«Создание нанокомпозитных систем для диагностики, профилактики и коррекции дисбактериозов»
Руководитель проекта: д. б. н., зав. лабораторией микроэкологии
Продолжительность проекта: 4 года ( г. г.).
2. Вводная часть.
Проект посвящен созданию тестовых диагностических систем для комплексной оценки микробного баланса организма человека.
В настоящее время проблема дисбактериозов, в первую очередь дисбактериозов кишечника, получила глобальное распространение. В нашей стране до 90% лиц имеют различные варианты отклонений от нормы состава полезной (симбионтной) микрофлоры, которая препятствует натиску патогенных и условнопатогенных микробов в организм. Нарушения микробного баланса приводят также к повышенной нагрузке различных токсикантов на печень, поскольку в норме микрофлора кишечника разрушает до 50% всех токсинов, поступающих в организм, значительно снижая тем самым негативное действие на печень. Одной из основных причин наблюдающихся дисбактериозов является широкое, не всегда оправданное, применение антибиотиков и других противомикробных средств, продолжающееся на протяжении нескольких поколений людей.
Для адекватной коррекции нарушений микробного баланса необходимо полное знание количественного и качественного состава полезной микрофлоры кишечника. Известно, что доминантой кишечника являются полезные (симбионтные) микроорганизмы – бифидобактерии (более 90% от всей микрофлоры). У каждого человека свой определенный состав ее. Из всех известных до 8-9 видов бифидобактерий у индивида преобладает один из этих видов, и для адекватной коррекции дисбактериозов необходимо точно знать, какой преобладающий вид присутствует у человека. Более того, известно, что в каждом регионе распространены определенные виды этого микроорганизма (это обстоятельство обусловлено множеством факторов). Для Восточной Сибири такая информация в настоящее время отсутствует. Существующие в практическом здравоохранении традиционные (культуральные) методы определения вида бифидобактерий очень трудоемки, громоздки и практически не выполняются. Поэтому создание удобной, надежной, информативной тест-системы для этой цели – очень своевременно. С помощью такой тест-системы (ТС1) можно определять видовой состав бифидобактерий в организме человека и в продуктах функционального питания, используемых для коррекции дисбактериозов. Знание видового состава симбионтных микроорганизмов в кишечнике у конкретного человека позволит подбирать для него продукты, обогащенные подходящим для него набором видов микроорганизмов.
Кроме того, ранее нашими исследованиями было показано, что при неблагоприятных воздействиях на организм у человека может появляться реактивность к его нормальной микрофлоре (особенно к бифидо-, лактобактериям и нормальной кишечной палочке). Это проявляется в виде выработки организмом антител к бифидобактериям, которые препятствуют естественному заселению ими кишечника [, , 1998,2007]. Такая патологическая реакция будет определяться с помощью второй диагностической системы (ТС2). Этот диагностический тест позволит оценивать способность организма воспринимать биологические способы коррекции дисбактериозов с помощью пробиотиков и других продуктов функционального питания: либо временный прием пробиотиков, либо постоянный на протяжении всей жизни человека для поддержания микробного баланса. В противном случае, без правильной коррекции дисбактериозов человека ожидают большие проблемы со своим здоровьем и со здоровьем будущего поколении.
Таким образом, совместное применение двух тестовых систем при диагностике дисбактериозов позволит осуществлять тактику и стратегию их профилактики и коррекции. Тактика – определение вида микроорганизма, на основании этого – выбор препарата. Стратегия – схема коррекции в зависимости от реактивности организма к полезному (симбиотному) микроорганизму (“точечная” либо длительная, возможно, даже постоянная). Внедрение разрабатываемых методик в практику диагностических центров Иркутской области позволит существенно повысить качество анализов и впервые в практике российского здравоохранения одномоментно определять основные микроорганизмы кишечного микробиоценоза на уровне вида. Кроме того, тест-системы могут быть использованы для определения вида бифидобактерий в лечебных продуктах при подборе соответствующего организму вида бифидобактерий. Все это будет способствовать более успешной профилактике и коррекции дисбактериозов.
В качестве основы первой оригинальной тест-системы для индикации видов бифидобактерий (ТС1) планируется использовать классический метод гибридизации ДНК на поверхности с определением конкретного вида посредством меченых зондов. Реализация метода в форме нанорельефных иммобилизационных покрытий [ и др. Биоорг. хим. 2006. №. 5. С. 511] позволит существенно повысить экспрессность и точность определения.
