На правах рукописи
КОМПЛЕКСНАЯ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА
ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ И
МЕТОДОВ ЕГО ДИАГНОСТИКИ В СЕЛЬХОЗПРЕДПРИЯТИЯХ И
ЛИЧНЫХ ПОДСОБНЫХ ХОЗЯЙСТВАХ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология.
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
НОВОСИБИРСК – 2010
Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии
Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,
старший научный сотрудник
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор ,
доктор ветеринарных наук, профессор
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский
институт бруцеллеза и туберкулеза животных»
Защита состоится «17» ноября 2010 г. в 14-00 ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, Россельхозакадемия, ИЭВСиДВ а/я 8, тел/
С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии
Автореферат разослан «__» октября 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Туберкулез остается одной из главных инфекционных проблем медицины и ветеринарии в мире (, 1994; , 2004; и соавт., 2005; M. S. Zanini, 2005; A. L. Michel, 2007; B. Müller, 2008; O. Aurtenetxe, 2008; N. Sahraoui, 2009).
На сегодняшний день в РФ выделяют три основных категории производителей сельскохозяйственной продукции: сельхозтоваропроизводители (СТП) – крупные хозяйства различных организационно правовых форм; крестьянско-фермерские хозяйства (КФХ) – как правило, мелкие сельхозтоваропроизводители, осуществляющие свою деятельность за счет производства и реализации сельскохозяйственной продукции; личные подсобные хозяйства (ЛПХ) или хозяйства населения, производимая продукция которых в основном потребляется самими производителями, реализуются лишь излишки ( и соавт. 2007).
По данным официальной статистики, личными подсобными хозяйствами (ЛПХ) в России занимается 16 млн. семей. ЛПХ производят 56 % мяса, 51,8% молока, 25,2% яиц от общего объема этих видов сельскохозяйственной продукции ( и соавт., 2006).
Несмотря на большое количество специальной литературы по проблеме туберкулеза, имеются лишь единичные публикации и методические рекомендации, посвященные вопросам эпизоотологии этой болезни в личных подсобных хозяйствах ( и соавт, 2005; , 2005).
Особенностью, затрудняющей диагностику туберкулеза в личных подсобных хозяйствах, являются совместное содержание и тесный контакт разных видов животных и птиц, способствующие заражению различными видами микобактерий ( и соавт, 2005; , 2005) .
В связи с указанными особенностями, в последние годы увеличивается количество жалоб владельцев животных на необоснованный убой животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих, инициируются судебные дела между владельцами животных и ветеринарными специалистами (, 2005, 2007; , 2005).
Указанные выше проблемы приводят к убеждению, что для полного раскрытия эпизоотической ситуации по туберкулезу необходимо ее углубленное и всестороннее изучение не только в крупных сельхозпредприятиях, но и в личных подсобных хозяйствах, что позволит выявить максимальное число эпизоотологических и эпидемиологических факторов, способствующих распространению этой болезни, и в этой связи быстро и точно ставить диагноз и организовывать конкретные профилактические противотуберкулезные мероприятия.
Цель исследования – осуществить комплексную сравнительную оценку эпизоотической ситуации по туберкулезу животных и методов его диагностики в сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах.
С учетом цели, сформулированы следующие задачи:
1. Осуществить сравнительную комплексную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота в общественных и личных подсобных хозяйствах с использованием эпизоотологического, аллергического, клинического, патологоанатомического, бактериологического и молекулярно-генетического методов и оптимизировать ее схему.
2. Провести генотипирование культур M. avium, выделенных от животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих.
3. Провести диагностику туберкулеза у мелкого рогатого скота в личных подсобных хозяйствах.
Научная новизна. Установлено, что количество реагирующего крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих значительно ниже в личных подсобных хозяйствах в сравнении с животными в сельхозпредприятиях, что можно объяснить низкой возможностью реализации горизонтального и вертикального путей распространения микобактерий туберкулеза в данных хозяйствах.
Подтверждено, что снижение дозы ППД туберкулина для млекопитающих до 5000 МЕ при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах позволяет в 2,4 раза снизить количество неспецифических реакций, по сравнению со стандартной дозойМЕ.
Установлен широкий ареал распространения М. avium на территории Новосибирской области.
Изучено генетическое разнообразие М. avium, циркулирующих на территории Новосибирской области и получены данные по нуклеотидным последовательностям mig-гена M. avium и спейсерной последовательности 16S-23S rRNA Mycobacterium spp., свидетельствующие об их эпизоотическом и эпидемическом потенциале.
Определена целесообразность применения пальпебральной туберкулиновой пробы для диагностики туберкулеза у мелкого рогатого скота в личных подсобных хозяйствах.
