УДК. 639.371.
ВЛИЯНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ СЕГОЛЕТОК КАРПА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНОВ МЕДИ
, ,
Целью данного исследования было установление степени влияния аскорбиновой кислоты на физиологическое состояние сеголеток карпа при интоксикации ионами меди в концентрации 0,3 и 0,6 мг/л. Для этого проводили анализ темпа роста и динамики индексов внутренних органов при интоксикации ионами меди и комплексном воздействии сульфата меди и аскорбиновой кислоты. Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии аскорбиновой кислоты на организм, даже при интоксикации ионами меди.
темп роста, коэффициент массонакопления, скорость роста, среднесуточный прирост, масса тела, порка, печень, селезенка, почки, жабры, индекс печени, индекс почки, индекс жабр, токсикант, летальная концентрация (LC50%), аскорбиновая кислота.
ВВЕДЕНИЕ
Усиливающие антропогенное воздействие приводит к поступлению и накоплению токсичных веществ в водоемах. Наибольшее отрицательное воздействие на гидробионтов оказывают ионы тяжелых металлов, не подвергающиеся трансформации и накапливающиеся в гидробионтах. Особенно актуальна эта проблема в районах, где развита горнодобывающая отрасль промышленности /1/.
Так как в настоящее время не существует методов очистки, обеспечивающих 100%-ного извлечения ионов тяжелых металлов из сточных вод горно-обогатительных предприятий, то перспективным является разработка методов, обеспечивающих поддержание защитных сил организма /2/.
При воздействии экстремальных факторов изменяется соотношение пластических и энергетических процессов в сторону преобладания последних. В тканях нарушается синтез и распад белков, углеводов и липидов, изменяется содержание коферментов и коферментных витаминов, увеличивается содержание окисленных или восстановленных форм НАД. Преобладание восстановленной формы НАД приводит к переключению расщепления углеводов на аноксидантный путь, а значит, происходит истощение энергетических запасов клетки /3/.
Одним из перспективных направлений в рыбоводстве является стимулирование роста и развития рыб за счет использования биостимуляторов, среди которых наиболее доступным является аскорбиновая кислота и ее производные.
Эффективность применения аскорбиновой кислоты заключается в двойственном воздействии. С одной стороны, аскорбиновая кислота оказывает стимулирующее влияние на физиологические процессы (является биостимулятором), а с другой стороны, оказывает антиоксидантное воздействие, которое проявляется в предотвращении или замедлении окисления других веществ молекулярным кислородом. Продукты окислительной деструкции (перекиси, альдегиды, кетоны) при определённой концентрации могут вызвать остановку роста или оказать токсическое влияние на организм рыб. Сами перекиси, возникающие в процессе окисления жиров, являются сильными окислителями и разрушают жирорастворимые витамины. При воздействии антиоксиданта с активными радикалами образуются малоактивные радикалы, процесс окисления замедляется или прекращается вовсе /3/.
Всасывание аскорбиновой кислоты происходит с помощью простой диффузии на всём протяжении желудочно-кишечного тракта, особенно в тонком кишечнике. В крови она частично связана с белками, часть её находится в свободном виде. Самое высокое содержание витамина С в надпочечниках, печени, лёгких. При стрессах содержание витамина С уменьшается с одновременным увеличением синтеза стероидных гормонов.
Содержание аскорбиновой кислоты в теле у рыб различно, максимальные значения отмечают в тканях и икре, а в печени и мозге содержание аскорбиновой кислоты почти в два раза ниже, чем в тканях. Для карпа эти значения составляют в мышцах 8,8 ± 0,73 мг/100г ткани, причём в красной мускулатуре ниже, чем в белой. Максимальная концентрация аскорбиновой кислоты в мышцах отмечается летом /4/.
Продуктами окислительного распада аскорбиновой кислоты является дегидроаскорбиновая кислота, дикетогулоновая, щавелевая и некоторые другие кислоты. Свободная аскорбиновая кислота и её продукты распада выводятся с мочой.
Многостороннее положительное действие аскорбиновой кислоты связано с её физико-химическими свойствами:
1) образование свободных радикалов, обладающих исключительной активностью и участвующих в одноэлектронных переносах, а также во многих биохимических реакциях;
2) поддержание высокой концентрации ц. АМФ и ц. ГМФ, которых называют вторым посредником, поскольку они участвуют в регуляции терминальных и энзиматических путей;
3) способностью аскорбиновой кислоты реагировать непосредственно с гистамином, снимая биохимические стрессы;
4) участием в гидроксилировании лизина и пролина при образовании коллагена, что важно при заживлении ран.
