дозах 5, 50 мг/кг. Полипренолы и их ацетаты разводили в 0,2 мл соевого масла. Циклофосфан вводили в дозе 60 мг/кг. Контрольные животные получали соответствующее количество соевого масла или воды.
Результаты обрабатывали с использованием параметрического критерия Стъюдента и непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Как показали результаты исследований, объем опухоли LLC на 25 день опыта в группах мышей, которым вводили исследуемые препараты из пихты, достоверно отличались от контрольных значений. Торможение роста по объему в опытных группах составляло 12 – 62% (табл. 3). Наибольший противоопухолевый эффект оказали ацетаты полипренолов в дозах 5 и 50 мг/кг (55% и 62% торможения соответственно). Значительный процент торможения объема опухоли наблюдался и у водного экстракта пихты в дозе 5 мг/кг – 44%. В то же время снижалась и масса опухоли в группах, получавших исследуемые препараты. Торможение роста опухоли по массе в соответствующих группах составляло 8 – 41%. Лучшие результаты оказывали также ацетаты полипренолов в дозах 5 и 50 мг/кг (табл. 3).
Число метастазов гематогенно-метастазирующей карциномы легких Льюиса у мышей, получавших препараты пихты, было достоверно ниже, чем у контрольных животных. Максимальные индексы ингибиции метастазирования наблюдались в группах, которым вводили водный экстракт пихты в дозе 50 мг/кг, ацетаты полипренолов в дозах 100 и 50 мг/кг и полипренолы в дозе 100 мг/кг (70,5%, 69%, 51%, 51 % соответственно). Суммарная площадь метастазирования имела достоверное снижение почти во всех исследуемых группах. Лучший эффект оказывали водный экстракт пихты в дозах 5 и 50 мг/кг и ацетаты полипренолов в дозе 100 мг/кг, индекс торможения метастазирования составлял 67%, 69%, 72% соответственно (табл. 3).
Введение известного цитостатического препарата циклофосфана обеспечивало торможение роста опухоли по объему на 17%, по массе – 38,5%, т. е. оно не превышало соответствующие показатели у препаратов пихты, и даже было ниже, чем, например, у ацетатов полипренолов в дозах 5 и 50 мг/кг. Зато антиметастатический эффект у животных, получавших циклофосфан, был выше, чем у исследуемых препаратов. При совместном применении циклофосфана с водным экстрактом пихты в дозе 50 мг/кг этот эффект повышался, при умеренном торможении роста опухоли по объему (табл. 3).
Таким образом, на модели роста карциномы легких Льюис наилучший противоопухолевый эффект, превышающий таковой у циклофосфана, оказывали ацетаты полипренолов (5 и 50 мг/кг) при самостоятельном применении. Выраженный, но не превышающий у циклофосфана, антиметастатический эффект наблюдался у ацетатов полипренолов в большей дозе (100 мг/кг), углекислотного водного экстракта пихты (5 и 50 мг/кг). Сочетанное применение экстракта пихты (50 мг/кг) и циклофосфана приводило к увеличению антиметастатического эффекта.
Таблица 3
Исследование противоопухолевой активности извлечений из пихты сибирской на модели карциномы легких Льюиса на мышах-самцах линии C57BL/6
Группа животных, доза | Объем опухоли (X±m), мм3 | Торможение роста опухоли по объему, % | Масса опухоли (X±m), мг | Торможение роста опухоли по массе, % | Число метастазов, (X±m) | Индекс ингибиции метастазирования, % | Суммарная площадь метастазирования (X±m), мм2 | Индекс торможения роста метастазов, % |
Контроль масляный | 14,69±0,25 | – | 5,92±0,22 | –- | 14,20±2,44 | – | 42,40±6,06 | – |
Полипренолы 5 мг/кг | 10,52±0,44* | 28 | 5,43±1,35 | 8 | 14,20±3,05 | 0 | 38,20±7,11 | 10 |
