Экологические аспекты трансформации ферментного пула почвы при нефтяном загрязнении и рекультивации (стр. 5 )

Рис. 5. Влияние нефтепродуктов разной степени конденсированности на активность пероксидазы через трое суток после загрязнения. 1 - бензин, 2 - дистиллят газойлевой фракции, 3 - гудрон, 4 - крекинг - остаток, 5 - асфальтит.

При загрязнении нефтью в почву попадали фенольные компоненты, которые косвенно, че­рез образование хинонов и других окисленных продуктов, вызывали в почве

окис­ление ряда веществ, в том числе и аскорбиновой кислоты. Окисление ее может проходить и при участии аскорбатоксидазы, активность которой возрастала пропорциональ­но увеличению концентрации нефти. С увеличе­нием срока инкубации активность фермента повышалась и оставалась достоверно выше контрольного варианта (рис.6). Между интенсивностью выделения СО2 и аскорбатоксидазной активностью существует тесная корреляция (r = 0,67-0,88; p≤0,05), подтверждающая взаимосвязь этих процессов, что является косвенным свидетельством ее участия в процессах биотрансформации углево­дородов.

Рис. 6. Активность аскорбатоксидазы в серой лесной почве, загрязненной различными концентрациями нефти. 1 – незагрязненная почва, 2 – 8 л/м2, 3 – 16 л/м2, 4 – 25 л/м2.

С окислительно-восстано­вительными процессами в почве, происходящими при участии каталазы и дегидрогеназ, связан распад нефтяных углеводородов (Skujins, 1978; Margesin et al., 2000). Активность этих ферментов в опытах на серой лесной и темно-серой лесной почвах через 3 сут. после загрязнения нефтью была достоверно ниже по сравнению с активностью незагрязненного ва­рианта. Интенсифика­ция активности дегидрогеназы в темно-серой лес­ной почве в варианте с максимальным загрязне­нием на второй и третий год после внесения нефти, а в серой лесной почве - только на третий год, может служить одним из показателей боль­шей способности темно-серой лесной почвы к восстановлению при загрязнении высокими доза­ми нефти по сравнению с серой лесной. Через десять лет при высоких концентрациях нефти актив­ность каталазы возрастала почти в два раза по сравнению с активностью незагрязненной почвы, а дегидрогеназы - в 1,8 раза. Активность этих ферментов тесно связана с общей численностью ми­кроорганизмов: соответственно для каталазы (через три дня после загрязнения r = 0,68; через год - r = 0,40; через два - r = 0,63; через три - r = 0,61), для дегидрогеназы (r = 0,67; r = 0,70; r = 0,69; r = 0,48; p≤0,05).

Сырая нефть в оптимальных и полевых условиях (табл. 10) снижала активность каталазы так же, как и товарная (обессоленная и обезвоженная) на протяжении всего срока обследования, но не оказывала существенного влияния на процессы анаэробного дегидрирования.

Таблица 10

Активность каталазы и дегидрогеназы в серой лесной почве, загрязненной сырой нефтью (лабора­торный и полевой опыт)

Варианты	Каталаза, мл О2	Дегидрогеназа, мг формазана
	1	2	3	1	2	3
Почва (контроль лабор. опыт)	5,8	5,5	4,4	2,9	2,6	2,0
Почва + нефть	2,9	1,7	1,8	6,1	2,2	0,8
Почва (контроль полевой опыт)	4,5	6,9	7,5	3,5	2,4	2,9
Почва + нефть	2,3	3,0	3,7	3,6	3,0	2,7
НСР 0,95	1,1	0,5	0,1	0,6	0,6	0,2

Примечание: лабораторный опыт 1 – 1 мес., 2 – 3 мес., 3 – 1 год; полевой опыт: 1 -1 год, 2 – 2 года, 3 – 3 года.

Из фракций нефти ЛГК являлся наиболее токсичной для этих ферментов. Уже через три дня с ростом концентрации ингибирующее действие усиливалось. ЭМ и ЭМ + Г в концентрации 0,5% оказывали стимулирующее действие на активность окислительно-восстано­вительных ферментов, что может явиться кос­венным доказательством их участия в биодегра­дации данной группы углеводородов. ЛГК вследствие своей большей летучести уже че­рез три месяца становился менее токсичным. Во всех вари­антах опыта по истечении одного года активность дегидрогеназы снижалась в сравнении с ее активностью в незагрязненной почве.

Внесение в серую лес­ную почву отдельных углеводородов (н-гексадекана, циклогексана, бенз(а)пирена) в различных концентрациях показало, что циклогексан и н-гексадекан стимулировали активность этих фермен­тов, а бенз(а)пирен ингибировал активность каталазы и дегидрогеназы.

Таким образом, окислительно-восстановительные реакции, протекающие с участием оксидоредуктаз интенсивнее в почвах с большей буферной емкостью. Через десять лет активность данной группы ферментов возрастала. Нефтяные фракции в силу различного углеводородного состава по-разному влияли на изученные ферменты. Нефтяное загрязнение повышало активность аскорбатоксидазы пропорционально концентрации загрязнителя.