Данные о нуклеотидных последовательностях M. avium subsp. paratuberculosis str. K 10 использованы для разработки олигонуклеотидных праймеров и подбора режима амплификации (подана заявка на патент «Олигонуклеотидные праймеры и способ выделения ДНК Mycobacterium paratuberculosis – возбудителя паратуберкулёза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)» с приорететом № от 9.06.2010).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований раскрывают особенности эпизоотического процесса туберкулеза в личных подсобных хозяйствах и при внедрении в ветеринарную практику позволяют повысить эффективность осуществляемых в них противотуберкулезных мероприятий.
Апробация работы. Результаты работы опубликованы в материалах II Международной научно-практической конференции молодых ученых (пос. Краснообск Новосибирской обл., 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий» (Омск, 2009); II Международной научно-практической конференции (г. Горно-Алтайск, 2009), II Сибирского ветеринарного конгресса (Новосибирск, 2010).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринария»).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 145 страницах и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 24 рисунками. Список литературы включает 249 источников, в т. ч. 79 зарубежных авторов.
Внедрение результатов исследований. Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Диагностика и профилактика туберкулеза сельскохозяйственных животных в личных подсобных хозяйствах» (прот. № 2 от 9 сентября 2009) и «Взаимосвязь между реагирующими на ППД туберкулин для млекопитающих животных и циркуляцией микобактерий в окружающей среде» (прот. № 3 от 19 мая 2010), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты сравнительной комплексной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в общественных и личных подсобных хозяйствах с использованием аллергического, эпизоотологического, клинического, патологоанатомического, бактериологического и молекулярно-генетического методов.
2. Результаты генотипирования изолятов M. avium, выделенных от животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих.
3. Результаты диагностики на туберкулез мелкого рогатого скота в личных подсобных хозяйствах.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы
Работа выполнена в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных ГНУ Ииститут экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, в гг. в соответствии c планом НИР 08.01.02. «Разработать оптимальную комплексную систему диагностики, профилактики и оздоровления хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота».
Изучение эпизоотической ситуации по туберкулезу проводили по данным ветеринарной отчетности Управления ветеринарии Новосибирской области ( гг.) с учетом собственных аллергических и бактериологических исследований крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней, собак, а также результатов бактериологических исследований районных ветеринарных лабораторий. За период работ исследовано 4417 гол. крупного рогатого скота, 2394 гол. мелкого рогатого скота, 33 гол. свиней, 21 гол. собак личных подсобных хозяйств.
Комплексная диагностика туберкулеза животных проводилась лично автором в модельных хозяйствах Доволенского, Краснозерского и Ордынского районов, входящих в разные природно-климатические зоны.
В работе использовали ППД туберкулин для млекопитающих, производства – фирма БИОК» физиологический раствор, инсулиновые шприцы, кутиметр, цифровой ветеринарный кутиметр НПФ «КОСТА», питательные среды Финн-2, ИЭВСиДВ оборудование для постановки ПЦР, секвенатор «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System».
Аллергические исследования проводили согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», утв. (18.11.2002.) Для уменьшения дозы туберкулина стандартный раствор туберкулина разводили физиологическим раствором с соблюдением правил асептики в соотношении 1:1. Для исследования крупного и мелкого рогатого скота применяли внутрикожную и пальпебральную туберкулиновые пробы (в дозе 10000 МЕ и 5000 МЕ в 0,2 мл объема).
Обработку биоматериала от реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих животных проводили по методу и седиментации (, , 1994).
Изучение свойств выделенных культур микобактерий проводили согласно методическим рекомендациям «Лабораторная диагностика туберкулеза», 1988 г., используя различные питательные среды и различные режимы инкубации. Мазки, готовили по методу Циль-Нильсена.
Для проведения биологической пробы использовали морских свинок, (456 гол.), беспородных белых мышей (564 гол.), кроликов (228 гол.) и кур (20 гол.). Биологическую пробу проводили на животных, не реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих, заражая их культурой микобактерий по общепринятой методике. За зараженными лабораторными животными вели наблюдения в течение 3-х месяцев. Если за этот период животные не погибали, их подвергали убою.