Полипренолы 50 мг/кг | 9,51±0,39* | 35 | 5,03±1,09 | 15 | 13,90±2,85 | 2 | 40,00±2,01 | 6 |
Ацетаты полипренолов 5 мг/кг | 6,62±0,54* | 55 | 4,00±1,67* | 32 | 11,00±4,16 | 23 | 23,40±5,9* | 45 |
Ацетат полипренолов 50 мг/кг | 5,65±0,36* | 62 | 3,49±0,42* | 41 | 7,00±2,45* | 51 | 17,90±5,26* | 58 |
Контроль масляный | 10,07±0,66 | – | 5,87±0,25 | – | 17,60±1,5 | – | 62,50±4,30 | – |
Полипренолы 100 мг/кг | 7,17 ± 0,78* | 29 | 4,73 ± 0,19* | 19 | 8,67 ± 1,17* | 51 | 36,20 ± 3,90* | 49 |
Ацетаты полипренолов 100 мг/кг | 7,01 ± 0,65* | 30 | 4,43 ± 0,27* | 25 | 5,50 ± 0,69* | 69 | 19,70 ± 2,70* | 72 |
Контроль водный | 12,49±0,77 | – | 6,54±0,19 | – | 19,10±1,3 | – | 70,70±3,40 | – |
Водный экстракт пихты 5 мг/кг | 6,92 ± 0,59* | 44 | 4,68 ± 0,48* | 28 | 8,00±1,04* | 58 | 20,70± 2,0* | 67 |
Контроль масляный | 12,49±0,15 | – | 5,43 ± 0,61 | – | 18,30±2,21 | – | 69,20±11,48 | – |
Водный экстракт пихты 50 мг/кг | 8,57±0,11* | 11,8 | 3,50 ± 0,77* | 36 | 5,40±1,26* | 70,5 | 21,50±5,76* | 69 |
Ацетаты полипренолов 200 мг/кг | 14,12±0,24 | -4 | 6,48 ± 0,80 | -19 | 8,60±1,64* | 53 | 37,70 ± 5,68* | 46 |
Циклофосфан 60 мг/кг | 7,23±0,12* | 16,7 | 3,33 ± 0,66* | 38,5 | 2,50 ± 1,90* | 90 | 12,20 ± 9,16* | 82 |
Водный экстракт пихты 50 мг/кг + Циклофосфан 60 мг/кг | 5,49±0,15* | 24 | 2,78 ± 0,92* | 48,8 | 1,60±0,33* | 93 | 5,90 ± 4,46* | 91 |
Ацетаты полипренолов 200 мг/кг + Циклофосфан 60 мг/кг | 8,88±0,08* | 10,8 | 4,93 ± 0,53 | 9,2 | 3,10±0,40* | 83 | 14,90 ± 6,97* | 78 |
ПРИМЕЧАНИЕ: * – различия достоверны в сравнении с контролем при Pt<0,05, Pu<0,05.
Влияние полипренолов, ацетатов полипренолов и водного экстракта пихты сибирской на развитие гематогенно-метастазирующей меланомы (В–16).
В опыте было задействовано 157 мышей-самцов линии C57BL/6. Перевивку, введение препаратов, подсчет объема опухоли и критериев противоопухолевого и антиметастатического действия осуществляли, как и в случае с LLC.
В результате экспериментов выявлено, что объем опухоли меланомы В–16 на 21 день исследования в опытных группах был меньше, чем в контрольных. Наиболее эффективными оказались ацетаты полипренолов в дозах 50 и 100 мг/кг, а также полипренолы в дозе 100 мг/кг (табл. 4). В этих группах и в группах, получавших водный экстракт в обеих исследуемых дозировках, наблюдалось торможение опухоли по массе.
Существенно снижалась частота метастазирования у животных, получавших разные препараты из пихты. Лучшие результаты оказывали полипренолы и их ацетаты в дозе 100 мг/кг, а также экстракт пихты в дозе 5 мг/кг. Индекс ингибиции метастазирования в соответствующих группах составлял 93%, 97% и 94% (табл. 4). В этих группах максимально уменьшалась также суммарная площадь метастазирования. На данной модели опухолевого роста действие данных препаратов пихты превосходило эффект циклофосфана. Совместное применение циклофосфана и водного экстракта пихты (50 мг/кг) приводило к более значительному торможению роста опухоли по массе при достаточно высоком антиметастатическом эффекте (табл. 4).
Таким образом, на модели роста меланомы В–16 лучший противоопухолевый результат наблюдался у ацетатов полипренолов (50 и 100 мг/кг) и у полипренолов (100 мг/кг). Сильный антиметастатический эффект оказывали полипренолы и их ацетаты (100 мг/кг), углекислотный водный экстракт пихты (5 мг/кг). Сочетанное применение экстракта пихты (50 мг/кг) и циклофосфана приводило к увеличению противоопухолевого эффекта.
