Изучение химического состава и разработка способов идентификации перца опьяняющего в бадах, фитопрепаратах и сырье для их изготовления (стр. 2 )

Воспроизводимость методики подтверждена на пластинах Sorbfil, достигнуто четкое разделение, как и при использовании пластин Kieselgel 60F254. Сделан вывод, что подобранная система растворителей и проявляющие агенты являются оптимальными для дифференцирования сырья, содержащего кава-каву, от других растительных субстанций и могут служить как способ предварительной идентификации сырья П. опьяняющего и его субстанций в анализируемых объектах.

Подтверждающие способы идентификации перца опьяняющего
(ГХ-МС, ГХ-МС с динамическим анализатором парогазовой смеси)

Исследования проводили на хроматографе Agilent 6890N-5973N, работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой НР-5МS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока составляла 1,2 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса составляли 280°С. Температура колонки программировалась от 90°С до 310°С со скоростью повышения 35°С/мин. Ввод образцов объемом 1 мкл осуществляли методом без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 31 до 550 m/z. Все исследования на хроматографе проводились при этих настройках и параметрах, если не указано обратного.

После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «PMWTOX3», «NIST08» и «Wiley7N».

Масс-спектр исследуемого вещества считали идентифицированным при совпадении с библиотечным масс-спектром при коэффициенте подобия, превышающим 90 %.

В результате проведенного ГХ-МС исследования БАД к пище (рис. 1), был установлен качественный состав и количественное содержание основных групп БАВ. Концентрация кавалактонов составила 77,15 % ± 6,53 % от суммы БАВ, обнаруженных в добавке. Методом внутренней нормализации по площадям хроматографических пиков рассчитано количественное содержание кавалактонов и процентное соотношение от общей суммы кавалактонов (ОСК) в анализируемом объекте (таблица 3).

Таблица 3 – Содержание кавалактонов в БАД к пище (N=8)

№ п/п	RT, мин	Наименование кавалактона	Содержа-ние, %	Отношение к ОСК, %
1	2	3	4	5
1	4,337	дигидрокаваин-СО2	7,46±0,48	9,67
2	4,858	каваин-М-(О-десметил)-СО2	4,92±0,10	6,37
3	4,970	каваин-СО2	6,50±0,27	8,42
4	5,526	дигидрометистицин-СО2	4,41±0,31	5,72
5	6,308 6,680	каваин	12,38±0,87	16,04
6	6,408	7,8-дигидрокаваин	17,75±2,24	23,01
7	6,787	7,8-дигидрокаваин-5-ол	0,63±0,09	0,82

Продолжение таблицы 3

1	2	3	4	5
8	6,893	5,6-дегидрокаваин	6,50±0,42	8,42
9	7,083 7,710	янгонин	5,91±0,33	7,66
10	7,414	7,8-дигидрометистицин	8,17±1,02	10,59
11	7,509	5,6,7,8-тетрагидро-11-метистицин	0,52±0,11	0,67
12	7,763	метистицин	2,01±0,29	2,61

Помимо кавалактонов обнаружены: высшие спирты и углеводороды 7,42 % ± 1,21 %, эфиры жирных кислот 5,82 % ± 0,67 %, 7-метокси-7-(п-метоксифенил)-2-норборнен 2,69 % ± 0,71 %, флавокаваины 1,63 % ± 0,31 %, 6-фенил-3-гексен-2-он 0,94 % ± 0,19 % (некоторые авторы связывают это вещество с инициированием механизмов апоптоза и непосредственно гепатотоксичностью растения кава-кава), 1-циннамоил-пирролидин 0,91 % ± 0,13 %, пиностробин халкон 0,51 % ± 0,22 %.

Рис. 1 – Хроматограмма этанольного извлечения БАД к пище «Кава-кава. Безмятежное спокойствие»: хроматограф Agilent 6890N-5973N, режим ионизации электронным ударом при 70 эВ, капиллярная колонка НР-5МS (номера 1-12 на рисунке соответствуют кавалактонам 1-12 в таблице 3).

Для проведения более подробного газохроматографического исследования и получения данных для нахождения соответствия веществам Rf зон поглощения на пластинах ТСХ были получены и исследованы с помощью ГХ-МС отдельные фракции, элюированные с пластин ТСХ.

Накапливали достаточное количество сконцентрированных фракций этанольного извлечения: на пластины ТСХ наносили точку объемом 10 мкл в двух сантиметрах от края и далее «полосой» по 10 мкл в точку с 3-его по 8-ой сантиметр на линию старта (на каждую пластину около 200 мкл извлечения, всего подготовлено 5 пластин).