Основная роль аскорбиновой кислоты – восстановление различных субстратов. В частности, витамин С может редуцировать дисульфидные связи в белках до сульфигидрильных, активируя тем самым функции ферментов, содержащих эти группы.
Аскорбиновой кислоте принадлежит также регулирующая роль в синтезе кортикостероидов в надпочечной железе, которые играют существенную роль в адаптации организма к различным условиям. Она играет важную роль в процессе обмена гормонов щитовидной и поджелудочной желёз и половых гормонов.
Аскорбиновая кислота влияет также на состояние углеводного обмена, в том числе пентозофосфатного пути – при её недостатке замедляется биосинтез гликогена в печени, а также уменьшается активность гексокиназы, понижается уровень обмена в цикле трикарбоновых кислот. Витамин С участвует в фиксации железа в процессе синтеза гемоглобина, в восстановлении метгемоглобина в эритроцитах, в обмене серы, инактивации токсинов и ядов, проявляет антиоксидантное действие. Витамин С способен, до известной степени, ослаблять последствия недостатка витаминов А, Е, В1, В2, В12.
Ионы меди (Cu) легко образуют комплексные соединения с неорганическими и органическими веществами, которые адсорбируются на взвесях. Поэтому медь редко присутствует в виде свободного иона, за исключением мягких вод с повышенной кислотностью /5/.
Металлическая медь не вызывает у рыб нежелательных изменений, однако ее соли токсичны уже в концентрации 0,01 – 0,02 мг/л. В высоких концентрациях соли меди оказывают вяжущее, раздражающее и прижигающее действие, а при низких – инактивируют дыхательные пигменты. Токсичность меди возрастает при уменьшении жесткости воды, температуры и содержания кислорода /5/.
При остром отравлении рыбы возбуждены, очень активны, тело их покрывается коагулированной слизью голубого цвета. У рыб наблюдается затрудненное дыхание, они держатся на поверхности воды. В жабрах и коже наблюдается гиперемия, дистрофия, некроз и десквамация покровного эпителия. В печени и почках – зернистая дистрофия и деструкция эритроцитов. При хронических воздействиях сульфата меди количество слизи уменьшается, кожные покровы бледны, шершавые, нарушена целостность плавников, рыбы истощены.
Гистологические изменения характеризуются гиперплазией, вакуольной дистрофией, некробиозом эпителия жабр, зернисто-жировой дистрофией и некробиозом печеночных клеток, эпителия мочевых канальцев, распадом эритроцитов, гемосидерозом в селезенке и почках, дистрофическими и атрофическими изменениями в скелетной мускулатуре. Смерть наступает через длительное время. Обратимость отравлений невелика: вся рыба, перенесенная в проточную воду в стадии опрокидывания погибает; в стадии первых симптомов отравления погибает более чем 50 % /6/.
Для гидробионтов более токсичны хорошо растворимые в воде хлориды, нитраты и сульфаты меди. Летальная концентрация сульфата меди при экспозиции 48 ч равна 0,28 мг/л /6/.
Токсическое действие солей меди сильнее проявляется в мягкой воде; в жесткой воде часть меди связывается, образуя карбонат меди (таблица). Большие концентрации растворов меди (свыше 1 г/л) рыба способна распознавать и избегать.
Таблица. Токсичность сульфата меди для карпа /6/
Длина, см | Масса, г | Концентрация меди (мг/л) | |||||
40 | 8 | 4 | 0,8 | 0,4 | 0,08 | ||
11 | 65 | 3 ч | 6 ч | 8 ч | 2 дн | 6 дн | 8 дн |
Mount Donald (1968) изучал токсичность солей меди (CuSO4) в хронических опытах с целью установления ПДК, при которой не отмечалось бы влияния на рост и размножение рыб. С этой целью он в течение 11 месяцев выдерживал рыб в различных концентрациях CuSO4 и установил, что такие условия создаются при значениях от 3 до 7% 96-часового среднего предела устойчивости (CL50) /6/.
Перенос ионов меди происходит против градиента концентрации, что свидетельствует об их активном транспорте. При воздействии ионов меди на организм рыб, происходит изменение интенсивности газообмена – вначале увеличение, а затем снижение дыхательного ритма и, как следствие, увеличение индекса жабр. Ионы меди локализуются в жабрах и внутренних органах.