На основании анализа данных исследований на трех моделях опухолевого роста можно сделать вывод о том, что препараты из пихты сибирской обладают противоопухолевым и антиметастатическим действием. Наилучший эффект проявляют ацетаты полипренолов (5, 50, 100 мг\кг) и полипренолы (100 мг/кг) из пихты сибирской, углекислотный водный экстракт пихты сибирской (5 и 50 мг/кг). Уменьшение метастазирования под воздействием исследуемых препаратов предполагает усиление гемостатических систем организма направленных на элиминацию метастатических опухолевых клеток. Выявлена возможность улучшения цитостатической терапии при сочетанном применении циклофосфана и природных препаратов из пихты. Представленные результаты исследований свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения противоопухолевой, антиметастатической активности полипренолов и их ацетатов из пихты, вызывает интерес и изучение широкого спектра фармакологической активности полипренолов и ацетатов полипренолов, выделенных из природных источников с целью создания высокоэффективных лекарственных средств.
Таблица 4
Исследование противоопухолевой активности извлечений из пихты сибирской на модели карциномы легких Льюиса на мышах-самцах линии C57BL/6
Группа животных, доза | Объем опухоли (X±m), мм3 | Торможение роста опухоли по объему, % | Масса опухоли (X±m), мг | Торможение роста опухоли по массе, % | Число метастазов, (X±m) | Индекс ингибиции метастазирования, % | Суммарная площадь метастазирования (X±m), мм2 | Индекс торможения роста метастазов, % |
Контроль масляный | 10,18±0,36 | – | 5,42±0,59 | – | 14,80±1,93 | – | 43,00±5,56 | – |
Полипренолы 5 мг/кг | 8,47±0,28* | 17 | 4,57±0,85 | 16 | 14,10±3,93 | 5 | 39,50±6,80 | 8 |
Полипренолы 50 мг/кг | 8,67±0,14* | 15 | 4,57±0,55 | 16 | 14,30±3,53 | 3 | 40,2±7,61 | 7 |
Ацетаты полипренолов 5 мг/кг | 7,14±0,37* | 30 | 4,02±1,13 | 26 | 10,10±1,53* | 32 | 24,70±7,80* | 43 |
Ацетат полипренолов 50 мг/кг | 4,25±0,18* | 58 | 3,19±0,53* | 41 | 6,30±1,16* | 57 | 14,50±3,90* | 66 |
Контроль масляный | 9,51±0,13 | – | 5,64±0,28 | – | 15,60±1,00 | – | 39,30±2,90 | – |
Полипренолы 100 мг/кг | 3,57 ±0,44* | 62 | 3,14 ± 0,24* | 44 | 1,86 ± 0,77* | 93 | 4,14 ± 1,90* | 91 |
Ацетаты полипренолов 100 мг/кг | 4,10 ± 0,67* | 57 | 3,03 ± 0,18* | 47 | 1,00 ± 0,37* | 97 | 1,45 ± 0,59* | 97 |
Контроль водный | 12,50±0,12 | – | 6,05±0,25 | – | 19,70±1,00 | – | 45,30±2,30 | – |
Водный экстракт пихты 5 мг/кг | 9,19±0,09* | 55 | 3,45±0,48* | 39 | 1,83±0,90* | 94 | 5,50±3,20* | 88 |
Контроль масляный | 12,23±0,10 | – | 5,55±0,49 | – | 10,10±1,80 | – | 45,80±6,90 | – |
Водный экстракт пихты 50 мг/кг | 6,62±0,24* | 18,5 | 2,78±0,33* | 50 | 5,30±1,40* | 48 | 20,50±5,60* | 55 |
Ацетаты полипренолов 200 мг/кг | 11,24±0,25 | 3 | 5,23±1,07 | 6 | 5,40±1,30* | 47 | 28,60±5,40* | 38 |
Циклофосфан 60 мг/кг | 7,97±0,08* | 13,3 | 3,28±0,55* | 40,9 | 3,60±0,50* | 64 | 15,70±2,06* | 66 |
Водный экстракт пихты 50 мг/кг + Циклофосфан 60 мг/кг | 5,72±0,2* | 22,4 | 2,12±0,88* | 61,8 | 2,00±0,60* | 86 | 5,60±1,80* | 88 |
Ацетаты полипренолов 200 мг/кг + Циклофосфан 60 мг/кг | 8,27±0,20* | 12,2 | 3,94±1,14 | 29 | 4,90±1,60* | 51 | 26,00±8,10 | 43 |
ПРИМЕЧАНИЕ: * – различия достоверны в сравнении с контролем при Pt<0,05, Pu<0,05.