Выделение суммарной ДНК микобактерий из образцов биоматериала проводили с использованием набора ДНК-сорб (ЦНИИЭ Роспотребнадзора). В работе применяли последовательности праймеров, заимствованные из источников литературы (M. L. Beggs et al., 2000; T. Adekambi et al., 2006; L. Xiong et al., 2006) и направленные на обнаружение mig-гена – фактор вирулентности M.avium, области senX3 – regX3, характерной для M.tuberculosis complex, 16S-23S rRNA – спейсерной последовательности для индикации большинства типичных и атипичных микобактерий. Постановку ПЦР осуществляли согласно общепринятой методике, используя набор лиофилизированных реагентов для ПЦР Gen Pack PCR Universal. Анализ полученных в ПЦР данных, проводили методом электрофореза в агарозном и полиакриламидном гелях, учитывая результаты в УФ-свете на трансиллюминаторе с длиной волны 254 нм. В качестве маркера использовали pUC19/Kzo9 I и pBluescript/Msp.
Секвенирование генов, построение дендрограмм и филогенетический анализ микобактерий в сравнении со штаммами, циркулирующими на различных территориях, проводили на базе ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в НИИ молекулярной биологии совместно с и .
2.2 Результаты исследований
2.2.1 Анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного
рогатого скота в Новосибирской области за 2001 – 2009 годы.
Территорию Новосибирской области делят на три различные природно-климатические зоны: Центрально-Восточная, Барабинская, Кулундинская, которые имеют отличия и в эпизоотической обстановке по туберкулезу крупного рогатого скота.
В Барабинской и Кулундинской зонах, наиболее сложное положение было в Доволенском и Кочковском районах, заболеваемость туберкулезом в которых составила: в 2005 – 4,37 и 2,4%, в 2006 – 2,52 и 2,42, в 2007 – 2,31 и 0,27% соответственно. Коэффициент напряженности эпизоотической ситуации в данных районах за этот период составил 0,18 – 0,06 и 0,08 – 0,06 соответственно.
Анализируя интенсивность проявления эпизоотического процесса за исследованный период в природно-климатических зонах, индекс неблагополучия по Центрально-Восточной зоне составил – 0,2; по Барабинской зоне – 3,2; по Кулундинской зоне – 6, что характеризует эпизоотическую ситуацию в данной зоне, как наиболее сложную.
Анализ эпизоотической ситуации в Новосибирской области показал, что за период с 2001 по 2009 годы в целом наблюдалось улучшение эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота: количество неблагополучных пунктов, имеющихся на 01.01.2001 г., сократилось в 4,25 раза по состоянию на 01.01.2009.
2.2.1.1 Результаты бактериологических исследований биологического материала от крупного рогатого скота, реагирующего на
ППД туберкулин для млекопитающих в различных
природно-климатических зонах
В процессе анализа результатов изучения культур микобактерий, изолированных из биоматериала крупного рогатого скота, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих, следует отметить, что в различных зонах видовая структура микобактерий неодинакова и соответствует уровню напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в этих зонах.
В различных зонах Новосибирской области Центрально-Восточной, Кулундинской и Барабинской из биоматериала животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих, изолировали и идентифицировали, в основном, атипичные микобактерии – 75,9, 62,1 и 66,4% соответственно. Культуры M. аvium, изолированные от крупного рогатого скота этих зон составляли 18,5, 18,4 и 19,8% соответственно. Патогенные культуры M. bovis и M. tuberculosis из данных зон – 5,6, 14,6 и 13,8% соответственно. Количество культур, выделенных от животных из различных хозяйств в исследуемых зонах, указывает на неоднородное развитие напряженности эпизоотической ситуации и уровня проводимых профилактических оздоровительных мероприятий.
2.2.2 Сравнительная оценка результатов аллергических исследований крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях и личных подсобных хозяйствах в Доволенском, Краснозерском и Ордынском районах
Новосибирской области
Для анализа проявления туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в общественных и личных подсобных хозяйствах нами собраны и проанализированы данные по трем районам Новосибирской области: Доволенскому, Краснозерскому и Ордынскому, как типичным представителям Барабинской, Кулундинской и Центрально-Восточной природно-климатических зон соответственно.
При анализе установлено, что за 5 лет средний процент реагирования крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих в крупных сельхозпредприятиях был неодинаков в различных районах: в Доволенском – 4%, в Краснозерском– 1,7, в Ордынском районе – 1,4%.
Процент реагирования крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах на ППД туберкулин для млекопитающих оказался практически одинаковый во всех районах и составил 0,7-0,8%. При этом установили, что количество реагирующих на туберкулин животных в Доволенском районе составило 0,8%, в Краснозерском – 0,7, в Ордынском – 0,8%. Таким образом, оказалось, что в личных подсобных хозяйствах процент реагирующих на туберкулин животных меньше, чем в сельхозпредприятиях – в 5, 2,4 и 1,8 раза соответственно.
Резкое различие показателей реагирования крупного рогатого скота отмечено в Доволенском районе, где в период исследований наблюдалось максимальное количество неблагополучных по туберкулезу пунктов.
