Фармакологическое исследование ряда гистопротекторов растительного происхождения для профилактики и лечения осложнений химиотерапии

На правах рукописи

ШЕПЕЛЕВА

Валерия Викторовна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЯДА ГИСТОПРОТЕКТОРОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ХИМИОТЕРАПИИ

– фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт- Петербург

2009

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии

Научный руководитель:

доктор биологических наук Галина Ивановна Нежинская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кассиния Валентиновна Яременко

доктор биологических наук Ирина Викторовна Зарубина

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им.

Защита диссертации состоится «______» _______________ 2009 года в ___ часов в конференц-зале на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 при учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного учреждения научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН по адресу Санкт-Петербург, .

Автореферат разослан « » 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительное место среди методов лечения злокачественных новообразований занимает химиотерапия (, 2003; , 2005; , 2007), которая часто сопровождается развитием побочных реакций в отношении нормальных активно пролиферирующих тканей (, 2003; , 2004). Наиболее часто встречается гематологическая (85-90 %) и гастроинтестинальная (до 90 %) токсичность (, 2005). Известно, что состояние органов кроветворения, состав и свойства крови отражают нарушения во всех тканях в условиях цитостатического воздействия ( и др., 1999). Среди средств, предупреждающих повреждение нормальных тканей, дексразоксан влияет на сердце, месна – на почки, ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим, эритропоэтин – на систему кроветворения, апрепитант, ондансетрон, гранисетрон, трописетрон, триэтилперазин – на диспепсические расстройства (, 2007; Bauvet F. et al., 2008), амифостин обладает нейро-, нефро-, ото-, гематопротекторным действием (Stolarska M. et al., 2006; Batista C. K.L. et al., 2007). Узкая направленность корректоров цитотоксичности, наличие побочных эффектов или высокая стоимость ограничивают их применение (, 2004; , 2007; Othieno-Abinya N. A. et al., 2007). В качестве сопровождения химиотерапии иногда применяют растения, такие как алтей, береза, бессмертник, девясил, женьшень, зверобой, календула, крапива, одуванчик, подорожник, сушеница, шалфей, элеутерококк и др. ( и др., 2000; , 2003; , 2004; и др., 2007; , 2008). Показано, что растительные гистопротекторы обладают противоопухолевыми и детоксикационными свойствами, включающими в себя противовоспалительный, иммуномодулирующий, мочегонный, желчегонный, гепатопротекторный, репаративный и др. эффекты (, 2007; и др., 2007), а также могут предупреждать повреждение молекул ДНК, корректировать нарушение ферментного гомеостаза клеток и ингибировать стимуляцию перекисного окисления липидов, вызванного цитостатиками ( и др., 2000; и др., 2003; и др., 2005; Gadjeva V. et al., 2008; Mazor D. et al., 2008). Однако совместное применение химиотерапии с фитотерапией в настоящий момент ограничено. Это может быть связано с медленным развитием выраженного лечебного эффекта при применении одного растения или стимуляции опухолевого процесса при использовании их большого числа (20 – 25 наименований). Не исключается возможность взаимодействия ряда растительных препаратов между собой, а также их взаимодействия с цитостатиками, приводя, таким образом, к изменению фармакокинетики последних и снижению их противоопухолевой активности (, 2008; Sparreboom A. et al., 2004).

Среди большого числа растений, обладающих детоксикационными свойствами, можно выделить календулу лекарственную, подорожник большой и крапиву двудомную. Кроме перечисленных выше свойств, приводящих к детоксикационному эффекту, они нормализуют гемопоэз, оказывают защитное действие на пролиферирующие ткани (костный мозг, слизистую оболочку желудка и др.) ( и др., 2007), обладают антигипоксическим, антиоксидантным (крапива двудомная, календула лекарственная, подорожник большой) (, , 1991; , , 2003) и адаптогенным эффектами (крапива двудомная, подорожник большой) ( и др., 1993). Данных о применении сбора, содержащего только эти растения, не обнаружено. Однако известны сборы, в которых они присутствуют совместно с другими растениями. Если в состав сбора включены кроме этих растений зверобой, шалфей и ромашка, то такой настой сбора применяется при различных заболеваниях кожи (, , 1991), если девясил, шиповник, полынь обыкновенная, фасоль, эхинацея пурпурная («Гепапанкреафит – Р») – при хроническом панкреатите и гепатите в стадии ремиссии (, 2008), а совместно со смородиной черной и душицей – для профилактики опухолевых заболеваний (, , 2004). Вместе с тем, также не обнаружено сборов, включающих крапиву двудомную, календулу лекарственную, подорожник большой, применяемых в качестве корректоров цитотоксического действия противоопухолевых препаратов.

Известно, что циклофосфан и доксорубицин применяются при раке молочной железы, множественной миеломе, ходжкинских и неходжкинских лимфомах (Priestman T. J., 2008), циклофосфан – при ювенильном артрите, системной красной волчанке и других заболеваниях (Feldman B. M., 2005). Вместе с тем, эти противоопухолевые препараты используют в эксперименте для моделирования побочных эффектов (, 2006; , 2006; , 2007; Zuluaga A. F. et al., 2006). Модельные комбинации цитостатиков со сбором растений позволят разрабатывать эффективные схемы включения последнего в противоопухолевую химиотерапию.

Цель исследования. Фармакологическое исследование настоя сбора растений, включающего подорожник большой (Plantago major L.), календулу лекарственную (Calendula officinalis L.) и крапиву двудомную (Urtica dioica L.), в качестве детоксикационного средства, предупреждающего нарушения гематологических, регенерационных, иммунных, метаболических процессов, вызываемых противоопухолевыми препаратами.

Задачи исследования.

