Физиология гемостаза

ФИЗИОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА

С. М.СТРУКОВА

Глава 2. ВТОРИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ

1.2  . Факторы свертывания крови.

Эволюция представлений о механизме свертывания крови развивается с 60-х годов прошлого столетия, когда была предложена модель организации процесса свертывания как каскада последовательных реакций, идущих с ускорением (см. главу1). Долгое время считали, что начальные стадии свертывания крови происходят по двум разным путям: внутреннему и внешнему. По внутреннему пути каскад свертывания крови запускает механизм активации фактора XII (фактора Хагемана),одного из факторов контактной фазы свертывания крови, а по внешнему пути – активация фактора VII, после его связывания с тканевым фактором, экспонированным на поверхность поврежденных клеток и тканей. Далее следует цепь высокоспецифических реакций активации проферментов, причем каждая следующая реакция усиливает начальный сигнал. Все реакции свертывания протекают на поверхности, на которой формируются комплексы ферментов с их кофакторами не ферментной природы. Внутренний путь свертывания крови активируется при контакте крови с отрицательно заряженной поверхностью, на которой проферменты контактной фазы свертывания крови превращаются в ферменты. Внешний путь - при контакте крови с тканевым фактором, который экспонируется в циркуляцию при повреждении стенки сосуда и служит рецептором фактора VII свертывания крови.

Известны 13 факторов свертывания, шесть из которых являются проферментами сериновых протеиназ( факторы II, VII, IX, X, XI и XII), один (фактор XIII) является

проферментом трансглутаминазы, два фактора (V и VIII) не обладают ферментативной активностью и служат кофакторами протеиназ, фактор III (тромбопластин) получил название тканевого фактора, а необходимые для свертывания крови ионы кальция ранее называли фактором IV.

К настоящему времени расшифрована структура генов всех факторов свертывания, ингибиторов протеиназ, участвующих в процессе свертывания крови, определена первичная, вторичная и третичная структура белков системы свертывания и выяснены их основные функции. (Таблица 4)

Таблица 4 Факторы свертывания крови и ингибиторы

Белок	Ген положение на хромосоме / размер (т. п.о)	Время полужизни (дни)	Концентрация (нМ) в плазме/Mr (kDa)	Функция
Факторы протромбинового комплекса
Протромбин (фактор II)	11p11-q12/21	2.5	1400/72	Профермент
Фактор VII	13q34/12.8	0.25	10/50	Профермент
Фактор IX	Xq26/34	1.0	90/57	Профермент
Фактор X	13q34/27	1.25	170/58,5	Профермент
Протеин С	2q13-q14/11	0.25	60/62	Профермент
Протеин S	3p11-q11/80	1.75	300/69	Кофактор АПС
Протеин Z	13q3/2,5	2.5	47/62	Кофактор ингибитора Xa-ZPI
Факторы контактной фазы
Фактор XI	4q35/23	2.5-3.3	30/160	Профермент
Фактор XII	5q33-qter/12	2-3	375/78	Профермент
Прекалликреин	4q34-q35 / 22	1.1	450/82	Профермент
Кофакторы и рецепторы
Фактор V	1q23/80	0.5	20/330	Кофактор фактора Xa
Фактор VIII	Xq28/186	0.3-0.5	0.7/285	Кофактор фактора IXa
Высокомолекулярный кининоген	3q26-qter/27	5	6000/108	Кофактор прекалликреина и фактора XI
Тканевой фактор	1p22-p21/12.4			Кофактор и рецептор фактора VII
Тромбомодулин	20p11.2/ 4			Кофактор и рецептор тромбина
Субстрат и профермент
Фибриноген	4q23-q32/50	3-5	8800/340	Cтруктурный белок(фактор I)
Фактор XIIIa (фибринстабилизирующий фактор) (плазменный)	6p24-p25/160	9-10	70/320	Профермент трансглутаминазы
Фактор XIIIb (тромбоцитарный)	1q31-q32.1./28			Профермент
Ингибиторы
Антитромбин III	1q23-q25/13.5	2.5-4.0	2500/58	Ингибитор тромбина, фактора Xa и др
Кофактор II Гепарина	22q11/16	2.5	1200/66	Ингибитор тромбина
Ингибитор пути тканевого фактора (TFPI)	2q32/85		2.5/40	Ингибитор фактора Xa и фактора VIIa
Ингибитор зависимый от протеина Z (ZPI)	/2.4		/72	Ингибитор фактора Xa
Ингибитор Фибринолиза активируемый тромбином (TAFI)	13		73 / 49	Прокарбоксипептидаза

Начальный стимул инициирует ограниченный протеолиз профермента - фактора свертывания (расщепление одной или двух пептидных связей ) и образование активного фермента, который расщепляет следующий фактор свертывания крови и так далее. Ограниченный протеолиз факторов свертывания - первая особенность процесса свертывания. Последовательность реакций активации факторов свертывания получила название каскада свертывания крови. Реакции свертывания идут с ускорением и, более или менее, в соответствии с концентрацией факторов свертывания в крови. Так, одна молекула первого протеолитического фактора генерирует десять молекул второго, который генерирует сто молекул следующего и т. д.

Необходимым условием для осуществления высокой скорости ограниченного протеолиза проферментов является их связывание (иммобилизация) на специальных участках клеточной поверхности, что обеспечивает локализацию и концентрацию факторов в участке повреждения. Вторая особенность процесса свертывания - локализация процесса на поверхности поврежденного эндотелия и активированных клеток крови. Определенные участки доменной структуры факторов свертывания отвечают за высокоаффинное связывание белков с клеточными мембранами, рецепторами и кофакторами, что существенно ускоряет процесс образования ферментов и процесс свертывания.

Связывание многих факторов происходит при участии фосфолипидов и ионов Са2+ . Благодаря связыванию факторов свертывания с поверхностью клетки и белок-белковым взаимодействиям факторов происходит изменение их конформации, благоприятствующее эффективному течению реакций, и защита ферментов от их ингибиторов. Третья особенность процесса свертывания - необходимость кофакторов свертывания, рецепторов, ингибиторов и активация механизмов отрицательной и положительной обратной связи, регулирующий образование тромбина.

Итак, свертывание крови происходит на поверхности поврежденного эндотелия и активированных тромбоцитов, на которой происходит сборка комплексов - профермент, фермент, активатор (кофактор), активация проферментов, каскад образования активных протеиназ и реакции положительной и отрицательной обратной связи, регулирующие свертывание крови.

1.3  Cтруктурные особенности факторов свертывания крови.

В соответствии со структурными особенностями факторы свертывания и белки крови, участвующие в образовании основного фермента системы свертывания - тромбина, можно разделить на несколько групп.