Вторая диагностическая тест-система (ТС2) для определения реактивности организма к симбионтной микрофлоре (это могут быть как бифидо-, так и лактобактерии и нормальная кишечная палочка) будет создана на основе антигенов конкретных видов бифидобактерий. Для определения специфических антител будут разработаны эритроцитарные тест-системы, при конструировании которых планируется использовать обнаруженный участниками проекта эффект самосборки на наноуровне системы эритроцит – синтетический полимер – антиген [, и др. Пат. РФ № 000].
Проект базируется на достигнутых его участниками успехах по созданию специфических праймеров и зондов к нуклеиновым кислотам возбудителей разных инфекций и получению функционализированных наноструктурированных покрытий, являющихся удобной матрицей для иммобилизации нуклеотидных зондов. В рамках совместных работ сотрудников Института эпидемиологии и микробиологии НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН и Лимнологического института СО РАН создан метод получения эритроцитарных диагностикумов, апробированный в ходе многолетних исследований дифтерийного бациллоносительства в Иркутской области.
Создаваемые в рамках проекта тест-системы не имеют аналогов на российском и мировом рынке, а развиваемый подход к их конструированию позволит создавать эффективные диагностикумы для других целей.
3. Анализ рынка и положение дел в отрасли.
В условиях воздействия на человека неблагоприятных факторов среды происходят нарушения естественных микробоценозов, развиваются устойчивые дисбактериозы. До 90% населения имеют различные проявления дисбактериозов, что является основой для возникновения многих донозологических и патологических состояний. Таким образом, диагностика микробного статуса человека на основе современных чувствительных и удобных в применении диагностических систем имеет первостепенное значение при диспансеризации и лечении разных слоев населения. В настоящее время в стране на ранке диагностических препаратов отсутствуют современные (на основе нано - и генотехнологий) удобные в применении тест-системы с принципиально новым комплексным подходом в оценке микробного статуса человека. Весьма важно, что этими же тест-системами можно более эффективно подбирать продукты фукционального питания для коррекции нарушений, а также рекомендовать наиболее подходящие для производства стартерные закваски с наиболее нужными в регионе видами бифидобактерий.
В настоящее время пробиотики и продукты функционального питания составляют не более 3 % всех известных пищевых продуктов. Однако, судя по прогнозам ведущих специалистов мира в области питания и медицины, в ближайшие 15-20 лет их доля достигнет 30 % всего продуктового рынка. При этом они на 35-50 % вытеснят из сферы реализации многие лекарственные препараты в арсенале средств сохранения здоровья, профилактической и восстановительной медицины [, 2007; , 2006,2007; M. Guemond, 2007; S. Kamiya, 2007]. Только в США в 2010 г. рынок пробиотических препаратов и продуктов питания составит 1,1 млрд $ США (, 2006; 2005).
По городу Иркутску количество диагностических анализов на кишечный дисбактериоз достигает до 1000 исследований в год только по Центру дисбактериозов при ИЭМ. Расширение круга исследуемых пациентов, внедрение методов анализа в практику больниц, поликлиник, лабораторий СЭС и пищевой промышленности требует создания современных надежных, простых в применении, экономически эффективных тест-систем по определению видов бифидобактерий и соответствующих антител в организме человека. Денежный эквивалент этого рынка услуг на сегодня по г. Иркутску оценивается в более чем 10 млн. рублей, но спрос на такие услуги растет с каждым годом и в других городах Иркутской области.
4. Существо проекта.
Целью настоящего проекта является разработка нанокомпозиционных диагностических систем для определения вида бифидобактерий в кишечнике людей, в продуктах лечебного питания, обогащенных полезными микробами, а также для оценки состояния реактивности организма к симбионтным микробам по уровню антител к ним в крови. Генно-диагностическая тест-система позволит подобрать из имеющегося на рынке спектра лечебных продуктов наиболее подходящий вариант с видом полезного микроба, соответствующим данному человеку. Это позволит избежать состояния неприятия организмом определенных видов бифидобактерий, а, следовательно, ускорит коррекцию дисбактериоза и снизит вероятность побочных аллергических реакций.
Вторая тест-система по определению антител в крови к специфическим видам бифидобактерий позволит выработать стратегию проводимой коррекции: либо кратковременное применение биопрепаратов, либо длительное, возможно постоянное в течение жизни. Создаваемые диагностические методики позволят количественно (с точностью до 90%) определять соотношение видов бифидобактерий и антител, что выгодно отличает их от используемых подходов, например, ПЦР.