1.  Проведение скрининга настоев листьев березы, крапивы двудомной, подорожника большого, цветков календулы, цветков и листьев липы, травы чабреца, отвара корней алтея лекарственного, а также экстрактов цетрарии исландской и овса посевного, их комбинаций между собой и с цитостатиками (модели гипоксии, реакция гемагглютинации) для подбора фармакологически активного настоя сбора растений.

2.  Оценка адаптогенных свойств и иммунотропной активности циклофосфана или доксорубицина, примененных с настоем сбора, содержащего листья подорожника большого, цветки календулы лекарственной и листья крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, и влияния этого комплекса на психофизиологический статус животных по сравнению с эффектами цитостатика.

3.  Оценка токсикомодифицированного действия циклофосфана или доксорубицина при применении их с настоем сбора растений на морфофункциональные показатели (масса тела, тимуса и селезенки) и гистологическую картину органов (печень, легкие, сердце, почки, тимус, селезенка, желудок, надпочечники).

4.  Оценка количественного и качественного состава элементов крови, вызванного противоопухолевыми препаратами при введении их с настоем сбора растений по сравнению с действием самих противоопухолевых препаратов.

5.  Оценка влияния цитостатиков в комбинации с настоем сбора растений на биохимические показатели крови – содержание общего белка, активность ферментов (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы), уровень антиоксидантной защиты (активность супероксиддисмутазы, каталазы, количество тиоловых групп белков) и продукты перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид).

Положения, выносимые на защиту.

1.  Применение цитостатиков, усиливающих гипоксию, совместно с настоем сбора из листьев подорожника большого, цветков календулы лекарственной и листьев крапивы двудомной эффективно лимитирует её проявления. Наиболее выраженный антигипоксический эффект в этих условиях оказывает настой сбора из данных растений в соотношении 2:2:1 соответственно.

2.  Настой сбора растений в соотношении 2:2:1 обладает адаптогенной активностью (усиливает работоспособность при первичных, повторных физических нагрузках, в условиях психоэмоционального стресса) и иммуномодулирующей активностью (лимитирует развитие реакции Артюса, усиливает функции В-лимфоцитов), нормализует морфофункциональные показатели (масса тела, тимуса, селезенки) и предупреждает повреждение клеток печени, вызванное циклофосфаном или доксорубицином.

3.  Применение цитостатиков с настоем сбора растений уменьшает лейкопению, тромбоцитопению, анемию, количество незрелых форм нейтрофилов, нормализуя показатели лейкоцитарной формулы, гипопротеинемию, снижает активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы в плазме крови, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты, что подтверждается снижением количества продуктов перекисного окисления липидов и повреждающего действия цитостатиков на мембраны эритроцитов.

Научная новизна. Впервые подобран сбор растений, включающий листья подорожника большого, цветки календулы лекарственной и листья крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, настой которого, обладая антигипоксической, антиоксидантной, иммуномодулирующей, противовоспалительной, актопротекторной активностью, оказывает, таким образом, детоксикационное действие.

Применение модельных комбинаций циклофосфана или доксорубицина с настоем сбора растений с целью коррекции осложнений на органы (улучшал регенерационные процессы в печени, почках и селезенке) является эффективным приемом снижения токсического действия противоопухолевых препаратов.

Впервые показано, что настой сбора растений существенно снижал лейкопению, анемию и тромбоцитопению, препятствовал сдвигу лейкоцитарной формулы влево (увеличивая количество зрелых нейтрофилов и снижая количество миелоцитов и юных форм нейтрофилов), предупреждал нарушения проницаемости эритроцитарных мембран, нормализовал антителогенез, ограничивал развитие реакции Артюса и воспаления, а также препятствовал снижению массы лимфоидных органов и тела животных.

Впервые показано, что настой сбора растений уменьшал выраженность катаболического синдрома (увеличивалось количество общего белка в плазме), нарушения метаболических процессов (снижал активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы), и повышал антиоксидантную защиту крови (активность супероксиддисмутазы и каталазы, количество сульфгидрильных групп белков), снижая накопление малонового диальдегида и проницаемость мембран клеток.

Практическое значение. Разработан сбор растений, применение которого может являться эффективной детоксикационной мерой, предупреждающей гематологические нарушения (количественный и качественный состав крови, биохимические нарушения), вызванные применением циклофосфана или доксорубицина и, вероятно, других противоопухолевых препаратов. Результаты работы по изучению возможности применения в комплексной терапии злокачественных новообразований настоев лекарственных растений могут служить основой для разработки новых высокоэффективных препаратов-корректоров побочных эффектов химиотерапии.

Материалы диссертации используются в учебном и лекционном материале Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии на дисциплинах фармакология и клиническая фармакология.

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Фармакологические исследования, анализ, интерпретация и изложение полученных данных выполнены автором лично.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 4-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); на юбилейной конференции, посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2005); на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); на Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006, 2008); на конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007); на III съезде фармакологов России: «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на региональной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); на научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); на V Конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на заседании общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2008). Апробация диссертации прошла на совместном межкафедральном заседании кафедры фармакологии, патологии и физиологии и лаборатории фармакологических исследований 30 декабря 2008 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 14 рисунками, библиографический указатель включает 231 источник, из них 123 отечественных и 108 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения экспериментальных исследований использовали самцов мышей-гибридов линий (CBA×C57BL/6)F1 массой 18-20 г (n=420), белых мышей массой 20-22 г (n=650), белых крыс массой 200-240 г (n=390), полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде при 12 часовом световом дне.

