Предложение №: AD070315C-2
Исследование №: AD070315A
ВЛИЯНИЕ ЛОСЬОНА ОТ УГРЕЙ КЛИРОГЕН НА МЕТАБОЛИЗМ ТЕСТОСТЕРОНА В ВОССТАНОВЛЕННОМ ЭПИДЕРМИСЕ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
ОТЧЕТ О ПРОВЕДЕННОМ ИССЛЕДОВАНИИ AD070315A-2
Спонсор: | ЭДВАНС СКИН ЭНД ХЭЙР Инк. Доктор Алан ШАРГАНИ 12121 Бульвар Уилшир, Сьют 1012 Лос-Анджелес, Калифорния 90025, США E-mail: *****@***com |
Дата: 18 октября 2007 г.
Исследователи и автор данного отчета настоящим подтверждают валидность представленных данных и выражают свое полное согласие с выводами, приведенными в заключительной части отчета.
Подтверждено:
Имя: Должность: Дата: Подпись: | Франк ЖУШО Руководитель исследования 18 октября 2007 г. |
Содержание
1 – ВВЕДЕНИЕ.. 4
2 – МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 4
2.1 Биологическая модель. 4
2.2 Исследуемые смеси и препараты сравнения. 5
2.3 Тестостерон. 5
2.4 Лечение. 5
2.5 Экстракция и анализ. 5
3 – РЕЗУЛЬТАТЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 7
3.1 Жизнеспособность ВЧЭ.. ОШИБКА! СТРАНИЦА НЕ НАЙДЕНА
3.2 Метаболизм тестостерона. 7
4 – ТАБЛИЦЫ И РИСУНКИ.. 9
1 – ВВЕДЕНИЕ
Компания ЭДВАНС СКИН ЭНД ХЭЙР Инк. разработала сложный состав - Лосьон от угрей Клироген для лечения угревой сыпи. Угревая сыпь – это многопараметрическое заболевание кожи, при котором наблюдается гиперсекреция кожного сала в результате циркуляции тестостерона. Тестостерон не является активной формой данного гормона. Он активируется благодаря участию 5α редуктазы, которая вырабатывает эффективный стероид дигидротестостерон. Известно, что ингибирование активности 5α редуктазы приводит к уменьшению угревой сыпи.
БИОалтернативс осуществила данное исследование для того, чтобы провести оценку влияния тестируемых сложных веществ на метаболизм тестостерона в восстановленном эпидермисе кожи человека. Эта модель доказала свою эффективность при оценке ингибиторов этого метаболизма (Bernard et al. 2000; Int.J.Cosm.Sci., 22, 397-407).
Стероидные изоэнзимы 5α-редуктазы (5αR) трансформируют тестостерон (Т) в 17β-гидрокси-5α-андростан-3-он (5-дигидротестостерон, ДГТ). Эта реакция занимает ключевое место в действии андрогенов.
Тестостерон | → | 5α-дигидротестостерон | → | 5α-андростендиолы* |
Т | 5αR | 5ДГТ | 3ГСД** | АСД |
* 3β, 17β-диол и 3α, 17β-диол изомеры ** 3-гидроксистероид дигидрогеназы |
2 – МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Биологическая модель
Восстановленный эпидермис кожи человека (ВЧЭ)
- Ткани: 18 ВЧЭ (0,50 см², 10 дней), образец №
- Культура: при 37°С и 5% СО2
- Питательная среда для культуры: дифференцировочная среда
2.2 Исследуемые смеси и препараты сравнения
Исследуемая смесь | Маточный раствор | Разведение | Способ применения |
Лосьон от угрей Клироген образец 0К085В (AD070315/1) | Крем, поставленный спонсором исследования и хранившийся при комнатной температуре | - | Местный, 3 µл/ВЧЭ |
Препарат сравнения | Маточный раствор | Разведение | Способ применения |
Финастерид Образец 231664 | 10-2 М в этаноле | в воде | Местный, 10-5 М/ВЧЭ |
Аводарт® Образец 053721А | 10-3 М в этаноле | в воде | Местный, 10-6 и 10-5 М/ВЧЭ |
2.3 Тестостерон
Тестостерон: [4-14С] тестостерон (Амершам В76, 54 мКи/ммоль, 2,35 нмоль/эпидермис).
Маточный раствор [4-14С] тестостерона был растворен в этаноле с последующим разведением в стерильной воде (конечная концентрация этанола 1%).
2.4 Лечение
Было проведено местное лечение ВЧЭ (или не проведено, контроль) исследуемым составом или препаратами сравнения. Для каждого типа экспериментальных условий были использованы 3 ВЧЭ.
По истечении 24 часов с момента начала лечения было проведено повторное местное нанесение препаратов, после чего ВЧЭ был инкубирован в течение 5 часов. После инкубации исследуемый состав и препараты сравнения были удалены с поверхности ВЧЭ, а затем на stratum corneum (роговой слой) каждого ВЧЭ было нанесено 100 µл маркированного раствора тестостерона (127 нКи/эпидермис).
По истечении 24 часов с момента начала инкубирования, питательная среда под ВЧЭ была собрана для проведения анализа на содержание стеролов.
2.5 Экстракция и анализ
Оценка трансэпидермальной диффузии: объем тестостерона, прошедшего сквозь эпидермальные ткани, был измерен методом жидкостно-сцинтилляционного счета (LKB 1211 счетчик Rackbeta) фракции питательной среды для культуры.
Анализ метаболизма: стероидные молекулы из питательной среды были извлечены с помощью 2 объемов хлороформа/метанола (98:2) и высушены. Различные виды молекул (метаболиты тестостерона) были отделены друг от друга методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на платинах с силикагелем (RE/Silice, Whatman) в системе растворителей с содержанием дихлорметана, этилацетата и метанола (85:15:3).