2.2.2.1 Сравнительная оценка результатов аллергических
исследований крупного рогатого скота в личных подсобных
хозяйствах и в сельхозпредприятиях на примере модельных хозяйств
Доволенском район. На момент проведения исследований ( гг.) в населенных пунктах, входящих в Суздальский сельсовет, на территории которого расположено сельхозпредприятие № 1 (в дальнейшем хозяйство №1) не было зарегистрировано лиц, находящихся на лечении или состоящих на учете у фтизиатра. В состав хозяйства № 1 входят 6 отделений, расположенных в четырех населенных пунктах. Данное хозяйство неблагополучно по туберкулезу крупного рогатого скота с 2004 года.
В 2005 году количество реагирующих на ППД туберкулин животных в личных подсобных хозяйствах было значительно меньше (в 8,6 раз), чем в фермах хозяйства №1 (табл. 1).
Таблица 1 – Результаты аллергического исследования крупного рогатого скота хозяйства № 1 и личных подсобных хозяйств Суздальского сельсовета
Годы | Хозяйство № 1 | ЛПХ Суздальского сельсовета | |
2005 | исследовано | 1696 | 936 |
реагировало | ,2%) | 19 (2%) | |
2006 | исследовано | 3818 | 1704 |
реагировало | 298 (7,8%) | 58 (3,4%) | |
2007 | исследовано | 3797 | 933 |
реагировало | 67 (1,8%) | 17 (1,8%) | |
2008 | исследовано | 3499 | 567 |
реагировало | 122 (3,4%) | 9 (1,6%) | |
2009 за 1-2 кв. | исследовано | 869 | 279 |
реагировало | 5 (0,6%) | - | |
Всего | исследовано | 13679 | 4419 |
реагировало | 783 (5,7%) | 103 (2,3%) |
Примечание: «-» нет реагирующих
При проведении аллергических исследований крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах Суздальского сельсовета весной 2006 году часть животных (335 гол. – первая группа) исследовали внутрикожной туберкулиновой пробой ППД туберкулином для млекопитающих в дозе 10000 МЕ, а вторую часть (1365 гол.– вторая группа) в дозе 5000 МЕ. В первой группе реагировало 48 гол. (14,3%), во второй 52 гол. (3,8%). Реагирующих животных из обеих групп дополнительно исследовали через 30 дней внутрикожной туберкулиновой пробой в дозе 5000 МЕ и одновременно пальпебральной туберкулиновой пробой. Из первой группы животных при повторном исследовании реагировало 19 гол. (39,6%), а из второй группы –%). Пальпебральная проба совпала с результатами внутрикожной туберкулиновой пробы в 100% случаев. При анализе результатов повторного исследования установлено, что в первой группе (10000 МЕ) выпало 60,4% аллергических реакций, а во второй группе (5000 МЕ) – 25%, что в 2,4 раза меньше.
В 2007 году, совместно с ветеринарной службой Доволенского района, проведены 2 плановые туберкулинизации крупного рогатого скота личных подсобных хозяйств ППД туберкулином в дозе 5000 МЕ. Всего исследовано 933 гол. крупного рогатого скота, из которых реагировало на ППД туберкулин для млекопитающих 17 гол. (1,8%). Реагирующих на туберкулин животных повторно исследовали через 30 дней внутрикожно в дозе 5000 МЕ и одновременно пальпебральной пробой. При повторном исследовании на внутрикожную туберкулиновую пробу реагировали все 17 коров. Пальпебральная проба совпала с внутрикожной туберкулиновой пробой в 88,2% случаев.
В личных подсобных хозяйствах, входящих в Суздальский сельсовет в 2008 г. были проведены 2 плановые туберкулинизации. Всего исследовано 567 гол., из которых реагировало на ППД туберкулин для млекопитающих 9 гол. (1,6 %). При анализе полученных аллергических исследований установлено, что в личных подсобных хозяйствах животные реагируют в 2,1 раза меньше, чем в хозяйстве № 1.
При сравнении процента реагирующих животных в личных подсобных хозяйствах и в хозяйстве № 1 в целом за период с 2005 по 2009 гг. данный показатель в среднем был меньше в 2,5 раза.
При клиническом осмотре в годах 94 гол. крупного рогатого скота из личных подсобных хозяйств, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих, отмечали хороший аппетит и упитанность, блестящую шерсть, отсутствие каких-либо клинических признаков или симптомокомплексов, свойственных острым или хроническим заболеваниям, в том числе туберкулезу.