Наиболее токсичное воздействие оказывают ионы меди на личинок (медь занимает 3-е место по шкале токсичности после ртути и серебра) /7/.
При воздействии ионов меди в концентрации 0,006 – 0,015 мг/л на личинок отмечали нарушение движений жаберной крышки, локомоторной активности, а также отношение к корму. Ионы меди в приведенной концентрации привели к поражению жабр и печени и образованию кровоизлияний в первом случае у% , а во втором у% личинок /8/.
Ионы меди в концентрации 0,05 мг/л влияют на метаболизм глутатиона (активный интоксикант тяжелых металлов), стимулируют активность трансфераз, но подавляют их синтез, снижают отношение эозинофилов к базофилам /9/.
МЕТОДЫ
Целью данной работы была оценка влияния аскорбиновой кислоты – активного биостимулятора и иннактиватора токсичных веществ на физиологическое состояние сеголеток карпа при воздействии ионов меди в различной концентрации.
Объектом для исследования служили сеголетки карпа, выращенные в прудах УОРХ КГТУ, которых после осенних обловов доставили в аквариальную кафедры аквакультуры. Молодь до эксперимента адаптировали в течение 15 дней к гидрохимическим условиям. Затем провели взвешивание и разделили молодь на 3 группы так, чтобы различия по массе тела не превышали 1 г: 1 – контрольная, 2 - группа, обрабатываемая сульфатом меди, 3 – группа, обрабатываемая одновременно и солью меди, и аскорбиновой кислотой.
Рыб поместили в экспериментальные установки замкнутого цикла водообеспечения. Количество молоди в каждой группе составляло 25 шт., опыт проводили в двойной повторности.
Исследования состояли из двух частей. В качестве интоксиканта использовали сульфат меди, для определения содержания в реактиве ионов меди проводили расчет.
Концентрацию ионов меди определяли как 1/10 отLC100% в первой части исследований (или 0,6 мг ионов меди/л) и 1/10 от LC50% во второй части исследований (или 0,3 мг ионов меди /л). Доза аскорбиновой кислоты составляла всегда 0,3 мг/л.
В первой части исследования масса тела сеголеток в опыте была от 5,23 г (опыт 1) до 5,74 г (контроль).
Рыбоводные емкости ежедневно чистили и проводили замену 1/3 объема, снимали показатели гидрохимического режима (кислорода, рН, температуры, аммонийного азота и нитритов). Затем вносили растворенный сульфат меди и сразу аскорбиновую кислоту. Кормили молодь 2 раза в день, дозу кормления назначали по таблицам с последующей корректировкой по поедаемости (Скляров, Гамыгин, 1987).
Исследования при постановке второй части опыта вели аналогично. Масса молоди карпа на начало исследований и составляла от 4,28 г (опыт 1) до 4,71 г (контроль), а масса тела молоди в опыт 2 имела промежуточные значения.
В первой части исследований через 96 ч и во второй части исследований через 25 сут произвели вскрытие рыб и оценку их физиологического состояния при применении метода морфофизиологических индикаторов /10/. Определяли длину, массу тела и внутренних органов (печень, селезенка, почки и жабр). Вычисляли динамику индексов в эксперименте. Все результаты обрабатывались статистически по общепринятым методикам, а достоверность различий определяли по критерию Стюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам эксперимента было отмечено, что в первой части опыта при воздействии ионов меди в концентрации 0,6 мг/л произошло увеличение всех исследованных индексов органов, что согласуется с литературными данными.
Увеличение индекса жабр, очевидно, произошло за счет разрастания жаберных лепестков, так как медь влияет на интенсивность дыхания, особенно это выражено при кратковременном воздействии токсиканта. По литературным данным присутствие меди в жаберных лепестках отмечается уже через 1 – 24 ч в зависимости от концентрации ионов /11/. Ионы меди активно поступают в организм против градиента концентрации, что свидетельствует об их активном транспорте и оказывают прижигающее влияние на жабры. В результате рыба испытывает удушье, а масса жабр увеличивается. Таким образом, увеличение индекса жабр следует рассматривать как адаптивную реакцию организма на воздействие среды.