В главе 9 «Активность липазы в нефтезагрязненных почвах» приведены результаты изучения липазной активности в нефтезагрязненных почвах. Исследования показали, что через три дня после за­грязнения серой лесной почвы происходило снижение активности липазы пропорционально дозе загрязнителя (табл.11).

Таблица 11

Концентрация нефти, г/100г почвы	Активность липазы, мл 0,05 N КОН	Остаточная нефть, г/100г
1	2	3	4	2	3	4
0	9,68	10,11	9,76	10,76	-	-	-
5,67	8,29	11,25	11,89	12,89	4,75	4,12	0,65
7,32	7,92	10,10	12,34	13,45	6,31	5,23	1,82
9,65	7,22	10,38	11,43	13,25	8,45	7,43	2,63
10,11	6,38	8,31	7,98	10,55	9,11	8,34	3,42
НСР 0,95	0,9	1,2	1,0	1,0	0,6	0,8	0,8

Активность липазы и содержание остаточной нефти в серой лесной нефтезагрязненной почве (полевой опыт)

Примечание: 1 - через 3 сут.; 2 - через 6 мес.: 3 - через год.;4- через 2 года.

По-видимому, первоначаль­ный ингибирующий эффект связан с воздействием наиболее токсичных легких фракций. В полевых условиях при воздействии низких концентраций загряз­нителя активность фермента повышалась и через год превосходила значения контрольного варианта опыта, что, в первую очередь, связано с улетучиванием наиболее токсичных фракций. Высокие дозы поллютанта (10,11 г /100 г почвы) ингибировали актив­ность фермента в течение длительного периода. Через год этот показа­тель приближался до контрольных значений, но не достигал их. Через два года липазная активность повышалась превосходя контрольный уровень (табл.11). Это связано с накоплени­ем не разлагающихся и малоактивных биологических веществ, которые возни­кали в процессе биодеградации (Allard, Nelson, 1997), в частности, остаточных ком­понентов нефти. Установлено, что по мере увеличения давности загрязнения почв нефтью выход липидов, в состав которых входят высокомолекулярные нелетучие углеводороды, возрастает. (Пиковский, 1993; Амосова, Бочарникова, 1994; Бочарникова, Амосова, 1997).

Повышение интенсивности процессов липолиза связано и с тем, что в деградации липидов участвуют ферментные системы очень похожие на системы биодеградации нефти (Margesin et al., 1999) Численность углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) в лабораторных условиях в загрязненной нефтью серой лесной почве значительно увеличивалась уже через 3 суток после постановки опыта. Через год в полевых условиях и 1 -3 месяцев в лаборатор­ных численность УОМ на несколько порядков превосходила уровень фоновой почвы. Содержание нефти в почве уменьшалось. К 6 месяцу убыль нефти составила 9,9% - выявлена обратная зависимость численности УОМ с содержанием остаточной нефти в почве (r = - 0,,96), при Р≤0,05).

Непосредственно после загрязнения почвы наиболее ток­сичными в отношении липолитических ферментов являлись легкие фракции нефти (бензин, дизельное топливо), содержащие значительное количество ле­тучих токсичных углеводородов, которые в наибольшей степени ингибировали про­цессы липолиза в серой лесной почве, независимо от их дозы. Известно, что летучие компоненты нефти ингибируют нефтеокисляющую активность микроорганизмов (Atlas, Bartha, 1992). Токсический эф­фект моторного масла менее выражен. Асфальтит - тяжелая фрак­ция нефти, первоначально также обладала ингибирующим эффектом, вероятно за счет создания анаэробных условий. При длительной инкубации почвы с нефтепродуктами и нефтью наблюдалось значи­тельное повышение липолитической активности.

Таким образом, активность липазы в нефтезагрязненной серой лесной почве возрастала и коррелировала с увеличением чис­ленности УОМ, с уменьшением содержания остаточных компонентов нефти в почве.

В главе 10 «Биологическая активность рекультивируемых почв» рассмотрено влияние различных приемов рекультивации на восстановление активности ферментов, участвующих в углеводном, серном, азотном, фосфорном обменах, и окислительно-восстановительные процессы.