Затем платины были подвергнуты радиоавтографическому анализу с количественным определением содержания метаболитов тестостерона с помощью PhosphorImager и специального программного обеспечения (оборудование фирмы Packard).
3 – РЕЗУЛЬТАТЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3.2 Метаболизм тестостерона
 | |
| |
| |
 |
Схематическое изображение этапов метаболизма тестостерона. Воздействие финастерида (источник: Bernard F-X et al., Int. J.Cosmetic Science, 22 397-
Таблицы 1 и 2
Контрольный образец при отсутствии лечения:
По истечении 24 часов взаимодействия с питательной средой уровень метаболизма тестостерона был очень высоким.
Дигидротестостерон (ДГТ) ясно определялся в стероидном профиле. ДГТ являлся главным метаболитом в исследуемом эпидермисе. По истечении 24 часов около 74% накопленного тестостерона трансформировались в ДГТ. Другие важные метаболиты включали андростан-диолы (е) и 4-андростен-3,17-дионы (b).
Воздействие финастерида:
Финастерид при 10-5 М существенно ингибировал трансформацию тестостерона в ДГТ (уровень ингибирования составил 67% по сравнению с контрольным образцом). Кроме того, как и ожидалось, финастерид способствовал уменьшению объема андростан-диолов (е) и выраженной аккумуляции 4-андростен-3,17-дионов (b) (Рисунок 1).
Воздействие дутастерида:
Дутастерид при 10-6 и 10-5 М существенно дозозависимо ингибировал трансформацию тестостерона в ДГТ (уровень ингибирования выработки ДГТ составил 80% и 86% по сравнению с контрольным образцом). Кроме того, как и ожидалось, дутастерид способствовал уменьшению объема андростан-диолов (е) и выраженной аккумуляции 4-андростен-3,17-дионов (b) (Рисунок 1).
Воздействие лосьона от угрей Клироген:
Лосьон от угрей Клироген (5 мг/см²) способствовал уменьшению трансформации тестостерона в ДГТ (уровень ингибирования составил 49% по сравнению с контрольным образцом), а также трансформации ДГТ в андростан-диолы (е). Удивительно, но видимой аккумуляция 4-андростен-3,17-дионов (b) не наблюдалось
В заключение можно отметить, что использование лосьона от угрей Клироген привело к заметному снижению выработки ДГТ, в связи с чем данный препарат может применяться для лечения угревой сыпи.
4 – ТАБЛИЦЫ И РИСУНКИ
Таблица 1: Диффузия [14С] тестостерона (и метаболитов) сквозь ВЧЭ.
Трансэпидермальная диффузия (24 часа)
Лечение | Конц. | cpm | СО | n | % контроль | нмоль стероиды |
Всего тестостерон | - | 326060 | - | 1 | - | 2,35 |
Контрольный образец при отсутствии лечения | - | 125307 | 14977 | 3 | 100 | 0,9 |
Финастерид | 10-5 М | 147747 | 6335 | 3 | 118 | 1,1 |
Дутастерид | 10-5 М 10-6 М | 150160 159213 | 10809 20653 | 3 3 | 120 127 | 1,1 1,1 |
Лосьон от угрей Клироген | 5 мг/см² | 140640 | 14980 | 3 | 112 | 1,0 |
|
|
|
|
|
 |  |
| |
Рисунок 1: Тонкослойная хроматография и радиоавтография [14С] тестостерона и метаболитов после трансэпидермальной диффузии (24 часа).
Таблица 2. Воздействие лосьона от угрей Клироген и препаратов сравнения на выработку метаболитов тестостерона. Аналитический обзор результатов ТСХ с помощью Imager представлен на рисунке 2 (прямое измерение радиоактивности).
Всего | Тестостерон | ДГТ | ДГТ/тестостерон | ||||||||
Лечение | Конц. | Дорожка № | УЕ | Среднее | УЕ | % всего | среднее (%) | УЕ | % всего | среднее (%) | соотношение |
Контроль | - | 2 3 4 | 24474 29037 24763 | 26091 | 5821 7177 6293 | 23,8 24,7 25,4 | 24,6 | 4273 5072 4375 | 17,5 17,5 17,7 | 17,5 | 0,71 |
Финастерид | 10-5 М | 5 6 7 | 35114 30182 26227 | 30507 | 13282 11691 10105 | 37,8 38,7 38,5 | 38,4 | 3314 2744 2325 | 9,4 9,1 8,9 | 9,1 | 0,24 |
Дутастерид | 10-5 М | 8 9 10 | 24240 25088 26361 | 25230 | 11298 11695 12264 | 46,6 46,6 46,5 | 46,6 | 1222 1282 1298 | 5,0 5,1 4,9 | 5,0 | 0,11 |
10-6 М | 11 12 13 | 29444 28026 27017 | 28162 | 12800 11772 11520 | 43,5 42,0 42,6 | 42,7 | 1650 1649 1567 | 5,6 5,9 5,8 | 5,8 | 0,13 | |
Лосьон от угрей Клироген | 5 мг/см² | 14 15 16 | 27795 24841 23135 | 25257 | 11660 9985 9001 | 42,0 40,2 38,9 | 40,4 | 2977 2982 2661 | 10,7 12,0 11,5 | 11,4 | 0,28 |
УЕ: Условная единица для количественного определения радиоактивности
|
|
|
|
|
Рисунок 2. Воздействие лосьона от угрей Клироген и препаратов сравнения на метаболизм ДГТ.