Факторы протромбинового комплекса (Таблица 4.Рис 1).

1.  К ним относят протромбин (фактор II), факторы свертывания крови VII(проконвертин), IX(фактор Кристмаса, антигемофильный фактор В), X (фактор Стюарта) и белки антикоагулянтной системы протеина С - протеин С, протеин S и протеин Z. Характерной особенностью этой группы служит наличие на амино(N)конце каждого белка специфической последовательности, осуществляющей связывание молекулы с фосфолипидами поверхности активированной клетки, преимущественно тромбоцита. На карбокси-(C)-конце всех факторов протромбинового комплекса, кроме протеинов S и Z, находится каталитический ( или протеазный) домен, расщепление в структуре которого одной или двух пептидных связей ведет к образованию фермента-протеиназы. Протеины S и Z служат кофакторами и не активируются в ферменты. Протеин S - кофактор активированного протеина С, а протеин Z – кофактор ингибитора фактора Xa, который именуют - ингибитором, зависимым от протеина Z(IPZ).

2.  Факторы контактной фазы свертывания( Рис1). К ним относят проферменты-факторы XII ( фактор Хагемана) и XI свертывания крови и прекалликреин (Таблица 4). Характерной особенностью белков этой группы является способность связываться с отрицательно заряженной поверхностью и образовывать ферменты-протеиназы.

3.  Кофакторы: факторы свертывания V(проакцелерин),VIII (антигемофильный фактор А, VIII:С) и высокомолекулярный кининоген (ВМК), которые характеризуются тем, что имеют высокий молекулярный вес, мультидоменную структуру и не служат предшественниками протеиназ, а выполняют роль высокомолекулярной подложки для проферментов системы свертывания крови.

4.  Разделение на группы достаточно условно, поскольку некоторые факторы могут быть отнесены к двум группам, например факторы протромбинового комплекса протеин S и протеин Z служат кофакторами протеина С и ингибитора фактора Xa – ZPI, соответствено. Фактором I свертывания крови является фибриноген – основной субстрат тромбина.

1.4  Факторы протромбинового комплекса

Структурное подобие факторов протромбинового комплекса, свидетельствует в пользу дупликации гена предшественника, его модификации в течение эволюции. Каталитические домены свертывающих протеиназ относятся к трипсиноподобным сериновым протеиназам, каталитический участок активного центра которых формируется триадой аминокислот, соответствующих Гис57, Сер195, Асп102 химотрипсина. Ферменты находятся в крови в форме проферментов, которые превращаются в активные формы вследствие протеолиза одной или двух пептидных связей. Синтез проферментов протромбинового комплекса происходит в печени и зависит от витамина К, который служит коферментом фермента - γ-глутамилкарбоксилазы. Витамин К переходит в активную форму гидрохинона после восстановления из эпоксида под действием фермента печени – редуктазы ( РИС2). Витамин К - кофермент в реакциях γ - карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты в предшественнике протромбина и в некоторых других неактивных формах факторов свертывания крови с образованием остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты. В результате соответствующие участки молекул белков-предшественников приобретают способность связывать Са+ и подвергаться активации с образованием активных факторов свертывания крови, в частности протромбина. Витамин К участвует также в γ-карбоксилировании остатков глутаминовой кислоты в некоторых Ca-связывающих белках, в частности в остекальцине.

Кумариновые препараты (например, дикумарин, варфарин и др.) блокируют действие редуктазы и синтез протромбина. Фермент печени карбоксилаза в присутствии востановленной формы витамина К катализирует карбоксилирование 10 или 12 остатков глутаминовой кислоты на N-концевом участке молекул факторов протромбинового комплекса. В результате реакции образуются так называемый Гла-домен на аминоконце факторов, содержащий остатки g-карбоксиглутаминовой кислоты (g-кГлу). Два или три остатка g-кГлу связывают один ион кальция, вызывая конформационные изменения в молекуле и экспонирование участков связывания мембран клеток. Кроме того, эти остатки прямо связываются с мембраной через кальциевые мостики. Связывание кальция крови хелаторами предотвращает ее свертывание. В присутствии антагонистов витамина К - дикумарина, варфарина и др., синтезируются аномальные белки протромбинового комплекса, которые не связываются с фосфолипидами мембраны и не активируются. На основе дикумарина создано много непрямых антикоагулянтов.

Многие белки вовлекаемые в гемостаз имеют “крингл”-домены, названные С. Магнуссоном (Дания), который расшифровал структуру этих доменов в молекуле протромбина(Рис 1). Крингл-домены содержат 80-85 аминокислотных остатков, образующих благодаря трем дисульфидным мостикам характерные триплетные петли (похожие по форме на шведские бублики - кринглы). Крингл-домены ответствечают за связывание профермента с поверхностью.

Другой домен, структурно подобный доменам эпидермального фактора роста (EGF), обнаружен у многих факторов свертывания(VII, IX, X,XII) и отвечает за связывание с поверхностью клеток.

В структуре протромбина и факторов VII, IX и X содержится пятичленная последовательность ароматических аминокислот Phe-Trp-X-X-Tyr, экспонированных наружу молекулы, которые создают гидрофобный домен, взаимодействующий с клеточными мембранами.

1.5  Факторы контактной фазы свертывания

К факторам контактной фазы свертывания относят фактор XII ( Хагемана), фактор XI, и прекалликреин, поскольку для активации этих проферментов в условиях in vitro требуется контакт с отрицательно заряженной поверхностью, на которой эти белки легко сорбируются. Для активации фактора XI и прекалликреина необходим также белковый кофактор – высокомолекулярный кининоген (ВМК).

Фактор XII – гликопротеин (Мr 78кDa), содержащий 6 доменов (Рис 1). На аминоконце молекулы фактора XII локализованы блоки типа II и типа I, структурно подобные доменам фибронектина ( FN-2 и FN-1), связывающим коллаген и фибрин, соответственно. Между этими блоками расположен домен 2, подобный домену эпидермального фактора роста(EGF).За доменом3 типа I фибронектина (FN-1) следует еще один домен EGF и далее один крингл домен(5 домен), который через связывающий участок соединен с каталитическим ( протеазным) шестым доменом, локализованным на С-конце молекулы.

Фактор XI циркулирует в кровотоке в нековалентном комплексе с высокомолекулярным кининогеном (ВМК). Молекула фактора XI – крупный гомодимер( Мr 143кDa), состоит из двух идентичных полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями (Рис ). В структуре каждой из двух цепей фактора XI обнаружены четыре домена повторяющихся последовательностей с высокой степенью гомологии и каталитический домен на С-конце молекулы. Триада каталитического центра фактора XI образована остатками His 413, Asp462 и Ser557. Все повторяющиеся домены по структуре подобны яблоку (apple - домены), содержат 6 высококонсервативных остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи, и имеют высокую степень гомологии соответствующим доменам прекалликреина. Аpple - домены повторяющихся последовательностей отвечают за связывание фактора XI с кофактором - высокомолекулярным кининогеном.