В работе использовали терапевтические дозы алкилирующего препарата циклофосфана (циклофосфамид) и антрациклинового антибиотика доксорубицина (адриамицин) (, 2007), пересчитанные на животных ( и др., 2000). Циклофосфан использовали в дозе 200 мг/кг (для мышей) и дозе 100 мг/кг (для крыс), доксорубицин в дозе 6 мг/кг (для мышей) и дозе 10,5 мг/кг (для крыс).

В скрининговые исследования (фитопрепараты применялись перорально) были взяты настои листьев подорожника большого, листьев крапивы двудомной, цветков календулы, травы чабреца, листьев березы, цветков и листьев липы, отвар корней алтея лекарственного (по 10 мл/кг) (, , 2003), экстракты слоевищ цетрарии исландской (57 мг/кг) (Пат. 2 2001) и травы овса посевного (0,5 мг/кг) (, 2002). Настои сборов из листьев подорожника большого, цветков календулы лекарственной, листьев крапивы двудомной изучались в диапазоне доз от 2,5 до 25 мл/кг и в разных соотношениях.

В качестве препаратов сравнения, терапевтические дозы которых (, 2007) пересчитаны на животных ( и др., 2000), использовали антигипоксант триметазидин (12 мг/кг, внутрибрюшинно), иммуномодулятор с антиоксидантным эффектом – глутоксим (12 мг/кг для мышей и 6 мг/кг для крыс, подкожно), адаптоген растительного происхождения – экстракт элеутерококка жидкий (1 мл/кг для мышей, перорально). Кроме них применяли гутимин (50 мг/кг, внутрибрюшинно), используемый в эксперименте в качестве антигипоксанта (, 1975), и настойку листьев женьшеня «Фолигин» (2 мл/кг, перорально) (Пат. 2 2001).

Экспериментальные модели: определение психофизиологического статуса (для отбора со средней эмоциональной активностью) экспериментальных животных (крыс) проводили в интегрированном тесте "открытое поле" и "норковый рефлекс" (, 1989). Антигипоксическое действие изучали на моделях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) и острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ) (, 1985). Физическую выносливости животных исследовали на модели «плавательного теста» (, 1998), используя различные модификации: первичный «плавательный тест»; повторную физическую нагрузку, которую проводили у крыс через 5 дней после «плавательного теста», оценивая адаптацию животных к ней; «плавательный тест» в условиях психоэмоционального стресса, который вызывали внезапным помещением крыс в воду без предварительной трехдневной тренировки.

Оценку токсикомодифицирующего действия настоя сбора растений проводили по влиянию противоопухолевых препаратов на изменение массы тела и лимфоидных органов (тимус, селезенка) (, , 2000), по аутопсии внутренних органов (патоморфологическая картина) ( и др., 2000). Циклофосфан и доксорубицин вводили внутрибрюшинно однократно. Одновременно с препаратами животные получали настой сбора (1:10) из подорожника большого, календулы лекарственной и крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, в дозах 5, 10, 25 мл/кг для мышей и дозах 2,5, 5, 10, 25 мл/кг для крыс. Расчет токсических доз ЛД10, ЛД16, ЛД50, и ЛД84 проводили в соответствии с Государственной Фармакопеей XI издания (1987).

Морфологические исследования органов (печень, легкие, сердце, почки, селезенка, тимус, надпочечники, семенники, желудок). Органы фиксировали, делали срезы на микротоме, окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку патологических изменений препаратов проводили с помощью микроскопа «Биолам» (увеличение ×200, ×400) под руководством канд. мед. наук .

Морфофункциональные изменения тимуса и селезенки оценивали у мышей-гибридов (CBA×C57BL/6)F1, которых иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ, 2x106/мышь), и одновременно с введением циклофосфана (200 мг/кг) или доксорубицина (6 мг/кг) (однократно, внутрибрюшинно) они получали (перорально) настой сбора растений (10 мл/кг), который вводили в течение 6 дней. В качестве препарата сравнения использовали глутоксим в дозе 12 мг/кг ( и др., 2001). На 7 сутки мышей умерщвляли путем дислокации шейных позвонков, извлекали лимфоидные органы, взвешивали их на торсионных весах, массу органа выражали в мг.

Реакцию гемагглютинации (РГА) ( и др., 2000) проводили на мышах-гибридах, у которых на 7 сутки после иммунизации ЭБ забирали кровь, отделяли плазму и проводили РГА в 96-луночном пластиковом планшете.

Количество антителообразующих клеток (АОК/106 спленоцитов) определяли на 5 сутки после иммунизации ЭБ мышей-гибридов линий (CBA×C57BL/6)F1 (Jerne N. K. et al., 1974) и введения им циклофосфана (200 мг/кг) или доксорубицина (6 мг/кг) и/или настоя сбора растений (10 мл/кг). Контролем служили мыши, иммунизированные той же дозой эритроцитов барана и получающие воду очищенную перорально.

Реакцию Артюса инициировали у мышей-гибридов (CBAхC57BL/6)F1, которых сенсибилизировали подкожной инъекцией в основание хвоста 0,02 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ, «Sigma») и которым вводили разрешающую дозу ПАФ (тот же объем ПАФ через 2 недели после сенсибилизации) (, 1983). Степень повреждения кожных покровов оценивали ежедневно в течение 14 суток после введения разрешающей дозы ПАФ. Циклофосфан (200 мг/кг) или доксорубицин (6 мг/кг) вводили (внутрибрюшинно, однократно) одновременно с сенсибилизирующей дозой ПАФ. Настой сбора растений (10 мл/кг) мыши получали перорально в течение 14 дней. В качестве препарата сравнения использовали глутоксим (12 мг/кг, в течение 14 дней). Контролем служили мыши, получавшие цитостатики или воду очищенную (интактные).