Краснозерский район. На момент проведения исследований ( гг.) в Краснозерском районе, в населенном пункте Коневского сельсовета, на территории которого расположено сельхозпредприятие № 2 (в дальнейшем хозяйство № 2), не было зарегистрировано лиц, находящихся на лечении или состоящих на учете у фтизиатра. Данное хозяйство неблагополучно по туберкулезу с 2005 года. От животных, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих, выделен возбудитель M. tuberculosis.
В 2005 году в Коневском сельсовете было исследовано туберкулиновой пробой 342 гол. крупного рогатого скота личных подсобных хозяйств, выявлено 3 гол. реагирующих, что составило 0,9% от исследованного поголовья (табл. 2). В 2006 году, было проведено 2 плановые туберкулинизации крупного рогатого скота личных подсобных хозяйств, исследовано 302 гол., из них реагировала одна, что составило 0,3% от исследованных животных. В 2007 году проведено 2 плановые туберкулинизации крупного рогатого скота, исследовано 277 гол., из них реагировало 7 гол. или 2,5%. При повторном исследовании этих животных, через 30 дней внутрикожной туберкулиновой пробой и пальпебральной пробой в дозе 5000 МЕ реагирующих не выявили. В 2008 и 2009 гг. в Коневском сельсовете проведено по 2 плановые туберкулинизации крупного рогатого скота, исследовано 211 и 170 гол., реагирующих животных не выявили.
Таблица 2 – Результаты аллергического исследования крупного рогатого скота хозяйства № 2 и личных подсобных хозяйств Коневского сельсовета
Годы | Хозяйство №2 | ЛПХ Коневского сельсовета | |
2005 | исследовано | 3892 | 342 |
реагировало | 365 (9,3%) | 3 (0,9%) | |
2006 | исследовано | 3892 | 302 |
реагировало | 282 (7,3%) | 1 (0,3%) | |
2007 | исследовано | 3729 | 277 |
реагировало | 161 (4,3%) | - | |
2008 | исследовано | 3783 | 211 |
реагировало | 158 (4,2%) | - | |
2009 за 1- 2 кв. | исследовано | 2483 | 170 |
реагировало | 45 (1,8%) | - | |
Всего | исследовано | 17779 | 1302 |
реагировало | 1,7%) | 4 ( 0,3%) | |
Р < 0,01 |
Примечание: «-» нет реагирующих
При сравнении процента реагирующих животных в личных подсобных хозяйствах и в хозяйстве № 2 за период с 2005 по 2009 гг. данный показатель был меньше в 19 раз.
Ордынский район. На момент проведения исследований ( гг.) Ордынский район был благополучен по туберкулезу крупного рогатого скота более 10 лет.
Анализ результатов аллергических исследований по данному хозяйству показал, что не установлено существенного увеличения или снижения количества реагирующего крупного рогатого скота за гг. и средний процент реагирования составил 1,4% от общего количества исследованных. Наибольший процент реагирующих животных отмечен в 2007 г. – 2,5%.
При сравнении процента реагирующих животных в личных подсобных хозяйствах и в хозяйстве № 3 за период с 2005 по 2009 гг. данный показатель в среднем был меньше в 2 раза.
Сравнение процента реагирующего крупного рогатого скота в вышеперечисленных личных подсобных хозяйствах и у животных, находящихся в сельхозпредприятиях показало, что животные реагируют меньше в личных подсобных хозяйствах, чем в крупных сельхозпредприятиях – в 2,5, 19 и 2 раза соответственно.
2.2.2.2 Бактериологическое исследование биоматериала от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД туберкулин
для млекопитающих, сельхозпредприятий
и личных подсобных хозяйств
Всего за период с 2005 по 2009 год в хозяйстве №1 исследовано 53 пробы биологического материала крупного рогатого скота, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих. Из них выделено 39 культур микобактерий: 1 – M. bovis (2,6%), 8 – M. avium (20,5), 2 – атипичные микобактерии II группы по Раньону (5,1) и,8%) – атипичных микобактерий IV группы по Раньону (табл. 3).
Таблица 3 – Результаты бактериологических исследований биологического материала от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих, в хозяйстве № 1 и личных подсобных хозяйствах Суздальского сельсовета (20гг.)