Хроматографировали пластины раздельно в системе растворителей этилацетат : гексан (2:3) и элюировали с каждой пластины фракции. Схема разбивки хроматографической пластины на фракции представлена на рисунке 2. Таким образом, с каждой из 5 пластин было снято 6 фракций (с 0 по V). Каждую фракцию аккуратно снимали с пластин и переносили в смоченные этанолом патроны для ТФЭ AccuBond II EVIDEX, в каждый патрон помещалось 5 соответствующих фракций с разных пластин. Троекратно заливали 1 мл этанола 95 %. На выходе получали 6 этанольных объединенных фракций, очищенных от силикагеля. Полученные объединенные фракции подвергали исследованию с помощью ГХ-МС.

Рис. 2 – Схема ТСХ-пластины (сорбент – силикагель, система раствори-телей этилацетат : гексан (2:3) с разбивкой на хроматографические зоны элюирования фракций

Проанализировав полученные в ходе ГХ-МС исследования данные по фракциям, была составлена сводная таблица соответствий (таблица 4).

Таблица 4 – Сводная таблица по идентифицированным веществам из фракций, проанализированных методом ГХ-МС

Rf (ТСХ)	RT, мин (ГХ-МС)	Наименование вещества с максимальным количественным содержанием в пробе
0,85-0,87	6,19	Транс-борнил циннамат
6,55	Цис-борнил циннамат
0,78-0,80	7,02	Пиностробин халкон
0,73-0,75	7,41; 7,60	Флавокаваин В и его изомеры
0,64-0,66	7,77	Флавокаваин С
0,59-0,61	8,24; 8,65	Флавокаваин А и его изомеры
0,36-0,38*	6,31; 6,42; 6,91	Каваин, 7,8-дигидрокаваин, 5,6-дегидрокаваин
0,29-0,31*	7,12; 7,46; 7,76	Янгонин, 7,8-дигидрометистицин
0,18-0,20*	7,51; 7,80	5,6,7,8-тетрагидро-11-метоксиянгонин, метистицин

Примечания: * – неоднородные зоны поглощения при просматривании в УФ-свете (254 и 365 нм).

Помимо БАД к пище, содержащей экстракт корневищ перца опьяняющего, и сконцентрированных фракций, полученных на ее основе, ГХ-МС исследованию подвергалось сырье перца опьяняющего – корневища 2 сортов Kuma Kua и Isa. Методика приготовления извлечений не отличалась от предложенной выше, так как корневища были измельчены. Таким образом, были получены две хромато-масс-спектрограммы для сорта Kuma Kua (рис. 3А) и сорта Isa (рис. 3Б).

Б

А

Рис. 3 – Хроматограмма этанольного извлечения корневищ перца опьяняющего сорта Kuma Kua (А) и сорта Isa (Б): хроматограф Agilent 6890N-5973N, режим ионизации электронным ударом при 70 эВ, капиллярная колонка НР-5МS (номера 1-11 на рисунке соответствуют кавалактонам 1-11 в таблице 5)

В результате проведенных ГХ-МС исследований этанольных извлечений из корневищ перца опьяняющего сортов Kuma Kua и Isa, были установлены качественные составы и количественные содержания основных групп БАВ. В сорте Kuma Kua содержится 62,78 % ± 5,70 % кавалактонов 22,83 % ± 3,54 % составляют норборнены, 0,74 % ± 0,18 %
N-циннамоилпирролидин. В сорте Isa содержится 70,00 % ± 6,41 % кавалактонов от суммы БАВ, борненов 16,43 % ± 2,76 %,
N-циннамоилпирролидин 0,44 % ± 0,12 %, 3,4-метилендиокси-циннамилиденацетон 2,38 % ± 0,39 %.

Таблица 5 – Содержание кавалактонов в сортах Kuma Kua и Isa

№ п/п	Наименование вещества	Содержание в Kuma Kua (N=6), %	Содержание в Isa (N=6), %
1	дигидрокаваин-CO2	1,01±0,12	0,75±0,14
2	каваин-CO2	2,31±0,08	2,38±0,35
3	каваин-М-(О-десметил)-СО2	2,17±0,31	не обнаружен
4	дигидрометистицин-СО2	3,76±0,24	2,88±0,40
5	7,8-дигидрокаваин	7,56±1,05	13,82±1,21
6	каваин	3,18±0,41	7,93±0,25
7	5,6-дегидрокаваин	9,41±0,53	5,18±0,43
8	7,8-дигидрометистицин	9,85±0,64	17,46±0,94
9	5,6,7,8-тетрагидро-11-метоксиянгонин	«следы»	0,60±0,23
10	янгонин	22,57±2,10	18,15±2,22
11	метистицин	0,96±0,22	0,85±0,23

Помимо обычной модификации метода хромато-масс-спектрометрии, была использована вариация ГХ-МС с методом равновесной парогазовой фазы, как оптимальный способ изучения летучих компонентов.