В опытной группе 2 индекс жабр имел максимальные значения и составлял 6,21%, очевидно за счет совместного воздействия ионов меди аскорбиновой кислоты. Согласно литературным данным внесение аскорбиновой кислоты приводит к разрастанию жаберных лепестков, а в конечном итоге к увеличению их массы. В данном случае, очевидно, максимальное увеличение индекса жабр, является результатом совместного влияния вносимых веществ.
Величина индекса жабр в опытной группе 1 была несколько ниже и составляла 6,07%, тогда как в контроле этот показатель был 5,31%.
При сравнении полученных результатов, достоверно большие значения были отмечены по индексу жабр в опытных группах, чем в контроле (р<0,05). При сравнении величины этого показателя в опытных группах отмечали, что различия не достоверны.
Увеличение индекса печени в опытной группе 1, очевидно, произошло, во-первых, за счет изменения обмена веществ, а во-вторых, за счет активного синтеза иннактиваторов ионов тяжелых металлов – тяжелых белков SH-лигантов. Индекс печени в этой группе имел максимальное значение и составлял 3,41%, тогда как в контроле величина этого показателя была 2,13% (рис.1).
Величина индекса печени в опыте 2 была несколько меньше, чем в опыте 1, и составляла 3,24%. Очевидно, это связано с тем, что аскорбиновая кислота, поступая из вне, активно включается в синтез белков, так как она принимает участие в редуцировании дисульфидных связей в белках, играющих роль в инноктивации ионов тяжелых металлов. Меньшие значения по индексу печени, очевидно, можно объяснить тем, что аскорбиновая кислота, всасываясь через жабры, непосредственно поступает в кровь, а затем в печень и селезенку, где участвует в инноктивации токсичные вещества.
Достоверными были различия по индексу печени между контрольной и опытными группами, а различия между опытными группами не достоверны.
В опытной группе 1, при внесении ионов меди, увеличился также и индекс селезенки, что очевидно связано с тем, что ионы меди влияют на гемопоэз. Согласно литературным данным, медь влияет на массу внутренних органов, особенно тех, где идут активные обменные процессы, т. е. на печень, селезенку и почки.
В опытной группе 2 увеличение индекса было не столь значительное (1,30%), как в опыте 1 (1,50%), однако данные показатели были статистически выше, чем в контроле (0,62%).
Сравнивая полученные результаты с имеющимися данными, следует отметить, что при применении аскорбиновой кислоты у сеголеток карпа увеличивается относительная масса печени и селезенки, величины данных индексов составляют для печени 1,73%, а для селезенки 0,22%.
Индекс почки увеличился больше всех других показателей внутренних органов. При воздействии ионов меди на почки ложится дополнительная нагрузка по выведению токсиканта и продуктов обменных процессов при интоксикации. При долговременном воздействии тяжелых металлов в почках отмечаются процессы некроза, а также образование камней, что приводит к увеличению индекса. В опытных группах индекс почки статистически достоверно был выше – от 2,1 (опыт№1) до 2,58% (опыт2), чем в контроле 0,58%.
При проведении второй части исследований отмечали, кроме физиологического состояния сеголеток карпа, еще и скорость роста за период исследований, вычисляя среднесуточную скорость роста, коэффициент массонакопления и среднесуточный прирост. По полученным результатам максимальные показатели были отмечены в контроле (1,6; 0,0062 и 1,58%, соответственно), а минимальные в опыте 1 при воздействии ионов меди (0,59; 0,0032 и 0,58% соответственно), что связано с угнетением роста молоди при воздействии токсикантов.
Темп роста молоди карпа в опыте 2 был ниже, чем в контроле, но значительно выше, чем в опыте 1 (1,02; 0,059 и 1,02% соответственно). Увеличение темпа роста в опыте 2 связано с ростостимулирующей функцией аскорбиновой кислоты. Полученные результаты согласуются с имеющимися материалами по влиянию аскорбиновой кислоты на темп роста сеголеток карпа. Так, применение аскорбиновой кислоты привело к увеличению среднего значения коэффициента массонакопления до 0,1, а среднесуточного прироста до 4,11%. Полученные результаты по темпу роста значительно ниже, что связано с отрицательным влиянием заданной концентрации ионов меди на рост.
При оценке физиологического состояния молоди карпа отмечали аналогичную картину как и при проведении первой части исследований. Констатировали увеличение индексов внутренних органов, причем в опытной группе 1, при воздействии ионов меди, значения исследованных индексов были больше, чем в опытной группе 2, при совместном применении ионов меди и аскорбиновой кислоты.