Проект состоит из следующих основных этапов:
1. Разработка лабораторных вариантов нуклеотидных и иммунных диагностикумов для определения видов бифидобактерий и соответствующих антител.
2. Выпуск опытных партий тест-систем.
3. Апробация новых диагностикумов и методов коррекции дисбактериозов в Центре диагностики и коррекции дисбактериозов ИЭМ и клиниках НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, лабораториях Иркутской области.
4. Сбор информации о составе популяции бифидобактерий и реактивности организма к ним в различных группах населения Иркутской области. Выработка рекомендаций по профилактике дисбактериозов с использованием специализированного питания.
5. Подготовка документации для внедрения новых диагностикумов и методов коррекции дисбактериозов (лабораторные регламенты, методические рекомендации, маркетинговые исследования).
К настоящему времени авторами проекта освоена техника выделения ДНК из культур бифидобактерий, выделенных из кишечника лиц, проживающих на территории Иркутской области, изучены режимы хранения ДНК, выполнены пробные исследования по изучению видовой структуры этого микроорганизма в нашем регионе. Для создания диагностической системы по определению реактивности организма к бифидобактериям изучены компоненты, пригодные для тест-систем: конъюгирующие компоненты, антигены нескольких видов бифидобактерий.
5. План маркетинга.
Потенциальный рынок предлагаемых оригинальных нанокомпозиционных систем составляет порядка 10 млн. рублей в год только в диагностических учреждениях Иркутска. В ходе выполнения проекта планируется оптимизировать предлагаемые методики как с точки зрения уменьшения стоимости тест-систем и расходных материалов, так и аппаратуры, используемой для учета результатов. В частности, предполагается создать поликомпонентные гибридизационные системы (для одномоментного определения нескольких видов бифидобактерий) с уровнем аналитического сигнала, позволяющего использовать стандартные фотоколориметры и УФ-трансиллюминаторы.
Конечными потребителями тест-системы являются медицинские диагностические центры различного спектра предлагаемых услуг, научно-исследовательские институты, баклаборатории, центры диагностики дисбактериозов, центры санэпиднадзора, лаборатории медэкспертизы, центры генетической дактилоскопии, ветеринарные службы и другие физические лица. Выбор в качестве основного объекта бифидобактерий, определяемых до вида, обусловлен тем, что в настоящее время определение вида этого микроорганизма, являющегося доминантой кишечного микробиоценоза, связано с большими трудностями, как диагностического плана, так и экономического. Последнее обусловлено тем, что определение вида бифидобактерий микробиологическими методами – дело очень трудоемкое, времязатратное и дорогостоящее. В практических лабораториях по этой причине ограничиваются определением бифидобактерий с точностью до рода, что не позволяет рекомендовать наиболее подходящие для конкретного индивида лечебные препараты, наиболее соответствующие его собственной микрофлоре. Проблема дисбактериозов актуальна для нашего региона, поскольку среди населения распространенность дисбактериозов достигает 90%.
Разработанные подходы и методики будут иметь универсальный характер, позволяющий конструировать доступные тест-системы для любых объектов инфекционной и неинфекционной природы.
6. Производственный план.
Продолжительность проекта – 4 года (48 мес).
№ этапа | Содержание работ | Сроки выполнения (месяцы с начала реализации проекта) |
1 | Выбор участков генов, характеризующих вид и дизайн соответствующих олигонуклеотидных праймеров и зондов, сопоставление эталонных штаммов и видов с региональными (ТС1)* | 6 мес |
2 | Оптимизация функционализированных нанокомпозитных поверхностей и методов иммобилизации ДНК на них (ТС1) | 1-6 |
3 | Подбор условий гибридизации иммобилизованной ДНК бифидобактерий со специфическими зондами (ТС1) | 7-12 |
4 | Разработка эффективного метода количественного учета флуоресцентных сигналов меченных зондов(ТС1) | 10-18 |
5 | Получение компонентов для создания эритроцитарных диагностических систем (конъюгирующие полимеры, носители антигена, антигены 9 видов бифидобактерий) (ТС2) | 1-6 |
6 | Конструирование эритроцитарных тест-систем для определения антител методом РПГА, отработка режимов количественного определения, контроль тест-систем (ТС2) | 7-18 |
7 | Патентный поиск и оформление заявок на изобретения на тест-системы и нанокомпозиционные технологии | 1-12 |
8 | Организация выпуска опытных партий разработанных диагностических систем | 13-24 |
9 | Сбор материала для выделения ДНК из микробной массы бифидобактерий и определения антител в крови пациентов | 1-48 |
10 | Широкая апробация в практическом ЗО и научная оценка популяционной реактивности организма к микробам-симбионтам в нашем регионе и установление региональных показателей (видов). | 18-42 |
11 | Маркетинговые исследования по проекту | 36-42 |
12 | Создание лабораторного регламента конструирования тест-систем и методических рекомендаций для органов здравоохранения, предприятий по производству продуктов функционального питания, проведение семинаров для врачей и бактериологов | 12-24 |
13 | Написание отчетов | Ежегодно и окончательный |
7. Инвестиционный климат и риски.