Высокомолекулярный кининоген (ВМК )- крупная молекула(120кDa), состоит из 6 доменов. На N –конце ВМК в домене1 локализован сайт связывания ионов кальция, в доменах2 и3 обнаружен консервативный мотив QVVAG, ответственный за ингибиторную активность ВМК в отношении цистеиновых протеиназ(кальпаина, катепсинов В и H, папаина). В доменах 3 и 5 локализованы сайты связывания с поверхностью клеток( тромбоцитов, эндотелиальных клеток, нейтрофилов), присутствием которых могут быть обусловлены антиадгезивные свойства ВМК. В домене 5 обнаружен участок, содержащий положительно заряженные остатки Lys, His, а также Gly, который несет ответственность за связывание с отрицательно заряженной поверхностью активированных клеток и формирование ансамбля факторов контактной фазы свертывания. В домене 4 локализована структура брадикинина, который выщепляется из ВМК калликреином и подобными ему ферментами. С-концевой домен 6 имеет протяженные участки связывания фактора XI и прекалликреина.

1.6  Кофакторы: факторы свертывания

Кофакторы - факторы V и VIII свертывания крови, крупные молекулы (Таблица 4, Рис 3), имеющие значительную гомологию структур. Оба белка содержат три разных типа доменов в последовательности А1-А2-В-А3-С1-С2. Три А домена имеют высокую степень гомологии доменам церулоплазмина. Два подобных друг другу С домена ( F5/8-C –домены) гомологичны доменам дискоидина. Большой центральный B домен называют связывающей областью, поскольку он локализован между тяжелой цепью, состоящей из двух А доменов и легкой цепью, образуемой одним А доменом и двумя С доменами. Существенные различия между факторами V и VIII обнаружены в структуре связывающей области, которая отщепляется при активации факторов и функционирует как пептид активации.

Тромбин расщепляет фактор V по остаткам Arg709, Arg1018 и Arg1545. Активированная тромбином форма фактора V - фактор Vа, гетеродимер (А1-А2/А3-С1-С2), состоит из тяжелой и легкой цепей, стабилизированных ионами Са. Фактор Vа – кофактор фактора Xa, активатора протромбина. Участки связывания протромбина, фактора Xa и протеина S, кофактора активированного протеина С (АРС), локализованы в тяжелой цепи фактора Va, а за связывание фосфолипидов мембраны клеток и АРС отвечают участки легкой цепи.

Фактор VIII секретируется как гетеродимер вследствие расщепления по крайней мере двух связей в В домене. В циркуляции белок стабилизирован фон Виллебранда фактором и имеет время полужизни около 10 часов. Тромбин гидролизует фактор VIII по остаткам Arg372, Arg740 и Arg1689, выщепляя В домен и расщепляя один из высокоаффинных участков связывания фон Виллебранда фактора. Фактор VIII превращается в фактор VIIIа, гетеротример (А1/А2/А3-С1-С2) , субъединицы которого стабилизированы ионами Са. Фактор VIIIа – эффективный кофактор фактора IXa, активатора фактора X. Инактивация фактор VIIIа происходит вследствие диссоциации двух А доменов тяжелой цепи или специфического расщепления связи между А1 и А2 доменами активированным протеином С. Фон Виллебранда фактор повышает стабильность фактора VIII и защищает его от инактивации АРС. Контроль активации фактора X является критическим событием гемостаза и тромбоза.

1.7  Субстрат свертывания - фибриноген

Фибриноген, составляющий структурную основу тромба, состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей, обозначаемых как Аa, Вb и g(Рис ). Молекула фибриногена состоит из трех модулей (доменов), выявленных электронной микроскопией. Аминоконцевые части всех трех цепей образуют центральную область взаимодействия двух субъединиц молекулы фибриногена, ковалентно связанных между собой тремя дисульфидными мостиками, так называемый, Е домен. Карбоксиконцевые (С) участки b и g цепей образуют D домены фибриногена.

Фактор XIII - фибринстабилизирующий фактор, существует в двух формах –плазменный и тромбоцитарный. Плазменный фактор XIII - тетрамер, состоящий из двух пар цепей (a и b), а тромбоцитарный содержит только a - цепи.

2  Механизм свертывания крови.

Разделение механизма свертывания крови на два пути – внутренний ( контактная фаза свертывания) и внешний существовало по крайней мере три десятилетия от начала 60-х годов XX века, когда был предложен каскадный механизм реакций образования тромбина.

2.1  Контактная фаза свертывания крови.

Контактная активация свертывания крови инициируется in vivo при воспалении, in vitro при контакте плазмы с отрицательно заряженной поверхностью.

На отрицательно заряженной поверхности происходит сборка ассамблеи факторов XII, XI и прекалликреина вместе с кофактором фактора XI и рецептором прекалликреина - высокомолекулярным кининогеном (Рис 5). Связывание фактора XII с отрицательно заряженной поверхностью изменяет конформацию молекулы и делает ее более чувствительной к активации. Фактор XII превращается в активную сериновую протеиназу, фактор XIIa, аутокаталитически или под действием другой протеиназы – калликреина. Активаторами превращения прекалликреина плазмы в калликреин могут служить ряд протеиназ: фактор XIIa ( реципроктная активация), матриксные металлопротеиназы (ММР), которые появляются в участке повреждения сосуда и воспаления из предшественников - ПроММР, а также пролилкарбоксипептидаза, фермент инактивирующий ангиотензин II и обеспечивающий взаимодействие калликреиновой и ренин-ангиотензиновой систем. Появившийся калликреин быстро расщепляет неактивный фактор XII в фактор XIIa в реакции положительной обратной связи, которая кинетически более эффективна, чем аутоактивация фактора XII. Калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген (ВМК), освобождая вазоактивный пептид - брадикинин (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), сильный вазодилататор, который повышает сосудистую проницаемость, стимулирует ноцицептивные рецепторы и вызывает сокращение ряда гладких мышц (например, подвздошной кишки).

Структурные особенности фактора XII (см. выше) свидетельствуют о его многофункциональности. Основная функция фактора XII -активация фактора XI. Фактор XI состоит из двух идентичных цепей с высокой степенью гомологии прекалликреину. Подобно прекалликреину он существует в кровотоке в комплексе с ВМК. ВМК обеспечивает связывание фактора XI c отрицательно заряженной поверхностью и способствует его активации протеиназами, фактором XIIа, XIа и тромбином, каждый их которых расщепляет в мономерах фактора XI пептидную связь Arg369-Ile370.