Исследования состава крови проводили через 24 часа и на 3, 7, 14, 21, 28 сутки после введения цитостатиков с настоем сбора растений (в течение 28 дней). Контролями служили крысы, получавшие цитостатики или интактные.

Подсчет числа эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов в цельной крови проводили методом Культера с помощью гематологического анализатора Abacus Junior Vet (Австрия), используя реагенты фирмы «Реамед» (Россия) (интактные животные) и унифицированным способом (, 1982) (животные с патологией). Лейкоцитарную формулу определяли на мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому-Гимза на микроскопе фирмы ЛОМО АУ-12 при увеличении ×900.

Оценку проницаемости эритроцитов (, , 1982) проводили после однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана (100, 200 мг/кг) или доксорубицин (10,5, 12 мг/кг) и настоя сбора растений (2:2:1), который крысы получали перорально в течение 14 дней.

Биохимические исследования крови: определение активности супероксиддисмутазы ( и др., 1990), каталазы (Beutler E., 1975), концентрации малонового диальдегида (, , 1985), сульфгидрильных групп белков ( и др., 2000) проводили через 1 и 24 часа, на 14 и 28 сутки после введения циклофосфана или доксорубицина и настоя сбора растений. Активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, концентрацию гемоглобина, общего белка определяли через 24 часа и на 28 сутки, используя наборы реагентов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали параметрическим методом с помощью t-критерия Стьюдента, используя программу статистической обработки «BIOSTAT 4.03» для биомедицинских исследований (Гланц C., 1999). Различия считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При выборе растений для скрининга опирались на то, что они должны иметь стабильную сырьевую базу в России, быть официнальными растительными препаратами, имея в качестве экстрагента воду, а также обладать противоопухолевыми и детоксикационными свойствами (, 2007). Для скрининга использовали модель гипоксии (ОГБГ) и реакцию определения титра специфических антител к ЭБ, которые позволяли оценить фармакологическую активность большого числа фитопрепаратов.

Изучение на модели ОГБГ влияния настоев и экстрактов растений на продолжительность жизни мышей показало, что введение большинства настоев за 60 мин до подъема мышей на высоту 11000 м приводило к удлинению продолжительности жизни мышей. Применение отвара алтея лекарственного удлиняло продолжительность жизни мышей на 2,4 мин, календулы лекарственной – на 5,3 мин, крапивы двудомной – на 2,9 мин, подорожника большого – на 3,6 мин, тимьяна ползучего – на 2,7 мин по сравнению с контролем (мыши, получавшие воду очищенную) (в каждой группе по 10 животных, p<0,05). Применение настоя березы повислой, липы сердцевидной и растворов экстрактов цетрарии исландской (ислацет) и овса посевного не приводило к увеличению продолжительности жизни животных. Исследование влияния настоев растений на РГА показало, что настой календулы лекарственной увеличивал титр антител в 1,6 раз, подорожника большого – в 1,3 раза, крапивы двудомной – в 1,2 раза, а настои березы повислой, тимьяна ползучего, отвар алтея лекарственного и растворы экстрактов цетрарии исландской и овса посевного не оказывали существенного влияния на продукцию специфических антител. Применение цитостатиков, которые усугубляют гипоксию, с подорожником большим (выживаемость мышей в 20-25% случаев), календулы лекарственной (в 20-30% случаев), крапивы двудомной (в 15-20% случаев) существенно удлиняло продолжительность жизни мышей (рис. 1).

Кроме того, известно, что подорожник большой обладает выраженными регенераторным, иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектами; календула лекарственная – противовоспалительным, ранозаживляющим, гепатопротекторным, спазмолитическим и др. действием; крапива двудомная – противовоспалительным действием, улучшает обменные процессы в организме, способствует снижению содержания продуктов перекисного окисления липидов, нормализует гемопоэз, увеличивает количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов крови ( и др., 2007), что позволило выбрать эти растения для настоя сбора растений.

Рис.1. Влияние циклофосфана (а) и доксорубицина (б) с настоями лекарственных растений на продолжительность жизни мышей при гипоксии.

1 – Контроль (интактные животные); 2 – цитостатик; 3 – цитостатик + настой листьев подорожника; 4 – цитостатик + настой цветков календулы; 5 – цитостатик + настой листьев крапивы; 6 – цитостатик + настой сбора растений (1:1:1); 7 – цитостатик + настой сбора растений (2:2:1); 8 – цитостатик + триметазидин. * – p<0,05 (n=10) по сравнению с интактными животными (негативный контроль); х – то же самое по сравнению с животными, которые получали цитостатик (позитивный контроль).

Оценка антигипоксического эффекта настоя сбора этих растений в дозе 10 мл/кг и соотношении 2:2:1 (соответственно) показала, что он наиболее выражено лимитирует гипоксию (рис. 1) по сравнению с настоем сбора растений в соотношении 1:1:1 (в 2,2 раза) и эффектами компонентов сбора (2 – 4 раза). Полученные данные показывают, что настой сбора, содержащий подорожник большой (2 части), календулу лекарственную (2 части) и крапиву двудомную (1 часть) проявлял выраженную антигипоксическую активность, аналогичную известному антигипоксанту триметазидину.

Токсикомодифицирующее действие разных доз настоя сбора растений (2:2:1) (для крыс – 2,5, 5, 10, 25 мл/кг; для мышей – 5, 10, 25 мл/кг) при применении их с циклофосфаном или доксорубицином показало, что дозы настоя, начиная с 5 мл/кг для крыс или 10 мл/кг для мышей, оказывают одинаковый эффект, предупреждая потерю в массе тела, инволюцию тимуса и селезенки. Введение цитостатика с настоем сбора растений крысам приводит к уменьшению его токсичности, увеличивая ЛД10 и ЛД16 и снижая степень повреждения внутренних органов (табл. 1).