Разработка диагностических систем для характеристики микробного баланса человека, в т. ч., дисбактериозов – одна из актуальнейших проблем современности. В конструировании современных тест-систем наиболее перспективно использовать последние достижения нанотехнологий, позволяющие резко уменьшить количество используемого биологического материала при повышении чувствительности и надежности анализа. К сожалению, подобный высокотехнологичный подход довольно часто приводит к созданию чрезмерно дорогих устройств, доступных лишь отдельным крупным клиникам или научным институтам. На другом полюсе находятся относительно недорогие тест-системы для "массовой" медицины, часто не способные обеспечить полноценную диагностику, что достаточно ярко проявляется в бактериологических исследованиях. По мнению авторов проекта, в настоящее время является актуальной разработка методов "среднего" класса, сочетающих использование самых последних идей в областях медицины, молекулярной биологии, биохимии, наук о наноматериалах с оптимальной стоимостью отдельных анализов и приборных комплексов в целом. По сведениям авторов проекта, в данном направлении работает ряд научных групп в России и мире, что обусловливает определенный инвестиционный риск и требует ускоренного доведения разработки до уровня патентной защиты и внедрения.
8. Организационный план.
Финансирование проекта предполагается выполнять через Государственное учреждение Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук (ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН), созданный в 1987 г. Структурным подразделением этого учреждения является Институт эпидемиологии и микробиологии (ИЭМ), основными направлениями которого являются научные исследования в области инфекционной патологии (клещевые энцефалиты, боррелиозы, риккетсиозы, гепатиты, кишечные инфекции), микробной экологии (дисбактериозы) человека. При ИЭМ функционирует Центр дисбактериозов, на базе которого будет проводиться апробация новых диагностических систем.
Вторым участником проекта является Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук (ЛИН), являющийся ведущей организацией в области экологии Прибайкальского региона и имеющий базу для проведения молекулярно-биологических исследований на современном уровне. Сотрудниками ЛИН разработан способ создания функционализированных нанокомпозитных покрытий и водорастворимых полимеров, которые станут основой для создания носителей в гибридизационных тест-системах и конъюгирующих агентов в эритроцитарных диагностикумах. В рамках данного проекта ЛИН будет выступать в качестве субподрядной организации по отношению к ИЭМ со средним финансированием на уровне 1/3 от общего объема проекта.
Этапы изучения качества полученного продукта:
1. Оценка специфичности и чувствительности продукта по сравнению с:
а. традиционными методами исследований (культуральными);
б. известными на рынке диагностическими системами с привлечением методов гибридизации ДНК
2. Оценка преимуществ по сравнению с другими методами определения видовой принадлежности бифидобактерий
3. Изучение эффективности применения продукта на практике (Центр дисбактериозов)
4. Оформление документов (отчет, регламент, патент).
Список предполагаемых исполнителей:
- зав. лаб. микроэкологии ИЭМ, д. б.н., руководитель проекта;
– старший научный сотрудник лаб. микроэкологии ИЭМ, д. б.н., отвественный исполнитель
– с. н.с. ИЭМ, к. б. н., ответственный исполнитель
– в. н.с. ЛИН, д. х.н.;
– с. н.с. ИЭМ, к. б.н.;
- м. н.с. ИЭМ;
- доцент каф. физ. хим методов в биологии ИГУ, к. б.н.
– м. н.с. лаб. Микроэкологии ИЭМ
- с. н.с. ЛИН к. х.н.;
– н. с. ЛИН, к. х.н.
В выполнении отдельных этапов проекта будут задействованы студенты биологического и химического факультетов ИГУ