Фактор XI активирует фактор IX в IXa. На уровне IX фактора объединяются внутренний и внешний пути свертывания. Физиологическое значение внутненнего пути не ясно, хотя участие контактной фазы в процессах воспаления не вызывает сомнений. Показано, что недостаточность фактора XII не ведет к кровоточивости, напротив обнаружена склонность к тромбообразованию. Приобретенная недостаточность факторов контактной фазы выявлена у пациентов с новообразованиями, сепсисом, аллергическими реакциями. Пептид, брадикинин, освобождаемый из ВМК калликреином, является модулятором тонуса сосудов. Образование фактора IXa - общая стадия внутреннего и внешнего пути, согласно устаревшему представлению о механизме свертывания крови в нормальном физиологическом процессе гемостаза.

2.2  Внешний путь свертывания крови – основной механизм образования тромбина в кровотоке.

К настоящему времени доказано, что внешний путь свертывания крови, индуцируемый тканевым фактором, является основным механизмом образования тромбина в кровеносном русле (Рис 3 ). Стимулом к активации внешнего пути свертывания служит экспонирование на поверхности поврежденных клеток сосудистой стенки тканевого фактора, называемого так же тромбопластином (син. фактор III свертывания крови).

Существуют два пути образования комплекса тканевого фактора с фактором VIIa свертывания крови. Первый – прямое связывание тканевого фактора с фактором VIIa, присутствующим в кровотоке в очень низкой концентрации ( 1% фактора VII) в конформации, не позволяющей ему контактировать с плазменными факторами свертывания и активировать их. Тканевой фактор – аллостерический активатор фактора VIIa, связывает фактор, изменяет его конформацию и каталитические свойства, повышая протеолитическую активность протеиназы в отношении специфических субстратов – факторов IX и X свертывания крови в несколько тысяч раз.

Второй путь – связывание тканевым фактором фактора VII крови, последующее превращение его в активную форму ( VIIa), расщеплением одной пептидной связи Arg152-Ile153 фактором Xa и образование активной двухцепочечной молекулы фактора VIIa, субединицы которой соединены дисульфидной связью.

Тканевой фактор (CD142)– 47кДа трансмембранный гликопротеин, член суперсемейства рецепторов цитокинов класса II со значительной степенью гомологии с классом рецепторов интерферона. Тканевой фактор имеет одну полипептидную цепь, состоящую из N-концевого внеклеточного домена (219 а. о. (аминокислотных остатков)), гидрофобного трансмембранного участка (29 а. о.) и С-концевого внутриклеточного “хвоста” (21 а. о.). Внеклеточная часть молекулы тканевого фактора состоит из двух доменов, подобных доменам типа III фибронектина. Заякоревание тканевого фактора на мембране клетки существенно для связывания с высоким сродством факторов VII /VIIa, поддержки протеолитической активности фактора VIIa и инициирования свертывания крови.

Клетки, контактирующие с кровью, такие как эндотелиальные клетки, моноциты в норме не экспрессируют тканевой фактор, формируя дефицитный по тканевому фактору барьер между фактором VIIa и внесосудистыми его источниками.

Тканевой фактор конститутивно экспрессируется клетками субэндотелия, а также фибробластами и ГМК. Тканевой фактор обнаружен в адвентиции сосудов и в перицитах микрососудов мозга. На лейкоцитах и клетках эндотелия тканевой фактор экспонируется в ответ на воспалительные стимулы и повреждение клеток. Тканевой фактор может содержаться в циркулирующей крови в микрочастицах, освобождаемых при активации клеток, и в a-гранулах тромбоцитов в неактивной форме и/или в очень низкой концентрации.

Моноциты, активированные при воспалении, синтезируют тканевой фактор, которой заякорен в специализированных микродоменах, так называемых “ липидных плотах”. Эти домены служат источником микрочастиц, богатых фосфатидилсерином и тканевым фактором. Микрочастицы, транспортирующие тканевой фактор, адгезируют с активированными тромбоцитами, нейтрофилами и моноцитами, концентрируются в участке повреждения сосуда и иммобилизованный тканевой фактор стимулирует тромбообразование.

Тканевой фактор обнаружен в микрочастицах в крови больных инфарктом миокарда, антифосфолипидным синдромом, сепсисом и др.

Итак, тканевой фактор служит кофактором и рецептором сериновой протеиназы - фактора VIIa и профермента – фактора VII. Фактор VIIa в комплексе с тканевым фактором (ТФ/VIIa) запускает каскад активации проферментов в активные протеазы и активирует рецепторы PAR на фибробластах, эпителиальных и эндотелиальных и других клетках.

2.3  Образование сериновых протеаз гемостаза.

Фактор VII - зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (406 а. о.), содержит N-концевой g-карбоксиглутаминовый домен (Гла-домен), содержащий 10 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический (протеазный) домен, гомологичный трипсину и химотрипсину по аминокислотной последовательности. Доменная структура молекулы белка и организация гена фактора VII подобны таковым других витамин К зависимых факторов – IX, X, протеина С и протеина S ( Рис ).

Рентгеноструктурным анализом кристаллической структуры комплекса растворимой формы тканевого фактора (лишенной трансмембранного и цитоплазматического домена) и ингибированного по активному центру фактора VIIa показано, что фермент, связанный с мембраной через Гла-домен, имеет протяженные контакты с тканевым фактором. Тканевой фактор подобен стержню, включенному в фосфолипидные везикулы мембраны, вокруг которого “закручивается” молекула фактора VIIa. Основные участки контакта фактора VIIa с тканевым фактором локализованы в первом EGF домене и каталитическом домене, а дополнительные точки контакта – в гидрофобном стеке, Гла-домене и втором EGF домене. Благодаря такому контакту комплекс ТФ/VIIa ориентирован перпендикулярно поверхности мембраны.

Тканевой фактор изменяет локализацию и ориентацию активного центра фактора VIIa относительно мембраны: расстояние от активного центра фермента до мембраны уменьшается, что способствует эффективному расщеплению пептидных связей субстратов ( факторов X и IX ), также связанных с мембраной через Гла-домены.

Взаимодействие фактора VII с тканевым фактором является зависимым от ионов кальция(Са2+). Девять участков молекулы фактора VII участвуют в связывании Са2+ : семь сайтов в Гла-домене, один – в EGF I домене и еще один в каталитическом домене. Для высокоаффинного связывания фактора VII с тканевым фактором очень важно низкоаффинное( Kd < 1mM) связывание Са2+ с Гла-доменом.

