УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от 01.01.01 г. /07 | "УТВЕРЖДАЮ" Генеральный директор ЗАО “НВО Иммунотех” _____________________ "____" _________________ 2007 г. |
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ТИРЕОИДНОЙ ПЕРОКСИДАЗЕ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(ИммуноФА-АТ-ТПО)
Рекомендована к утверждению Научно-экспертным Советом по медицинским изделиям.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор ИммуноФА-АТ-ТПО предназначен для количественного определения аутоантител к тиреоидной пероксидазе (АТ к ТПО) в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Количественное определение уровня антител к тиреоидной пероксидазе в крови человека необходимо для диагностики нарушений функции щитовидной железы при аутоиммунных заболеваниях (болезнь Грейвса, аутоиммунные тиреоидиты, диффузный токсический зоб), а также для контроля за течением заболевания и ходом его лечения.
Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 неизвестного образца, 6 калибровочных проб и одной пробы контрольной сыворотки, всего 96 определений.
2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
В основе анализа лежит связывание антигена, иммобилизованного на поверхности лунок полистиролового планшета, с антителами к ТПО, содержащимися в анализируемом образце. Образующийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой из корня хрена. Количество связавшегося конъюгата выявляют с помощью раствора субстрата (тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски продукта окисления субстрата прямо пропорциональна концентрации антител к ТПО, содержащихся в анализируемом образце.
3. СОСТАВ НАБОРА
В состав набора входят:
- планшет 96-луночный полистироловый, стрипованный, сенсибилизированный тиреоидной пероксидазой – 1 шт.;
- калибровочные пробы на основе сыворотки крови человека, содержащие известные количества антител к тиреоидной пероксидазе: 0; 50; 100; 250; 500; 1000 МЕ/мл; концентрации АТ к ТПО в калибровочных пробах могут незначительно изменяться от серии к серии, точные значения концентраций указаны на этикетках флаконов, готовые для использования – 6 фл. (по 0,6 мл). Калибровочные пробы АТ к ТПО аттестованы по Международному стандарту АТ к ТПО NIBSC 66/387;
- контрольная сыворотка на основе сыворотки крови человека с известным содержанием АТ к ТПО, готовая для использования - 1 фл. (0,6 мл);
- конъюгат моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой из корня хрена, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением твин-20, рН 7,0+0,5, концентрированный - 1 фл. (15 мл);
- раствор для разведения сывороток, готовый для использования - 1 фл. (55 мл);
- раствор субстрата на основе ТМБ с добавлением перекиси водорода, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- стоп-реагент, готовый для использования - 1 фл. (15 мл);
- пленка для заклеивания планшета - 1 шт.
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Специфичность. Использование высокоочищенного препарата тиреоидной пероксидазы обеспечивает высокую специфичность анализа.
Чувствительность. Минимальная концентрация антител к тиреоидной пероксидазе, определяемая с помощью набора, составляет не более 10 МЕ/мл.
Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации результатов определения содержания АТ к ТПО в одном и том же образце сыворотки крови не превышает 8 %.
Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» АТ к ТПО – соответствие измеренной концентрации АТ к ТПО предписанной, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы 100 МЕ/мл. Процент «открытия» составляет 90-110 %.
Линейность. Зависимость концентрации АТ к ТПО в образцах сыворотки крови при разведении их сывороткой крови, не содержащей АТ к ТПО, имеет линейный характер в диапазоне концентраций 50-1000 МЕ/мл и составляет +10 %.
Клиническая проверка набора. Концентрация АТ к ТПО, определенная с помощью набора ИммуноФА-АТ-ТПО в сыворотке крови, взятой с 9 до 11 часов у здоровых лиц (n=250), не превышала 30 МЕ/мл.
Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора ИммуноФА-АТ-ТПО уточнить значения концентраций АТ к ТПО, соответствующие нормальным для обследуемого контингента.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента, в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Стоп-реагент действует на кожу и слизистые прижигающим образом, вызывая раздражение и ожоги, поэтому в случае попадания на кожные или слизистые покровы его следует немедленно тщательно смыть большим количеством проточной воды.