Таблица 1. Оценка токсикомодифицирующего действия настоя сбора растений на эффекты цитостатиков.

Препарат	Летальная доза	Повреждающее действие на ткани органов
Циклофосфан	ЛД10 ЛД16		Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.
Доксорубицин	ЛД10 ЛД16		Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

(продолжение таблицы 1)

Циклофосфан +настой сбора растений	ЛД10 ЛД16		Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.
Доксорубицин +настой сбора растений	ЛД10 ЛД16		Печень, почки, эпителий желудка, селезенка.

Примечание. – снижение, - увеличение.

Адаптогенное действие настоя сбора растений (вводили перорально по 5 мл/кг за 60 мин до плавания) проявлялось в том, что он повышал физическую выносливость крыс, получавших цитостатик. У животных, адаптированных к нагрузкам, доксорубицин+настой сбора растений увеличивал время плавания в 2,1 раза (n=5, p<0,05), а циклофосфан+настой сбора растений – в 3,2 раза (n=5, p<0,05) по сравнению с введением только цитостатиков. Протективные эфффекты настоя сбора растений превосходили таковые у фолигина (препарат сравнения). В условиях психоэмоционального стресса (плавание без предварительной тренировки) доксорубицин или циклофосфан+настой сбора растений увеличивали время плавания в 1,7 и 2,2 раза (n=10, p<0,05). Эффективность применения настоя сбора растений подтверждалась тем, что пероральное введение его в течение 5 дней после однократной физической нагрузки крысам приводило к тому, что при повторной нагрузке (плавание) они были в 9 раз выносливее крыс, получавших циклофосфан, но не доксорубицин. У крыс, которым вводили доксорубицин с настоем сбора растений, физическая выносливость практически не отличалась от контроля, т. е. крыс, получавших только цитостатик. Аналогичные данные получены при применении его с фолигином, что может говорить о сильном депрессивном действии доксорубицина на организм. Известно, что введение цитостатика запускает адаптационно-приспособительные реакции организма, а растения, обладающие адаптогенными свойствами, влияют на приспособительные механизмы резистентности организма к неблагоприятным воздействиям (, 2007). Полученные данные показывают, что настой сбора растений имеет выраженную стресспротективную активность, может способствовать адаптации организма к действию не только самого цитостатика, но и при применении его в условиях психоэмоционального стресса.

Иммунотропная активность цитостатиков в комбинации с настоем сбора растений, связанная с их влиянием на антителогенез, показала, что титры специфических антител в плазме мышей-гибридов линий (CBA×C57BL/6)F1 существенно возрастали по сравнению с действием одних цитостатиков (n=8, p<0,05). Сами по себе цитостатики значительно снижали содержание специфических антител в плазме крови мышей по сравнению с животными, иммунизированными ЭБ и не получавшими препараты (контроль) (n=8, p<0,05). Оценка антителогенеза в спленоцитах показала, что циклофосфан или доксорубицин супрессировали антителообразующую активность клеток: абсолютное число АОК и АОК на 106 спленоцитов снижалось в 3,2 и 2,2 раза соответственно по сравнению с контролем (n=8, p<0,05). Полученные результаты соответствуют известным данным литературы, свидетельствующим о супрессирующем действии противоопухолевых препаратов на функции В-лимфоцитов, связанные с повреждением ДНК и нарушением деления клеток (, Формин Дж. К., 1998). Применение циклофосфана и доксорубицина с настоем сбора растений приводило к увеличению содержания АОК. Так, абсолютное число АОК увеличивалось в 2,8 и 2,4 раза, АОК на 106 спленоцитов – в 2,6 и 2,2 раза соответственно, а применение глутоксима (препарат сравнения) с цитостатиками – в 2,5, 2,7, 2,6 и 2 раза соответственно (n=8, p<0,05). Супрессия уровня антителогенеза сопровождалась угнетением морфофункциональной активности лимфоидных органов. Так, введение циклофосфана и доксорубицина вызывало снижение относительных масс тимуса и селезенки на 36% и 31% и на 36% и 25% соответственно. Применение циклофосфана и доксорубицина с настоем сбора растений способствовало увеличению массы лимфоидных органов по сравнению с действием цитостатика (рис. 2). Цитопротекторные эффекты настоя сбора растений превосходили эффекты глутоксима: циклофосфан+глутоксим увеличивал массу тимуса и селезенки на 37% и 25%, а доксорубицин+глутоксим – на 67% и 25%.

Рис. 2. Влияние цитостатиков и настоя сбора растений (2:2:1) на массу тимуса и селезенки.

1 – Контроль; 2 – циклофосфан; 3 – доксорубицин; 4 – настой сбора растений; 5 – циклофосфан + настой сбора растений; 6 – доксорубицин + настой сбора растений; 7 – глутоксим; 8 – циклофосфан + глутоксим; 9 – доксорубицин + глутоксим. * – p<0,05 (n=8) по сравнению с негативным контролем; х – то же самое по сравнению с позитивным контролем.