Комплекс ТФ/VIIa связывает фактор X и превращает его в фактор Xа. В отличие от других зависимых от витамина К факторов протромбинового комплекса фактор X состоит их двух цепей, соединеных дисульфидной связью. Легкая цепь (139ао) содержит в структуре N-концевой Гла-домен с 11 остатками g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), в первом их которых локализован β-гидроксилированный Asn63 . Тяжелая цепь(306 ао), содержащая все углеводы фактора X, содержит на N-конце гликозилированный пептид активации ( 52ао) и каталитический (протеазный) домен.

ТФ/VIIa образуя тройной комплекс с фактором X (ТФ/VIIa/X) расщепляет его со скоростью в 2х107 раз большей, чем свободный фактор VIIa. Комплекс ТФ/VIIa отщепляет N- концевой пептид активации, гидролизуя одну связь Arg194-Ile195 в тяжелой цепи , что приводит к образованию каталитически активного фактора Xа( триада активного центра - His236,Asp282 и Ser379) . Молекула фактора Xа остается ассоциированной с комплексом через N - концевой Гла –домен легкой цепи.

Моделирование структуры комплекса TФ/VIIa/Xa с помощью докинга (анализа комплементарности третичных структур) и сайт-направленного мутагенеза, показало, что фактор Xа имеет протяженную конформацию, подобную структуре фактора VIIa в комплексе TФ/VIIa. Во взаимодействии с TФ/VIIa участвуют все домены фактора Xа, в том числе аминокислотные остатки Glu51 и Asn57 первого домена EGF, Asp92 и Asp95 второго EGF домена и Asp185a, Lys186, и Lys134 каталитического домена фактора Xа.

N-конец каталитического домена ориентирован таким образом, что может осуществляться как активация фактором Xа фактора VII, связанного с тканевым фактором, так и активация фактором VIIa профермента - фактора X.

Следует подчеркнуть, что комплекс ТФ/VIIa имеет чрезвычайно узкую субстратную специфичность, активируя ограниченным протеолизом только факторы X и IX.

Вначале образуется небольшое количество (пкМ) фактора Xa, который не только активирует фактор VII, связанный с тканевым фактором, но также стимулирует появление следовых (нМ) концентраций тромбина, достаточных для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va и VIIIa), а так же для активации рецептора PAR1 тромбоцитов, эндотелия и активации антикоагулянтной системы протеина С благодаря связыванию с рецептором- тромбомодулином эндотелия. Эта медленная фаза инициации свертывания (РИС 5).

Вслед за стадией инициации следует быстрая фаза распространения свертывания. Комплекс фактор TФ/VIIa активирует фактор IX в протеиназу – фактор IXа.

Фактор IX свертывания крови - зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (415 а. о.), содержит N-концевой Гла-домен, содержащий 12 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический протеазный домен( Рис ).

Отщепление пептида активации в результате последовательного гидролиза двух связей Arg145-Ala146 и Arg180-Ile181 комплексом ТФ/VIIa приводит к формированию сериновой протеиназы - фактора IXа, с триадой активного центра (His221,Asp269 и Ser365).

Фактор IXа, связанный с фосфолипидами мембраны клетки и ионами Са образует с фактором VIIIa комплекс, называемый тенназой. В структуре фактора IXа локализован мотив основных аминокислотных остатков, среди которых Arg333 играет ключевую роль в связывании фактора IXа с фактором VIIIа. Активационный комплекс тенназа превращает фактор X в протеазу – фактор Xа с каталитической эффективностью, превосходящей более чем в 105 раз эффективность одной протеиназы.

На поверхности мембраны клетки в присутствии ионов кальция фактор Xa образует комплекс с фактором Va, называемый протромбиназой. Этот комплекс, также как тенназа, в раз более активен, чем входящяя в него сериновая протеиназа - фактор Xa.

В структуре фактора Xa локализованы участки высокоаффинного связывания с фактором Va. Это прежде всего N-концевой Гла-домен легкой цепи фактора Xa, а также экспонированный на поверхность участок петли гепарин-связывающего экзосайта с кластером основных аминокислотных остатков. Мутации в структуре положительно заряженной петли фактора Xa по остаткам Arg165 ( соответствующего Arg333 в структуре фактора IXa ) и Lys 169 снижают сродство фермента к фактору Va в 4-7 раз. Это свидетельствует о ключевой роли этих основных остатков в узнавании ферментом - фактором Xa, своего кофактора, фактора Va, а фактором IXa - кофактора, фактора VIIIa.

Тромбин, который генерируется из протромбина под действием протромбиназы, усиливает свое собственное образование по механизму положительной обратной связи, активируя фактор XI в протеазу – фактор XIа, в свою очередь активирующий фактор IX.

Врожденная недостаточность фактора IX и его кофактора VIII фактора( вследствие дефектов структуры их генов ( Табл.4)) ассоциируется с гемофилиями В и А соответственно. Если бы гемостаз осуществлялся через прямую активацию фактора X комплексом тканевой фактор – факторVIIa, то участие фактора IX не было бы столь необходимым и его недостаточность не приводила бы к гемофилии. Гемофилия А, наследуемая по сцепленному с X-хромосомой типу, встречается с частотой 1,3-1,8 на 10000 мужчин, а гемофилия В ( ген фактора IX также локализован в X-хромосоме) – в 4 раза реже. Описано более 600 различных мутаций в генах факторов VIII и IX. Оба типа гемофилий - заболевания, связанные с полом. Если мужчина – гемофилик (с одной аномальной X-хромосомой) и здоровая женщина (с двумя нормальными X-хромосомами) имеют детей, то все дочери будут носителями дефектной хромосомы, а сыновья будут здоровыми. Женщины - носители гена гемофилии не имеют тенденции к кровоточивости, поскольку наследуют нормальный аллельный ген от матери, обеспечивающий 50% активности FVIII от нормы. Но если женщина –носитель гена гемофилии имеет детей от здорового мужчины, ее сыновья имеют шанс унаследовать гемофилию в 50% случаев, а дочери, так же в 50% случаев, могут быть носителями гемофилии. Около 1/3 больных гемофилией не имеют семейного происхождения заболевания. Эти спародические случаи возникают вследствие новых мутаций в Х - хромосоме, несущей гены факторов VIII и IX. Доказательством важной роли внешнего пути для осуществления свертывания крови было открытие ингибитора TFPI (ингибитора пути тканевого фактора) (Рис 5, Таблица 4). TFPI принадлежит к семейству трехглавых ингибиторов Кунитца и состоит из тандема трех доменов Кунитца (К1, К2 и К3), из которых первый (К1) ингибирует фактор VIIa, связанный с тканевым фактором, а второй (К2) – фактор Xa. Третий домен не имеет ингибиторной активности к протеазам, но в его структуре (прежде всего в положительно заряженной С–концевой последовательности молекулы TFPI) локализован участок связывания протеогликанов эндотелия, таких как синдеканы и глипиканы. TFPI специфично связывается с тромбоспондином-1 тромбоцитов.