10.1. Влияние минеральных, органических удобрений и их сочетаний на биологическую активность почв, загрязненных нефтью

Проведенные исследования показали, что внесе­ние полного минерального удобрения (NPK) неэффективно в интен­сификации биохимической активности и численности изучаемых групп микроорганизмов нефтезагрязненной почвы (табл.12). Компостирование загрязненной нефтью почвы с органо-минеральным комплексом и навозом (при высоких дозах его внесения) ведет к достоверному повышению активности каталазы, дегидрогеназы, инвертазы и уреазы (на протяжении первых трех месяцев), численности бактерий на МПА, актиномицетов, целлюлозоразрушащих аэробов, грибов, нитрификаторов. Интенсификация биологической активности усиливала процессы биодеградации загрязнителя. Если принять первоначальную дозу загрязнения 9,6г/ 100г почвы за 100%, то через месяц после постановки опыта в неудобренном варианте почвы разложилось 16,2 %, через три месяца -22,8 %, а через год - 38,3 % нефти. Внесение двой­ной дозы удобрений вело к росту

Таблица 12

Влияние органических и минеральных удобрений на ферментативную активность и урожай сельскохозяйственных культур на серой лесной почве, загрязненной сырой нефтью

Варианты	Каталаза, мл О2	Дегидрогеназа, мг формазана	Инвертаза, мг глюкозы	Уреаза, мг NН3	Урожай ц/га
1	2	3	1	2	3	1	2.	3	1	2	3	1 ячмень	2 горохо-ячменная смесь	3 ячмень
Незагрязненная почва	4,5	6,9	7,5	0,3	0,3	0,2	3,5	2,4	2,9	20,1	14,8	16,0	23,8	28,0	16,6
Загрязненная почва – К	2,3	3,0	3,7	1,1	0,6	0,9	3,6	3,0	2,7	12,0	8,3	9,7	2,0	6,6	4,7
К +N60Р90К90 – 1раз	2,9	2,6	3,1	0,9	0,9	0,4	3,7	2,7	2,3	12,8	8,8	9,9	2,4	10,0	5,5
К +N60Р90К90 – ежегодно	-	4,3	5,2	-	0,6	0,5	-	2,7	2,4	-	9,3	10,5	-	27,9	7,3
K + N120P180K180 – 1 раз	2,9	2,7	4,1	1,0	0,8	0,7	4,2	2,6	2,1	12,3	12,0	8,9	5,9	17,8	10,0
K + N120P180K180 - ежегодно	-	3,0	3,6	-	0,8	0,7	-	2,5	2,4	-	11,1	13,3	-	47,5	15,4
K + N60P90K90 + 70т / га навоза - 1 раз	3,1	3,4	4,8	1,3	0,7	0,8	4,7	3,4	2,3	13,9	11,0	12,1	4,9	49,5	9,1
K + N60P90K90 + 70т / га навоза - ежегодно	-	5,6	5,0	-	1,1	0,9	-	5,0	3,2	-	13,9	14,3	-	56,7	14,0
K + N120P180K180+ 140т / га навоза – 1 раз	4,6	6,2	6,2	1,6	0,9	1,1	5,9	4,6	4,0	15,1	13,0	12,8	10,4	47,0	10,4
K +N120P180K180+ 140т /га навоза – ежегодно	-	4,1	5,7	-	1,1	2,1	-	5,2	3,9	-	13,5	13,8	-	54,0	17,4
K + 70т / га навоза -1 раз	3,6	5,0	4,9	1,1	0,8	0,8	4,8	3,9	2,2	13,1	11,8	10,8	5,0	29,8	6,3
K + 70т / га навоза - ежегодно	-	5,7	4,6	-	1,5	1,3	-	3,6	3,9	-	11,7	10,5	-	44,0	9,0
K + 140т / га навоза – 1 раз	4,1	5,4	5,5	1,3	0,9	0,8	6,4	4,6	4,4	13,4	10,9	12,3	7,7	47,0	10,0
K + 140т / га навоза - ежегодно	-	5,4	4,2	-	1,1	1,4	-	4,3	3,8	-	11,4	12,0	-	49,5	10,3
НСР 0,95		1,2	0,8	0,3	0,6	0,2	0,2	1,2	1,3	4,0	3,4	1,5	2,3	15,37	1,2

биогенности почвы и снижению содержания нефти в большей степени, чем внесе­ние одинарной дозы, что наблюдалось и в полевых опытах (табл.12). Это связано с созданием более благоприятных ус­ловий для роста и развития микроорганизмов. Минеральные удобрения менее эффективны в ускорении процессов деградация нефти в почве, чем органические и органо-минеральный комплекс. Так, в лабораторных условиях при внесении NPK за год раз­лагалось от 39,4 до 42, 8 % нефти, а при компостировании с наво­зом, комплексом NPK + навоз соответственно 42,2 и 46,3 %, и про­цессы минерализации углеводородов в этих вариантах протекали с большей интенсивностью. В полевых условиях в почве разложилось 46 % нефти, то есть на 7,7 % больше, чем в лабораторных, а через два года процент разложившейся нефти составил 56,3%. Следовательно, в деградации нефти наряду с биологичес­ким фактором существенная роль принадлежит в полевых условиях, в отличие от лабораторных, и физико-химическим (температура, солнечная энергия). С течением времени процесс разложения нефти затормаживался. В удобренных почвах процесс очищения шел быстрее, чем в неудоб­ренных в первые два года, затем усиливалась интенсивность био­разложения в неудобренной почве.