Годы | Выделенные культуры от крупного рогатого скота | ||||||
хозяйство № 1 | личные подсобные хозяйства | ||||||
M. bovis | M.vium | II группы по Раньону | IV группы по Раньону | M.tuber-сulosis | M. avium | IV группы по Раньону | |
2005 | 1 | - | - | 2 | - | 1 | 1 |
2006 | - | 2 | 1 | 12 | - | 10 | 14 |
2007 | - | 4 | 1 | 10 | 2 | 6 | 6 |
2008 | - | 2 | - | 3 | - | - | - |
2009 | - | - | - | 1 | - | - | - |
всего | 1(2,6%) | 8(20,5%) | 2(5,1%) | 28(71,8%) | 2(5%) | 17(42,5%) | 21(52,5%) |
Примечание: «-» – культура не выделена
За период с 2005 по 2008 год исследовано 94 пробы от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин личных подсобных хозяйств. Биологический материал обрабатывался методом и модифицированным методом седиментации ( и соавт., 1994). Суспензию, полученную в результате обработки материала, сеяли на 6-8 пробирок со средами Финн-2 и ИЭВСиДВ. Оставшуюся часть суспензии титровали по стандарту мутности 105 МЕ и проводили биологическую пробу с использованием 2-х морских свинок и 6-ти беспородных белых мышей. От лабораторных животных отбирали внутренние органы (легкие, печень, селезенку, почки), обрабатывали их методом седиментации и вносили на 6-8 пробирок со средами Финн-2 и ИЭВСиДВ. В результате исследований было изолировано 38 культур микобактерий, с которыми поставили биологическую пробу, используя для этих целей кроликов, морских свинок и кур по общепринятой методике. Дополнительно для дифференциации полученных культур производили следующие тесты: инкубирование при различных температурах и освещении, посевы на среды с салицилатом натрия.
Необходимо отметить, что данные бактериологических исследований во всех указанных случаях были подтверждены результатами ПЦР.
Сравнивая результаты бактериологических исследований 94 проб биологического материала, следует отметить, что наименьшее количество выделенных культур микобактерий получено при обработке проб методом – 3 (3,2%). Модифицированным методом с использованием принципа седиментации было выделено18 (19,1) культур, а при дополнительном заражении белых мышей –,6%) культур.
В процессе анализа культур микобактерий, изолированных от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин, следует отметить, что в хозяйстве №1 и личных подсобных хозяйствах Суздальского сельсовета отмечены различия в микобактериальном составе. Так, в хозяйстве №1 за исследуемый период выделены 1 культура M. bovis (2,6%) и 2 культуры атипичных микобактерий II группы по Раньону (5,1%). При этом данные культуры выделялись только от животных хозяйства №1. M. avium в хозяйстве №1 имеет более широкое распространение: количество их составило 20,5% от выделенных культур микобактерий. Наибольшую группу культур составили атипичные микобактерии IV группы по Раньону, на их долю пришлось 71,8% от общего количества изолированных культур.
В свою очередь из биологического материала от крупного рогатого скота личных подсобных хозяйств Суздальского сельсовета изолированы 2 культуры M. tuberculosis, что связано с тесным контактом с больными туберкулезом владельцами животных. Количество культур M. avium, изолированных из биологического материала от животных, реагирующих на туберкулин в личных подсобных хозяйствах Суздальского сельсовета, составило,5%), что в 2,1 раза больше, чем в хозяйстве №1. Количество культур, отнесенных к типичным микобактериям, составило 21 (52,5 %).
За период с 2005 по 2008 гг. проведены бактериологические исследования 52 проб биологического материала от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин, хозяйства № 2 (табл. 4).
Таблица 4 – Результаты бактериологических исследований биологического материала крупного рогатого скота, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих, в хозяйстве № 2
Годы | Выделенные культуры от крупного рогатого скота | ||||
Хозяйства № 2 | |||||
M. tube-rculosis | M. avium | II группы по Раньону | IV группы по Раньону | M. paratu-berculosis | |
2005 | 2 | - | - | 3 | - |
2007 | - | 6 | 1 | - | 1 |
2008 | - | - | - | 3 | - |
всего | 2(12,5%) | 6(37,5%) | 1(6,3%) | 6(37,5%) | 1(6,3%) |
Примечание: «-» – культура не выделена
Изолировано 16 культур микобактерий, что составило 30,8% от количества исследованных проб.
Из выделенных культур микобактерий идентифицированы: M. tuberculosis – 2 культуры (12,5%), M. avium – 6 (37,5), атипичных микобактерий II гр. по Раньону – 1 (6,3), атипичных микобактерий IV гр. по Раньону – 6 (37,5) и M. paratuberculosis – 1 культура (6,3%).
2.2.2.3 Исследование объектов внешней среды
За период с 2006 по 2007 гг. исследовано 38 проб из объектов внешней среды, включающих 20 проб почвы пастбищ и 18 проб воды с естественных водоемов, использующихся для выпаса и поения животных личных подсобных хозяйств. При исследовании 20 проб почвы, взятых на выпасах, выделено 8 культур микобактерий (40%). Из них 2 культуры (14,3%) были отнесены к атипичным микобактериям III гр. по Раньону и 7 (50%) – к атипичным микобактериям IV гр. по Раньону. Из 18 проб воды выделено 5 (27,8%)культур микобактерий, 2 (14,3) из которых отнесены к IV гр. по Раньону и 3 (21,4%) – к III гр. по Раньону.