Этот ингибитор обнаружен в плазме в относительно низкой концентрации, а также в эндотелии сосудов и тромбоцитах. Когда тканевой фактор появляется на поверхности активированных клеток, TFPI ингибирует инициирование каскада свертывания следующим механизмом. Сначала TFPI с высоким сродством связывает фактор Xa и образует с ним комплекс (через второй домен), затем связывается (через С-конец третьего домена) с отрицательно заряженными протеогликанами мембраны клеток. Повышается локальная концентрация ингибитора. Затем TFPI связывает фактор VIIa и инактивирует комплекс TФ/VIIa. Таким механизмом контролируется и ограничивается образование фактора Xa. Поэтому для появления эффективных концентраций фактора Xa в условиях in vivo ( достаточных для генерации относительно высоких концентраций тромбина и свертывания фибриногена) необходима генерация наряду с комплексом фактор VIIа - тканевой фактор также комплекса фактора IXa с фактором VIIIa.

TFPI блокирует способность TФ/VIIa активировать фактор X и клетки через рецепторы, активируемые протеиназами.

Тройной комплекс ТФ/VIIa/X активирует PAR 1 и 2 на клетках. Присоединение фактор Xа к комплексу TФ/VIIa повышает в 5 раз интенсивность клеточного ответа по сравнению с действием одного фактора Xа (см. глава 5). Тканевой фактор активирует клетки протеолитическим механизмом, зависимым от фактора VIIa свертывания крови, в котором тканевый фактор работает как кофактор и модулятор фактора VIIa. Связывание фактора VIIа с тканевым фактором стимулирует передачу запуск внутриклеточной сигнализации, приводя к повышению внутриклеточного Ca2+ , фосфорилированию активируемых митогеном протеинкиназ, транскрипционных факторов и, в конечном счете, к синтезу и экспонированию адгезивных белков, ответственных за адгезию и миграцию клеток.

Итак, процесс свертывания поддерживается активацией фактора IX. Факторы IXa и Xa проявляют свою активность при ассоциации с неферментативными кофакторами-факторами VIIIa и Va, соответственно (Таблица 4). Факторы V и VIII - большие гликопротеиды, которые активируются протеолизом определенных связей фактором Xa или тромбином. Активные кофакторы - Va и VIIIa, состоят из субединиц, стабилизированных Са2+ , и связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, протеиназами - факторами Xa и IXa, и субстратами этих ферментов – протромбином и фактором X.

Протромбиназный комплекс (факторы Ха, Va, Са2+и фосфолипиды мембран) превращает протромбин в тромбин. В стехиометрическом комплексе фермента - фактора Xa и кофактора - Va происходят конформационные изменения в активном центре фактора Xа, облегчая взаимодействие фермента с субстратом-протромбином. Протромбин, связываясь с фактором Va и Xa, также претерпевает изменения, обеспечивающие эффективное взаимодействие между ферментом-фактором Xa и субстратом. Скорость реакции возрастает более чем на 5 порядков. Это увеличение происходит как за счет повышения сродства фермента к субстрату (снижения каталитической константы- Km) , так и за счет повышения скорости реакции (возрастания каталитической константы-kcat).

2.4  Особенности активации протромбина.

Активация протромбина в тромбин – ключевая реакция системы свертывания крови, имеет ряд особенностей, отличающих этот процесс от активации проферментов других сериновых протеиназ.

Превращение протромбина в тромбин сопровождается отщеплением половины молекулы, тогда как активация других факторов свертывания ведет к освобождению только активационных пептидов. При образовании тромбина происходят значительные изменения пространственной структуры молекулы. В отличие от других факторов протромбинового комплекса, которые после превращения в фермент остаются связанными с поверхностью мембраны клетки через Гла-домен, тромбин не имеет в структуре этого домена и освобождается после активации. В структуре тромбина формируется новый центр связывания с рецепторами мембраны клетки.

В протромбине выделяют три домена: N-концевой фрагмент 1, фрагмент 2 и каталитический домен - претромбина 2, предшественник тромбина( рис ). Фрагмент 1 протромбина отвечает за связывание ионов кальция и фосфолипидов. Фрагмент 2 обеспечивает связывание профермента с кофактором фактора Xa - фактором Va.

Ограниченный протеолиз протромбина протромбиназой осуществляется в несколько стадий (Рис 6).

На первой стадии фактор Xa протромбиназы расщепляет одну пептидную связь Arg320-Ile321 в структуре каталитического домена протромбина - претромбине 2. 12Образуется первый промежуточный продукт - мейзотромбин, в котором две части молекулы протромбина соединены дисульфидной связью. Мейзотромбин остается связанным с поверхностью и обладает очень низкой ферментативной активностью, достаточной для активации протеина С. Однако мейзотромбин не проявляет прокоагулянтную активность тромбина и не инактивируется антитромбином III. Вместе с тем мейзотромбин проявляет вазоконстрикторную активность.

На следующей стадии фактор Xa в гидролизует еще одну связь ( Arg271-Tre272) в структуре мейзотромбина между фрагментом 2 и претромбином 2, отщепляя фрагмент 1 + 2 и освобождая тромбин.

Тромбин состоит из двух цепей ( А-легкой и В –тяжелой) соединенных дисульфидной связью. В структуре тяжелой цепи локализован каталитический центр и участки связывания субстрата.

В структуре протромбина тромбин может специфически расщеплять связь Arg155 – Ser 156, освобождая фрагменты 1 и 2 протромбина. Однако эта реакция требует достаточно высоких концентраций фермента, которые не возникают при физиологической активации протромбина в условиях in vivo.

Тромбин - первый фермент в каскаде свертывания, который освобождается в окружающую среду. В структурах всех других ферментов - активных форм факторов свертывания крови, сохраняются участки связывания с поверхностью.

3  Функции протеиназ системы свертывания крови

3.1  Тромбин: структура и свойства.

Тромбин-протеолитический фермент, относится, как и все ферменты свертывающей системы крови (кроме фактора XIIIa), к группе пептид-гидролаз, подгруппе протеиназ, классу сериновых протеиназ семейства трипсина.

