Изучение роли активированных кислородных метаболитов в иммунном ответе насекомых методом ЭПР-спиновых ловушек

Изучение роли активированных кислородных метаболитов в иммунном ответе насекомых методом ЭПР-спиновых ловушек.

Общая формулировка проблемы. В настоящее время уже не вызывает сомнений тот факт, что процессы с участием активированных кислородных метаболитов (АКМ), таких как супероксидный радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, семихинонные радикалы, оксид азота, пероксинитрит, играют жизненно важную роль в организмах. Так, у млекопитающих происходит повышенная генерация АКМ в результате иммунного ответа - сложной реакции организма, вызванной проникновением чужеродного объекта и направленной на его уничтожение. Образующиеся при этом АКМ являются цитотоксическими молекулами против клеток чужеродного организма. Однако до сих пор не существовало достоверных доказательств образования этих частиц в организме насекомых. Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы. Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием АКМ (Рис. 1). Сложность исследования состоит в том, что все АКМ являются высокореакционными, а поэтому короткоживущими.

Формулировка конкретной задачи. Регистрация методом ЭПР образования в гемолимфе насекомых короткоживущих радикальных интермедиатов процесса меланизации.

Авторы исследования, лаборатория. , , в сотрудничестве с и его сотр. (Институт систематики и экологии животных СО РАН). Лаборатория ХФСР (зав. лаб. ).

Используемый подход. Одним из наиболее перспективных подходов к исследованию свободнорадикальных процессов с участием короткоживущих радикалов является метод спиновых ловушек. Метод основан на реакции спиновой ловушки с радикалами, при этом образуется и накапливается относительно стабильный парамагнитный продукт, который можно регистрировать с помощью ЭПР спектроскопии (Рис. 2Б, 2В). Для регистрации орто-семихинонов использовали метод спиновой стабилизации ионами дивалентных металлов (Рис. 2А).

Полученные результаты. В работе впервые было показано, что первый этап процесса меланизации - окисление дигидроксифенилаланина (ДОФА) - у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. Образование ДОФА-семихинонового радикала происходит в результате взаимодействия между ДОФА и супероксидным радикалом. Определена константа скорости этого взаимодействия, k = (3.4 ± 0.6)*105 M-1c-1. Изучена роль ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.

Показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, что приводит к образованию высокотоксичного гидроксильного радикала. На основании полученных результатов был предложен механизм уникального, направленного на патогенный организм, цитотоксического действия, согласно которому частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала при иммунном ответе насекомых, могут являться такие интермедиаты процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.

Подробно изложено в статьях:

- D. A. Komarov, I. A. Slepneva, V. V. Glupov, V. V. Khramtsov. Detection of free radicals formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy. Applied Magnetic Resonance, 28, 411-419, 2005.

- , , Глупов супероксидного радикала и перекиси водорода в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа. Доклады академии наук, 411, 420-423, 2006.

- D. A. Komarov, A. D. Ryazanova, I. A. Slepneva, V. V. Khramtsov, I. M. Dubovskiy and V. V. Glupov. Pathogen-targeted hydroxyl radical generation during melanization in insect hemolymph: EPR study of a probable cytotoxicity mechanism. Applied Magnetic Resonance, 35(4), 495-501, 2009.

Рис. 1. Образование АКМ в процессе меланизации.

Рис. 2. Регистрация методом ЭПР короткоживущих радикальных интермедиатов процесса меланизации.