При работе с набором и утилизации отходов следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и другие возбудители вирусных инфекций.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ:
- Фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках планшета при длине волны 450 нм;
- термостат суховоздушный, поддерживающий температуру +(37+1)оС;
- пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20 мкл, 50-200 мкл, мкл;
- пипетка полуавтоматическая многоканальная с переменным объемом со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-250 мкл;
- шейкер;
- стакан химический мерный или колба мерная вместимостью 300 мл;
- флаконы или пробирки вместимостью 5,0 мл;
- вода дистиллированная;
- бумага фильтровальная или салфетки марлевые;
- перчатки резиновые или пластиковые.
7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
7.1. Приготовление рабочего раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБР).
Содержимое флакона с концентратом ФСБР перенести в мерный стакан вместимостью 300 мл, дважды ополоснуть флакон дистиллированной водой, все промывные воды объединить с разведенным ФСБР и довести общий объем раствора до 300 мл дистиллированной водой. Полученный рабочий раствор ФСБР можно хранить в закрытой емкости при температуре +(2-8)оС не более 7 суток.
Примечание. При хранении концентрата ФСБР могут образовываться кристаллы, поэтому при необходимости отбора аликвоты ФСБР необходимо слабо подогреть флакон с буферным раствором до полного растворения кристаллов, поместив его в водяную баню или термостат на температуру +37оС.
7.2. Перед проведением анализа исследуемые образцы сыворотки крови развести в 101 раз: к 0,01 мл сыворотки добавить 1,0 мл раствора для разведения сывороток. Тщательно перемешать. Разведенные образцы следует использовать в течение дня, хранению они не подлежат.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре +(20-25 о С) не менее 30 минут.
Внесение реагентов и анализируемых проб в лунки следует проводить согласно схеме на рис. 1.
8.1. Вставить в свободную рамку необходимое количество лунок для калибровочных проб, контрольной сыворотки и разведенных исследуемых образцов для постановки в дубликатах. Неиспользуемые стрипы необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшетов и хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности набора.
8.2. В два ряда лунок планшета внести в дубликатах по 0,05 мл калибровочных проб (КП), начиная с минимальной концентрации.
8.3. В две лунки планшета внести по 0,05 мл контрольной сыворотки (КС).
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | КП1 | КП1 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
B | КП2 | КП2 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
C | КП3 | КП3 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
D | КП4 | КП4 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
E | КП5 | КП5 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
F | КП6 | КП6 | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
G | КС | КС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
H | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС | ИС |
Рис. 1. Схема заполнения лунок планшета.
8.4. В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 0,05 мл разведенных образцов исследуемых сывороток крови (ИС).
8.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 мл раствора для разведения сывороток. Тщательно перемешать содержимое лунок, поместив планшет на шейкер, при комнатной температуре (+20-25оС) в течение 2 мин.
Процедуру внесения образцов и раствора для разведения сывороток следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 10-15 минут.
8.6. Закрыть планшет крышкой или заклеить пленкой для заклеивания планшетов и инкубировать в термостате в течение 45 минут при температуре +(37+1) оС.
8.7. Извлечь планшет из термостата и отмыть его. Промывку планшета можно проводить вручную или с использованием любого автоматического промывающего устройства. При ручной промывке удалить содержимое лунок декантированием, в каждую лунку планшета внести по 250 мкл рабочего раствора ФСБР (см п. 7.1), перемешать планшет на шейкере на 1- 2 мин, после чего удалить его содержимое декантированием. Процедуру повторить еще 2 раза. При автоматической промывке необходимо вручную удалить содержимое лунок планшета, только после этого приступить к отмывке с помощью прибора, внося в каждую лунку планшета 300–350 мкл рабочего раствора ФСБР. По окончании промывки тщательно удалить остатки жидкости из лунок, несколько раз резко вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
8.8. Во все лунки планшета внести по 0,1 мл конъюгата. Конъюгат вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку и исследуемые образцы.