2.2.2.4 Генотипирование выделенных изолятов M. avium
Генотипирование 27 культур микобактерий, полученных от крупного рогатого скота в Новосибирской области, показало, что 24 из них относится к M. avium, 14 из которых по фрагменту mig-гена гомологичны M. avium str. 104, выделенным на территории США и образуют с ним I кластер.
Уровень генетических отличий между ними невысок и степень гомологии нуклеотидной последовательности сибирских и североамериканских вариантов по фрагменту mig-гена с достаточно высокой статистической поддержкой составляет около 89%. Аналогичные варианты микобактерий уже были обнаружены в гг. на территории Ордынского, Доволенского, Чулымского, Кочковского и Карасукского районов. Они также имели минимальные отличия от североамериканских изолятов, заключающиеся в наличии нуклеотидных замен, как правило, не приводящих к замене аминокислот. В культуре M. avium, полученной в 2003 г. в Новосибирском районе, обнаружена специфическая нуклеотидная замена в позиции 142 н. (A→C) (нумерация приведена относительно последовательности фрагмента mig-гена штамма 104). Две культуры, выделенные в 2003 и 2006 годах на территории Ордынского и Карасукского районов области, имеют уникальные аминокислотные замены, находящиеся в одинаковых позициях: DSE→DYE, PRL→PGL, DES→DKS и на филогенетическом дереве образуют общую с M. avium str. 104, обособленную от других изолятов ветвь. Это может свидетельствовать о формировании адаптации к меняющимся условиям существования микробного агента.
Кластер II образовали 4 культуры, выделенные из Новосибирского, Ордынского и Карасукского районов области. При этом наибольший процент гомологии (83%) наблюдался со штаммами M. avium subsp. pararuberculosis str. K 10 и M. avium str. MAU 43598, распространенными на территории США и в странах Европы.
Шесть культур M. avium принадлежащих к M. avium subsp. avium, который является типичным возбудителем туберкулеза птиц, выделены на территории Доволенского (3 изолята), Краснозерского (2 изолята) и Карасукского районов (1 изолят) области. При этом 2 изолята Доволенского района были выделены от крупного рогатого скота, содержащегося в личных подсобных хозяйствах и имеющего тесный контакт с домашней птицей.
Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что популяция M.avium, циркулирующая на территории Новосибирской области, генетически неоднородна и типированные культуры микобактерий принадлежат к эпидемически и эпизоотически значимым субтипам M. avium str. 104, M. avium subsp. pararuberculosis str. K 10 и M. avium subsp.avium, распространенным на территории США и Западной Европы. Выделенные культуры микобактерий распределяются в три генетических кластера, которые не коррелируют с географической локализацией изолятов.
2.2.4.1 Генотипирование атипичных микобактерий
В 2006 г. в хозяйстве №1 Доволенского района от крупного рогатого скота личного подсобного хозяйства была выделена культура M. smegmatis. При популяционном анализе данной культуры нуклеотидные последовательности сформировали 2 генетические группы с двумя подгруппами каждая. Выравнивание нуклеотидных последовательностей позволило определить замены, характерные для M. smegmatis и приводящие к замене аминокислот. Была обнаружена уникальная аминокислотная замена, характерная для западно-сибирской культуры M. smegmatis. Построение консенсусного ML-дерева, включающего все культуры, изученные методом секвенирования, подтвердило принадлежность культуры к M. smegmatis. Культура образовала один клад с M. smegmatis str. MC 2 155, являющимся мутантным вариантом дикого типа штамма M. smegmatis ATCC 607.
Две культуры, полученные из проб с пастбищ Краснозерского района и из лимфатических узлов крупного рогатого скота Доволенского района на основании изучения межгенной последовательности 16S-23S rRNA отнесены к аналогичным непатогенным штаммам M. vaccae.
2.5 Результаты исследований мелкого рогатого скота на
туберкулез в личных подсобных хозяйствах
Мелкий рогатый скот широко распространен в личных подсобных хозяйствах. Такие животные, по данным (1990), и соавт. (1994), могут являться источником возбудителя туберкулеза или быть причиной сенсибилизации крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих.