Индекс жабр. В опытной группе 2 отмечали максимальные значения исследованного органа - 7,66%, а в опытной группе 1 величина индекса жабр была статистически не достоверно ниже и составляла 7,23%, однако полученные значения достоверно выше, чем в контроле (5,02%).
Индекс печени. Максимальные значения этого показателя отмечали в опытной группе 1 (3,73%), а в опытной группе 2 величина этого показателя была статистически не достоверно ниже и составляла 3,35%, в то время как в контроле этот показатель был достоверно ниже, чем в опытных группах и составлял 2,43% (рис.2).
Индекс почки. В опытной группе 2, при совместном внесении аскорбиновой кислоты и ионов меди, отмечали максимальные значения исследованного органа - 1,68%, а в опытной группе 1 величина статистически не достоверно ниже и составляла 1,57%, однако полученные значения достоверно выше, чем в контрольной группе (0,72%).
Индекс селезенки. Максимальные значения были получены в опытной группе 2 – 0,745, а минимальные в опытной группе 1 – 0,58%, причем в контрольной группе величина этого показателя была 0,63% и занимала промежуточное положение. Увеличение этого показателя в контрольной группе по отношению к опытной группе 1, очевидно, связано с высоким темпом роста массы тела в контроле, что отражается на увеличении индексов внутренних органов.
Достоверными были различия между контролем и опытом 1 по индексу жабр (р<0,001) и почки (р<0,01), а между контролем и опытом 2 по индексу жабр (р<0,001), печени (р<0,001) и селезенки (р<0,05). При сравнении результатов между опытным группами достоверными оказались различия по индексу жабр (р<0,05) и индексу почки (р<0,001).
ВЫВОДЫ
При воздействии ионов меди (опыт 1) отмечается увеличение индексов всех исследованных органов – печени, почки, селезенки и жабр, что является результатом токсического воздействия ионов меди на организм сеголеток карпа.
При комплексном воздействии аскорбиновой кислоты и ионов меди (опыт 2) наблюдали не столь однозначную картину. При концентрации ионов меди 0,3 мг/л отмечали снижение индекса печени, по сравнению с опытом 1, что по нашему мнению, связано с тем, что аскорбиновая кислота, являясь иннактиватором токсинов, часть нагрузки по обезвреживанию токсиканта берет на себя.
При увеличении концентрации ионов меди до 0,6 мг/л отмечали в опытной группе 2 значения индексов печени и селезенки были меньшие, чем в опыте 1. По нашему мнению это является результатом того, что аскорбиновая кислота иннактивирует ионы меди, в связи с этим снижается нагрузка на печень – основной орган детоксикации. Снижение индекса селезенки стоит рассматривать как результат адаптивных процессов в организме в результате стресс-корректорного действия аскорбиновой кислоты.
Таким образом, на основании полученных результатов, можно рекомендовать для практического применения на рыбоводных хозяйствах, в качестве интоксиканта ионов тяжелых металлов аскорбиновую кислоту.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Метелев токсикология / , . - М.: Колос, 19с.
2. Савваитова в строении рыб, как индикатор состояния природной среды / // Вопросы ихтиологии.- 1995. - Т. 35, №2. – С. 162 – 188.
3. Беспамятнов допустимые концентрации вредных веществ в окружающей среде / . – Л.: Изд-во «Химия», 1999.-163 с.
4. Глубоков С как препарат, повышающий жизнестойкость в раннем онтогенезе / // Водная токсикология. – М., 1988. - С. 130-134.
5. Шавырина токсикорезистентности цианобактерий к ионам меди / // Известия РАН№2. - С. 227-232.
6. Горовская молоди рыб на действие ионов меди / // Экологическая физиология рыбс.
7. Берман тяжелых металлов и их распределение в органах и тканях / , // Экологическая физиология рыбс.
8. Лукьяненко рыб / . - М.,19с.
9. Добрянская изменения внутренних органов рыб / // Зоологический журнал. – 1964. – Вып. 44. – С. 25-29.
TO EFFECT OF ASCORBIC ACYD ON THE PHYSIOLOGICAL CONDITION FINGERLINGS OF CARP IN THE INFLUENCE IONS COPPER
Т. М Kurapova, E. I. Chrustalev, N. G. Batuchtina
We are to investigate the effect ions copper in concentration 1/10 at lately concentration ions of cupper. The study to the parameters physiological condition are - grows and morphophysiological indexs: index liver, kindey index, gill index, index spleen.