Исследование развития реакции Артюса – иммунологической реакции, лежащей в основе развития воспаления, показало, что введение противоопухолевых препаратов вместе с сенсибилизирующей дозой ПАФ приводит к увеличению числа язв в основании хвоста мышей-гибридов линий (CBAxC57BL/6)F1 после введения разрешающей дозы ПАФ. Язвы в основании хвоста, как и в контроле (мыши, получавшие сенсибилизирующую и разрешающую дозу ПАФ), появлялись на 3 сутки. Введение доксорубицина приводило к увеличению числа язв (в 60% случаев) и площади поражения кожных покровов, доходящей до 16,9 мм2 по сравнению с контролем, где язвы наблюдались в 20% случаев, а площадь язв составляла 10,5 мм2. Циклофосфан, в отличие от доксорубицина, приводил не только к появлению язв в основании хвоста (40% случаев), но и к отеку голеностопных суставов (25% случаев). Диаметр суставов увеличивался до 5,0±0,3 мм по сравнению с 2,5±0,2 мм у интактных мышей, что может свидетельствовать о срыве реакций иммунологического контроля. Применение вместе с противоопухолевыми препаратами настоя сбора растений отодвигало сроки появления язв на 7 сутки после введения разрешающей дозы ПАФ, уменьшало количество животных с язвами в основании хвоста (16,7% случаев в группах мышей, получавших циклофосфан, и 40% случаев – доксорубицин) и приводило к уменьшению площади язв (6,5 мм2 при применении настоя сбора растений с циклофосфаном, 15,3 мм2 – с доксорубицином) и снижению глубины кожных поражений (наблюдались только поверхностные язвы), что сравнимо с действием цитостатиков при использовании их с глутоксимом (7,8–8,0 мм2). Полученные данные свидетельствуют о противовоспалительных и репаративных свойствах настоя сбора растений, способствующих ускорению заживления ран и снижению воспаления, вызванного цитостатиками.

Изучение изменений в количественном содержании форменных элементов крови у крыс, которые получали цитостатики с настоем сбора растений. Известно, что картина крови при цитостатическом синдроме характеризуется выраженным снижением количества всех форменных элементов крови вследствие гипоплазии кроветворной ткани (, 1999). Собственные данные подтверждают, что введение циклофосфана (100 мг/кг) или доксорубицина (10,5 мг/кг) приводит к существенному снижению количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов крови по сравнению с крысами, не получавшими препараты (интактные крысы) (рис. 3).

Рис 3. Влияние циклофосфана (а) или доксорубицина (б) в комбинации с настоем сбора растений (2:2:1) на количество эритроцитов (1012/л), лейкоцитов (109/л), тромбоцитов (109/л).

Циклофосфан – 100 мг/кг, Доксорубицин – 10,5 мг/кг. 1 – Контроль; 2 – цитостатик; 3 – цитостатик+настой сбора растений; 4 – цитостатик+глутоксим. * – p <0,05 (n=5) по сравнению с негативным контролем; х – то же самое по сравнению с позитивным контролем.

Применение настоя сбора растений одновременно с циклофосфаном приводило к увеличению количества лейкоцитов на 37% (14 сутки) и эритроцитов – на 38% (7 сутки), а уровень тромбоцитов не достигал нормальных физиологических значений. При применении настоя сбора растений с доксорубицином возрастало количество лейкоцитов на 53% (14 сутки) и тромбоцитов – на 49% (1-28 сутки), а эритроцитов – практически не изменялось. Введение цитостатика с глутоксимом приводило к увеличению числа лейкоцитов на 14 сутки на 44% (циклофосфан) и 47% (доксорубицин), и мало влияло на эритропению и тромбоцитопению, вызванную цитостатиками.

Анализ гемограммы показал, что введение циклофосфана или доксорубицина сопровождалось увеличением количества нейтрофилов и уменьшением числа лимфоцитов и характеризовалось сдвигом лейкоцитарной формулы влево – появлялись миелоциты и юные нейтрофилы (7 сутки). Введение циклофосфана или доксорубицина с настоем сбора растений приводило к увеличению количества эозинофилов, зрелых форм нейтрофилов, снижая содержание их незрелых форм. Применение цитостатиков с глутоксимом оказывало менее существенное влияние на эти параметры.

Оценка изменений проницаемости мембран эритроцитов у животных, которые получали цитостатики с настоем сбора растений. Результаты исследования показали, что введение циклофосфана в дозах 100 и 200 мг/кг или доксорубицина в дозах 10,5 и 12 мг/кг усиливало гемолиз эритроцитов, вызываемый мочевиной (40% раствор), который в 1,8 и 1,6 раз, 1,4 и 2,2 раза соответственно превышал данные негативного контроля (рис. 4).

Рис. 4. Влияние циклофосфана или доксорубицина в комбинации с настоем сбора растений (2:2:1) на гемолиз эритроцитов, вызываемый различными концентрациями мочевины.

По горизонтали – процентное содержание 0,3 М раствора мочевины; по вертикали – оптическая плотность гемолизата эритроцитов. А и Б – циклофосфан в дозах 100 и 200 мг/кг, В и Г – доксорубицин в дозах 10,5 и 12 мг/кг соответственно. 1 – Контроль; 2 – цитостатик; 3 – цитостатик+настой сбора растений. * – p <0,05 (n=5) по сравнению с негативным контролем; х – то же самое по сравнению с позитивным контролем.

Совместное введение настоя сбора растений с циклофосфаном в дозе 100 мг/кг уменьшало гемолиз эритроцитов в 4 раза, а при введении с доксорубицином в дозе 10,5 мг/кг или циклофосфаном в дозе 200 мг/кг - в 1,4–1,6 раза. Напротив, увеличение дозы доксорубицина до 12 мг/кг приводили к тому, что появлялась обратная зависимость степени гемолиза от концентрации мочевины в растворах. Известно, что при тяжелых инфекционных заболеваниях, сопровождающихся повреждением различных органов и тканей, наблюдается переход от высокой проницаемости мембраны к патологическому её уплотнению ( и др., 2000). Можно предположить, что аналогичные изменения вызывает доксорубицин.