Нами проведено аллергическое исследование 2394 гол. мелкого рогатого скота на туберкулез в Суздальском сельсовете Доволенского района пальпебральной пробой, которая, по данным исследований и соавт. (2000), оказалась наиболее технологичной и информативной при исследовании овец на туберкулез. На туберкулин реагировало 10 животных (0,4%). Реагирующих животных убили, провели ветеринарно-санитарную экспертизу туш и органов. Изменения, характерные для туберкулеза, обнаружены в печени у двух животных старше 6 лет.
Полученный биоматериал подвергли лабораторному исследованию методом седиментации. В результате бактериологических исследований 10 проб биоматериала были изолированы и идентифицированы 5 культур M. avium.
Проведенные исследования позволяют нам заключить, что причиной реагирования на ППД туберкулин для млекопитающих мелкого рогатого скота может служить их инфицирование M. avium. У таких животных отмечены характерные для туберкулеза изменения во внутренних органах, что согласуется с данными (1990), и соавт., (1994).
3. ВЫВОДЫ
1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в хозяйствах Новосибирской области (по данным гг.) различается по зонам (индекс неблагополучия в Центрально-Восточной зоне составил – 0,2; в Барабинской – 3,2; в Кулундинской – 6) и имеет тенденцию к улучшению, количество неблагополучных пунктов – за 9 лет уменьшилось в 4,25 раза.
2. При исследовании биологического материала крупного рогатого скота в различных зонах Новосибирской области (Центрально-Восточной, Кулундинской и Барабинской), реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих, изолировали и идентифицировали атипичные микобактерии в 75,9; 62,1 и 66,4%, M. avium в 18,5; 18,4 и 19,8%, патогенные M. bovis и M. tuberculosis – в 3,7; 14,6 и 13,7% соответственно
3. Количество реагирующего крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих в личных подсобных хозяйствах значительно ниже, чем в сельхозпредприятиях, расположенных в пределах одних и тех же населенных пунктов: в Ордынском районе (Центрально-Восточная зона) – в 1,8, в Доволенском районе (Барабинская зона) – в 5 и Краснозерском районе (Кулундинская зона) – в 2,4 раза.
4. Применение ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 5000 МЕ в объеме 0,2 мл при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах позволяет в 2,4 раза снизить количество неспецифических реакций по сравнению с дозой 10000 МЕ.
5. Установлено, что в природно-климатических зонах Новосибирской области количество культур M. avium, выделенных от животных сельхозпредприятий, реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих, практически одинаково и составляет в Центрально-Восточной зоне –18,5%, в Барабинской – 19,8% и Кулундинской – 18,4% от числа выделенных культур. В личных подсобных хозяйствах культур M. avium выявляли в 2,1 раза больше по сравнению с животными в сельхозпредприятиях.
6. M. avium, циркулирующие на территории Новосибирской области, генетически неоднородны и распределяются в три генетических кластера, которые по субтипу не коррелируют с географической локализацией.
7. У мелкого рогатого скота личных подсобных хозяйств с помощью пальпебральной туберкулиновой пробы выявлена сенсибилизация M. avium. Установлено, что в 20% случаев M. avium вызывает у мелкого рогатого скота изменения, характерные для туберкулеза.
4. Практические предложения
По материалам диссертации разработаны:
1. Методические рекомендации «Диагностика и профилактика туберкулеза сельскохозяйственных животных в личных подсобных хозяйствах», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, (протокол от 9 сентября 2009).
2. Методические рекомендации «Взаимосвязь между реагирующими на ППД туберкулин для млекопитающих животных и циркуляцией микобактерий в окружающей среде», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 01.01.01).
5. Список работ опубликованных по теме диссертации.
1. Колосов, системы эпизоотического мониторинга туберкулеза крупного рогатого скота с использованием информационных технологий / , , // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2006. – № 4. – С. 52-57.
2. Тупота, белых мышей для повышения изоляции культур микобактерий из биологического материала крупного рогатого скота / , , // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2009. – № 6 – С. 65-70.
3. Тупота, туберкулеза крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах / , , // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2009. – № 9 – С. 73-77.
4. Тупота, значимость различных методов выявления микобактерий / , , // Ветеринария. – 2010. – № 3. – С. 56-58.
5. Першикова, Mycobacterium arupense на территории Новосибирской области / , , // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций: материалы Всерос. науч.-практ. конф. – Омск, 2009. – С. 150-153.
6. Тупота, на туберкулез животных личных подсобных хозяйствах / , // Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий: материалы II-й Междунар. науч.-практ. конф. – Горно-Алтайск, 2009. – С. 159-166.
7. Тупота, типирование Mycobacterium avium / , // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы II Сибирского ветеринарного конгресса (февраль, 2010) – Новосибирск, 2010 – С. 374-375.