Тромбин – гликопротеид(40kDa), содержащий ок 5% углеводов. Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей( А и Б), соединенных дисульфидной связью. А-цепь тромбина быка содержит 49 ао, а у тромбина человека она укорочена на 13 ао с N-конца молекулы. Б-цепи обоих тромбинов почти идентичны и состоят из 259 остатков. Структура Б-цепи тромбина поддерживется тремя дисульфидными связями. Выявлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности тромбина и родственных протиназ – трипсина и химотрипсина в тех частях молекулы, где локализованы аминокислоты триады каталитического участка активного центра – Гис 43, Асп 99 и Сер 205, образующие систему переноса заряда. Активность тромбина, как и других сериновых протеиназ, подавляется диизопропилфторфосфатом (ДФФ) и тозиллизилхлорметилкетоном, избирательно блокирующими серин и гистидин активного центра. Высокоспецифическим экзогенным ингибитором тромбина является гирудин (7kDa)– полипептид из секрета слюнных желез медицинской пиявки( Hirudo medicinalis), который в пикомолярной концентрации блокирует протеолитическую активность фермента, связываясь с молекулой тромбина вне каталитического участка активного центра в области экзосайта центра узнавания специфических субстратов и рецепторов : анионсвязывающего экзосайта 1. Природным ингибитором тромбина является антитромбин III( cм глава 4).

Тромбин и трипсин имеют одинаковую первичную специфичность: они расщепляют эфирные, амидные и пептидные связи основных аминокислот– аргинина и лизина. Но тромбину в отличие от трипсина свойственна избирательность при отборе субстратов. Он не гидролизует обычные субстраты протеиназ такие, как казеин, гемоглобин, альбумин, а проявляет специфичность высшего порядка в выборе субстратов и гидролизуемых связей. В отличие от трипсина тромбин-узкоспецифичная протеиназа, тк расщепляет только одну или несколько связей в своих субстратах.

Высокая специфичность тромбина впервые продемонстрирована на примере его основного субстрата фибриногена, у которого тромбин гидролизует только четыре аргинил(Арг)-глициновые(Гли) связи из 387 доступных трипсину. Катализ образования фибриновых сгустков - наиболее известная и лучше других изученная биологическая функция тромбина.

3.2  Превращение фибриногена в фибрин

Фибриноген-крупная молекула состоит из трех пар полипептидных цепей-А альфа, В бета, гамма, объединенных в три домена DED. Тромбин гидролизует Арг-Гли связи сначала в А альфа цепях, а затем в В бета цепях, так что от каждой молекулы фибриногена сначала отщепляются два небольших фибринопептида А, а затем два фибринопептида В. Образуется фибрин-мономер, который имеет тенденцию к спонтанной полимеризации в большие мультимолекулярные аггрегаты. Эта тенденция возникает вследствие экспозиции центров сборки на амино(N)конце E домена, комплементарных центрам сборки, которые всегда присутствуют в домене D. Сборка начинается с латерального соединения мономеров фибрина со смещением на 1/2 длины молекулы. Образуется первичный димер - протофибрилла, мономеры в которой соединены конец к середине. Далее происходит самосборка протофибрилл, образование пучков волокон и стабилизация с помощью изопептидных (ковалентных) связей между боковыми цепями остатков глутаминовой кислоты (Глу ) и лизина (Лиз ) смежных гамма цепей молекул. Эту реакцию катализирует фактор XIII свертывания крови - фибринстабилизирующий фактор или Са-зависимая трансгутаминаза. Он циркулирует в крови в форме предшественника, активируемого тромбином или фактором Xa. Тромбин расщепляет сначала a - цепи и освобождает активационный пептид, а затем тетрамер фактора XIII распадается с образованием активной формы, состоящей из двух a’- цепей.

3.3  Полифункциональность тромбина

Тромбин-полифункциональный фермент и его высокая избирательность действия проявляется и в других его физиологических функциях. Тромбин участвует в регуляции процессов, направленных как на ускорение свертывания крови так и на его торможение(Рис 7).Регулируя процессы положительной обратной связи тромбин активирует факторыV, VIII, XI и XIII свертывания крови, стимулирует экспрессию тканевого фактора, адгезивных белков на поверхности поврежденного эндотелия и моноцитов, адгезию к эндотелию клеток крови, индуцирует агрегацию тромбоцитов. Регулируя процессы отрицательной обратной связи тромбин взаимодействует с тромбомодулином эндотелия и активирует протеин С, который ограничивает образование тромбина инактивируя факторы Va и VIIIa. Связанный с тромбомодулином тромбин блокирует фибринолиз, поскольку активирует ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином ( TAFI) в TAFIa - карбоксипептидазу, которая отщепляет карбоксиконцевые остатки лизина и аргинина от молекул фибрина, тем самым лишая его возможности связывать плазминоген-профермент плазмина. Плазминоген не способен к иммобилизации на дефектном фибрине и не образует плазмин - фермент расщепляющий фибрин.

Вместе с тем, тромбин стимулирует освобождение из эндотелия сосудов ингибитора агрегации-простациклина, тканевого активатора плазминогена и его ингибитора. Тромбин запускает реакцию активации противосвертывающих механизмов, стимулируя усиление секреции антикоагулянта гепарина тучными клетками. Тромбин - вовлекается в реализацию ряда физиологических и патофизиологических процессов, таких как регуляция сосудистого тонуса, заживления ран, имунного ответа, процессов воспаления, атерогенеза, развитие новообразований, болезни Альцгеймера, и др. Эти реакции обусловлены рецептор-опосредованной активацией тромбином клеток крови, соединительной и нервной тканей: кровяных пластинок, моноцитов, полиморфноядерных лейкоцитов, фибробластов, клеток эндотелия, гладкомышечных, нервных, тучных и многих других. Тромбин вызывает экспрессию на поверхности поврежденного эндотелия факторов роста, адгезивных белков, прежде всего фактора фон Виллебранда и селектинов Р и Е, которые отвечают за прикрепление клеток крови к эндотелию. Тромбин включается в процессы миграции клеток, агрегации, пролиферации и изменяет проницаемость эпителиального слоя. Тромбин играет роль дирижера клеточных ответов.

Высокая специфичность тромбина в отношении рецепторов клеток обеспечивается существованием в структуре молекулы тромбина участков, так называемых экзосайтов центра узнавания: анионсвязывающих экзосайтов 1(АВЕ1) ( называемого также центром узнавания субстратов и рецепторов)и экзосайта 2. Экзосайты локализованы вне активного центра на поверхности молекулы. Анионсвязывающий экзосайт 1 отвечает за взаимодействие тромбина с рецепторами клеток (тромбомодулином эндотелия, рецептором, расщепляемым протеазами(PAR)) и комплементарными участками специфических субстратов( фибриногена, фактора VIII). Анионсвязывающий экзосайт 2 обеспечивает связывание тромбина с гепарином.