8.9. Закрыть планшет крышкой или заклеить пленкой для заклеивания планшетов и инкубировать в термостате в течение 30 минут при температуре +(37+1) оС.
8.10. По окончании инкубации удалить содержимое лунок планшета и затем отмыть планшет 3 раза так, как это указано в п. 8.7.
8.11. Во все лунки планшета внести по 0,1 мл раствора субстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировать планшет при температуре +37оС в темноте в течение 10-15 мин в зависимости от степени развития окраски.
8.12. Внести во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата, по 0,1 мл стоп-реагента. Тщательно перемешать содержимое лунок, поместив планшет на шейкер, при комнатной температуре (+20-25оС) в течение 1 мин.
8.13. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 450 нм. Процедура измерения оптической плотности не должна превышать 15 минут.
9. РАСЧЕТЫ
9.1. Построить калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации АТ к ТПО в калибровочных пробах. Образец калибровочного графика приведен на рис. 2.
9.2. Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности контрольной сыворотки и анализируемых образцов и по калибровочному графику определить концентрацию АТ к ТПО.
9.3. При построении калибровочного графика и определении содержания АТ к ТПО в исследуемых образцах с помощью автоматического анализатора иммуноферментных реакций рекомендуется использовать кусочно-линейный метод аппроксимации (от точки к точке).
Рис. 2. Типичный калибровочный график, полученный
с использованием набора ИммуноФА-АТ-ТПО
9.4. Если концентрация АТ к ТПО в анализируемом образце превышает 1000 МЕ/мл, следует развести анализируемый образец раствором для разведения сывороток в 20 раз, затем сделать разведение согласно п. 7.2, повторить определение и полученный результат умножить на 20.
Внимание! В случае дополнительного разведения анализируемых образцов сыворотки крови следует иметь в виду, что из-за гетерогенности антител к ТПО для некоторых образцов линейный характер изменения концентрации при разведении может нарушаться.
10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
10.1. Набор реагентов ИммуноФА-АТ-ТПО должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности - 12 месяцев. Допускается хранение набора при температуре до +25оС не более 5 суток. Замораживание компонентов набора не допускается.
10.2. Неиспользованные стрипы после вскрытия упаковки необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшета и хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности набора
10.3. Калибровочные пробы, контрольную сыворотку и конъюгат после вскрытия флаконов можно хранить при температуре +(2-8)оС в течение 2 месяцев, остальные компоненты набора – в течение всего срока годности.
10.4. Рабочий раствор ФСБР можно хранить в закрытой емкости при температуре +(2-8)оС не более 7 дней.
10.5. В случае дробного использования набора построение калибровочного графика необходимо проводить для каждого независимого эксперимента, а также рекомендуется определение концентрации АТ-ТПО в контрольной сыворотке.
10.6. До проведения анализа возможно хранение образцов сыворотки крови не более 3 дней при температуре +(2-8)оС или в замороженном состоянии при температуре минус 20оС не более 2 мес.
Допускается только однократное замораживание и размораживание образцов сыворотки крови.
10.7. Исключается использование для анализа гемолизированных и мутных образцов сыворотки крови.
10.8. Для отбора и добавления реагентов необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению средней дозы и воспроизводимость результатов пипетирования.
10.9. Не допускается использование раствора субстрата и стоп-реагента из наборов, производимых другими фирмами.
10.10. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По вопросам, касающимся качества набора ИммуноФА-АТ-ТПО, следует обращаться в Иммунотех», почтовый адрес: Москва, Ленинские Горы, МГУ, д. 1, строение 11 А, , ; электронный адрес: *****@***ru; http://www. *****.
и в Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП» Росздравнадзора Москва, Научный проезд, д.14а,