Оценка антиоксидантной защиты настоем сбора растений связана с тем, что важным звеном токсического действия цитостатиков является нарушение ферментного гомеостаза клеток и стимуляция перекисного окисления липидов свободнорадикальными группировками, приводя к нарушению структуры и функций клеток ( и др., 2004; , 2003). Собственные данные показали, что введение в высоких дозах циклофосфана (200 мг/кг) или доксорубицина (12 мг/кг) приводит к срыву антиоксидантной системы, о чем свидетельствует существенное снижение активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), сопровождающееся повышением содержания малонового диальдегида (МДА). Концентрация МДА повышалась через 24 часа после введения противоопухолевых препаратов (рис 5). Срыв антиоксидантной защиты, вызванный высокими дозами цитостатиков, сохранялся в течение 28 суток. Введение противоопухолевых препаратов в среднеэффективных дозах (для циклофосфана – 100 мг/кг, доксорубицина – 10,5 мг/кг) также приводило к существенному снижению активности каталазы, СОД и повышению концентрации МДА, в большей степени выраженному при введении доксорубицина. Восстановление антиоксидантной защиты происходило на 28 сутки после введения цитостатиков. Эффекты настоя сбора растений были сравнимы с эффектами глутоксима.

Рис. 5. Влияние циклофосфана или доксорубицина в комбинации с настоем сбора растений (2:2:1) на состояние антиоксидантной системы.

а– циклофосфан в дозе 200 мг/кг, б – доксорубицин в дозе 12 мг/кг.1 – Контроль; 2 – цитостатик; 3 – цитостатик+настой сбора растений; 4 – глутоксим+цитостатик. * – p<0,05 (n=5) по сравнению с негативным контролем; х – то же самое по сравнению с позитивным контролем.

Определение сульфгидрильных групп. Анализ данных показал, что при введении противоопухолевых препаратов происходит снижение количества сульфгидрильных групп белков (T-SH групп) в плазме крови. Уровень T-SH групп снижался (14 сутки) в 1,6 и 2,3 раза (n=5, p<0,05) при введении циклофосфана в дозах 100 и 200 мг/кг и в 2,2 и 2,8 раза (n=5, p<0,05) – при введении доксорубицина в дозах 10,5 и 12 мг/кг по сравнению с негативным контролем. Применение противоопухолевых препаратов с настоем сбора растений или глутоксимом приводило к менее выраженному угнетению количества T-SH. Через 24 часа после введения высокой дозы циклофосфана (200 мг/кг) и настоя сбора растений количество T-SH групп увеличивалось в 2,5 раза (n=5, p<0,05), а при введении его с глутоксимом – в 2 раза (n=5, p<0,05) по сравнению с введением одного цитостатика. Введение доксорубицина в дозах 10,5 мг/кг и 12 мг/кг с настоем сбора растений увеличивало уровень T-SH в 1,6 и 1,8 раза на 14 сутки (n=5, p<0,05), а при применении с глутоксимом – в 1,7 раз (n=5, p<0,05) по сравнению с действием самого цитостатика. На 28 сутки после введения препаратов с настоем сбора растений количество T-SH-групп белков соответствовало базальному уровню, что может дополнительно свидетельствовать о восстановлении функций анитиоксидантной системы.

Содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), являясь биохимическим маркером крови, может, как известно ( Дж., 2000), свидетельствовать о повреждающем действии цитостатиков на органы (печень, сердце и др.). В данном исследовании было показано, что введение циклофосфана в дозах 100 и 200 мг/кг приводит к повышению активности АЛТ в 1,2 и 1,4 раза (n=5, p<0,05), а введение доксорубицина в дозах 10,5 и 12 мг/кг – в 1,2 и 1,7 раза (n=5, p<0,05) соответственно. Активность Аст возрастала в 1,6 раз (n=5, p<0,05) при применении циклофосфана в дозе 200 мг/кг, но не дозе 100 мг/кг, а при применении доксорубицина – в 1,3 раза (n=5, p<0,05) как в дозе 10,5 мг/кг, так и в дозе 12 мг/кг. Применение циклофосфана в дозах 100 и 200 мг/кг с настоем сбора растений или глутоксимом приводило к снижению активность АЛТ в 1,2–1,5 раза, а АСТ в 1,3–1,4 раза (n=5, p<0,05) соответственно по сравнению с действием самих цитостатиков. При применении доксорубицина в дозе 10,5 мг/кг с настоем сбора растений или глутоксимом активность ферментов приближалась к физиологической норме. Увеличение дозы доксорубицина до 12 мг/кг и применение его с корректорами токсичности противоопухолевых препаратов приводило к снижению активности АСТ в 1,6–1,7 раз (n=5, p<0,05).

Активность ЛДГ в основном повышалась через 24 часа при введении циклофосфана в дозе 200 мг/кг, но не в дозе 100 мг/кг, а доксорубицина – в дозах 10,5 и 12 мг/кг. Настой сбора растений и глутоксим в 1,5 раза и 2 раза (n=5, p<0,05) снижали уровень ЛДГ, увеличенный введением противоопухолевых препаратов. К 28 суткам после введения настоя сбора растений с цитостатиком активность ЛДГ соответствовала базальному уровню фермента в периферической крови.

Определение общего белка. Известно, что применение противоопухолевых препаратов приводит к гипопротеинемии (максимально снижается в 1,6 раз) вследствие повреждения мембран клеток свободными радикалами, угнетения синтеза белка и связывания метаболитов цитостатиков с транспортными белками (, 2004). Из данных работы следует, что настой сбора растений увеличивал количество общего белка в плазме крови в 1,2 раза (n=5, p<0,05), что было сопоставимо с действием глутоксима.