Каталитический центр тромбина и связывание лигандов АВЕ1 аллостерически регулируется при связывании ионов Na. C помощью рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза выявлены конформационные изменения, происходящие в молекуле тромбина при связывании иона Na, которые приводят к повышению скорости расщепления фибриногена и других прокоагулянтных специфических субстратов и рецепторов (Рис ). Идентифицированы два участка связывания Na+. Структурный переход молекулы тромбина при связывании Nа+ вызывает аллостерическое конформационное изменение молекулы от «медленной» (свободной от Na+) формы к «быстрой» (cвязанной с Na+). При физиологических условиях (145 мМ NaCl) существуют обе формы. Быстрая форма тромбина связывает фибриноген с более высоким сродством и гидролизует его с более высокой скорость (kcat/Km) ю, чем медленная. В то же время медленная форма тромбина более специфично активирует антикоагулянт - протеин С. Точечная замена Trp60D в молекуле тромбина вызывала снижение связывания Na+ и сдвиг в медленную форму, что приводило к повышению антикоагулянтной активности тромбина. Таким образом, аллостерические изменения конформации молекулы тромбина могут определять его прокоагулянтные или антикоагулянтные функции.

Тромбин и другие протеиназы активируют клетки через новое семейство рецепторов, называемых - протеазой активируемые рецепторы-PAR.

3.4  Рецепторы сериновых протеиназ гемостаза

Тромбин отщепляет от PAR N-концевой пептид и освобождает новый N-концевой пептид, так называемый “привязанный” лиганд, который активирует рецептор. Синтетические пептиды-аналоги этого лиганда действуют подобно тромбину при активации клеток.

Тромбин активирует три представителя рецепторов PAR - PAR1, PAR3 и PAR4., которые широко экспрессируются в разных клетках.

Факторы VIIa-TF и Xa сверывания крови, также как трипсин, триптаза тучных клеток и ряд других неспецифических протеиназ активируют PAR2 (Таблица 5). Кроме того, Фактор Xa в высоких концентрациях может активировать PAR1.

Таблица 5 Рецепторы сериновых протеиназ системы гемостаза и их рецепторы в системе гемостаза

Протеиназа	Рецептор	Функция
Фактор VII/VIIa	Тканевой фактор(ТФ) (эндотелий, моноциты) PAR2(эндотелий и др)	Инициирование свертывания крови (образование фXa), активация клеток
Фактор Xa	EPR1 (эндотелий и др)	Генерация тромбина, независимая от фVa, активация клеток
Фактор Xa	MAC-1 (моноциты)	Генерация ф Xa, независимая от ТФ
Фактор Xa	PAR2(эндотелий и др) PAR1	Активация клеток
Тромбин	PAR1/3/4(тромбоциты, эндотелий и др)	Активация клеток
Тромбин	Тромбомодулин (эндотелий) GPIb/IX/V	Активация системы Протеина С, ингибирование тромбина, активация TAFI Ускорение свертывания крови на тромбоцитах, Кофактор PAR-1
APC	EPCR, PAR1	Кооперация с ТМ, Ингибирование воспаления
Протеин S	Рецептор тирозинкиназ (Tyro 3), аннексин II	Активация клеток

Существует несколько механизмов передачи сигнала тромбина в клетку через PAR-1.

Один - традиционный (например, в тромбоцитах)–фосфоинозитидный путь с образованием вторичных мессенджеров-IP3 и DAG, активацией сократительного аппарата клетки, секрецией гранул, экспозицией на поверхность интегрина aIIВ b3 и агрегацией клеток.

Другой – через активацию тирозин-киназ МАР-киназного пути (например в клетках эндотелия), образование протеин киназ, регулируемых внеклеточным сигналом(ERK) и активацию транскрипционного фактора NFkB.

NFkB находится в цитозоле клетки в комплексе с ингибитором IkB, стабилизирующим комплекс. Фосфорилирование IkB с помощью IkB киназы приводит к его деградации протеосомами. Освободившийся из комплекса NFkB транслоцируется в ядро. В ядре NFkB связывается с регуляторными участками промоторов ряда генов и регулирует экспрессию адгезивных белков - Р и Е селектинов, ICAM(внутриклеточной адгезивной молекулы), VCAM-1 (адгезивная молекулы сосудистых клеток), MCP-1(хемоаттрактантного белка 1 моноцитов), а также экспрессию тканевого фактора, факторов роста и и цитокинов. Активируя NFkB тромбин стимулирует процессы воспаления, свертывания крови и репарации ткани. Факторы свертывания крови, которые активируют PAR2, также могут стимулировать эти процессы, но тонкие механизмы активации клеток, участвующих в процессах воспаления, свертывания крови и репарации ткани не выяснены.

4  Подписи к рисункам в главе 2

Рис 1. Прокоагулянтные факторы системы свертывания крови. Факторы протромбинового комплекса(I) и факторы контактной фазы(II). Домены(I), начиная с NH2 конца молекул: сигнальный пептид, пропептид (оба отщепляются в процессе синтеза), Гла-домен (NH2 конц зрелой молекулы), крингл-домены (протромбин), домены EGF ( предшественника эпидермального фактора роста) и каталитический домен на COOH-конце молекулы. Домены(II), начиная с NH2 конца молекул: фактора XI и прекалликреина - сигнальный пептид ( отщепляется в процессе синтеза), домены повторяющихся последовательностей (NH2 конц зрелой молекулы) и каталитический домен на COOH-конце; фактора XII - сигнальный пептид, домены, подобные доменам типа I (FN-1) (NH2 конц зрелой молекулы) и типа II( FN-2) фибронектина, крингл-домен и каталитический домен на COOH-конце молекулы. Стрелки к каталитическим доменам указывают участки пептидных связей, расщепляемых протеиназами.

РИС2 Цикл витамина К и его функция как кофактора γ-глутамилкарбоксилазы.

γ-Глутамилкарбоксилаза карбоксилирует остатки глутаминовой кислоты (Glu) витамин К-зависимых факторов свертывания крови (прокоагулянтных факторов VII, IX, X, протромбина и антикоагулянтных факторов – протеина С и протеина S) в присутствии активной формы витамина К гидрохинона ( Витамин КН2). Витамин К –редуктаза, устойчивая к варфарину восстанавливает Витамин К1 в активную форму – Витамин КН2 . Затем витамин КН2 окисляется в витамин К эпоксид (Витамин КО)в реакции сопряженной с карбоксилированием остатков глутаминовой кислоты факторов свертывания крови. Витамин К-зависимые факторы свертывания крови функционально активны после карбоксилирования. Витамин КО (эпоксид) затем восстановливается в витамин К1 в реакции, катализируемой витамин КО редуктазой.

Варфарин, ингибируя витамин КО редуктазу, блокирует образование витамина К1 и витамина КН2, необходимых для карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты в факторах свертывания крови. Действие варфарина может быть заблокировано витамином К1 , поступающим с пищей или данным как лекарство.