Таким образом, полученные результаты показывают, что настой сбора растений, не обладая токсичностью, оказывает токсикомодифицирующее действие на эффекты противоопухолевых препаратов, снижая их повреждающее влияние на лимфоидные органы (тимус, селезенка), усиливая иммунную систему (оказывает иммуномодулирующий эффект), также снижая их цитотоксическое действие на нормальные ткани внутренних органов (печень, почки и другие), следствием чего является усиление физической устойчивости и работоспособности. Настой сбора растений, проявляя выраженный противовоспалительный эффект, по-видимому, снижает уровень некроза нормальных тканей, инициированный введением противоопухолевых препаратов, усиливает антиоксидантную защиту клеток крови в ответ на воздействие цитостатиков, параллельно снижая содержание МДА, предупреждая повреждение мембран эритроцитов и распад собственных белков организма. Полученные результаты показывают возможность включения настоя сбора растений в противоопухолевую химиотерапию.

ВЫВОДЫ

1.  Введение циклофосфана или доксорубицина с настоем сбора растений из листьев подорожника большого, цветков календулы лекарственной и листьев крапивы двудомной в соотношении 2:2:1, как и введение антигипоксантов гутимина или триметазидина, ослабляет гипоксию, что имеет существенное значение для снижения проявлений цитостатического синдрома.

2.  Настой сбора растений обладает адаптогенными свойствами и в таком качестве может являться адекватным компонентом, приводящим к увеличению устойчивости к стрессу и повышению физической выносливости в течение лечения злокачественных опухолей, существенно превосходя эффекты препарата фолигина.

3.  Настой сбора растений, снижая инволюцию тимуса и селезенки, вызванную циклофосфаном или доксорубицином, нормализует уровень антителогенеза в спленоцитах и количество антител в плазме крови, ограничивает развитие реакции Артюса, усиливая репарацию, оказывает выраженное гепатопротекторное действие, что может приводить к снижению воспаления и катаболических процессов, вызванных опухолью и цитостатиками.

4.  Настой сбора растений снижает лейкопению, связанную с введением противоопухолевых препаратов, нормализует соотношение лейкоцитов крови, снижая появление миелоцитов и юных форм нейтрофилов, увеличивая зрелые формы нейтрофилов, предупреждая повреждающее действие циклофосфана или доксорубицина на мембраны клеток.

5.  Применение настоя сбора из подорожника большого, календулы лекарственной и крапивы двудомной вместе с циклофосфаном или доксорубицином эффективно в повышении активности супероксиддисмутазы и каталазы – маркеров антиоксидантной защиты клеток, в снижении концентрации малонового диальдегида – показателя накопления продуктов пероксидации липидов, что важно для предупреждения окислительного стресса, инициированного противоопухолевыми препаратами.

6.  Настой сбора растений с цитостатиками, снижая в плазме крови активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы – ферментов, свидетельствующих о повреждении тканей, ослабляет токсическое действие противоопухолевых препаратов.

7.  Настой сбора растений в дозах 5 – 10 мл/кг оказывает токсикомодифицирующее действие на эффекты противоопухолевых препаратов, приводя к увеличению порога токсичности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  , Нежинская снижения цитотоксичности противоопухолевых средств на нормальные ткани сбором растений // Раст. ресурсы.– 2008.– Вып.1.– С. 130-136.

2.  , Нежинская иммунотоксичности цитостатиков настоем сбора лекарственных растений // Раст. ресурсы. – 2008.– Вып.3.– С.133-139.

3.  , , Шепелева холинотропных и цитостатических препаратов в развитии реакции Артюса // Бюл. экспер. биол. и мед. – 2008.– Т. 146, № 12. – С.654-656.

4.  , Нежинская антигипоксанты как корректоры осложнений противоопухолевой терапии // Тез. 4-ой Российской конф. «Гипоксия; механизмы, адаптация, коррекция». – М., 2005.– С.121.

5.  , Нежинская цитостатика с комплексом растительных антигипоксантов на систему иммунитета // Тез. докл. ХIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 2006.– С.412

6.  , Нежинская коррекции побочных эффектов цитостатиков с помощью растительных гистопротекторов // Сб. тез. к научно-практической конф. молод. ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – СПб., 2006.– С.228.

7.  , Нежинская адаптогенных свойств растительных антигипоксантов при применении цитостатиков // Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» к 60-летию технологического факультета СПХФА: сб. науч. тр. – СПб., 2005.– С.178-180.

8.  Шепелева лекарственных растений на систему антиоксидантной защиты и показатели крови при применении циклофосфана // Науки о человеке: матер. VII конгресса молод. ученых и специалистов / под ред. , . – Томск, 2006.– С.141-142.

9.  , Нежинская гематологических нарушений при воздействии доксорубицина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2007.– Вып. 62. – С. 577-579.

10.  Шепелева снижения цитотоксического действия противоопухолевых средств на нормальные ткани // Тез. докл. региональной конф. студентов и аспирантов «Молодые ученые – практическому здравоохранению 18-19 апреля 2007г.» – СПб., 2007.– С. 63-64.

11.  , , Сапронов агонистов Н-холинорецепторов и цитостатика при гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) // Матер. III съезда фармакологов России. «Фармакология – практическому здравоохранению» Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 года, часть 2. – СПб., 2007.–С. 1889.

12.  , Нежинская корректоров токсичности цитостатиков на развитие реакции Артюса // Тез. докл. ХV Российского национального конгресса «Человек и лекарство».– М., 2008.– С.388.

13.  , Нежинская проницаемости мембран эритроцитов при действии настоя сбора растений в комплексе с противоопухолевыми препаратами // Тр. научно-практической конф. 25 апреля 2008 «Фармация из века в век». Часть V. Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования.– СПб, 2008. – С. 188-191.

14.  Шепелева нарушений картины белой крови при применении доксорубицина // Тез. V конф. молод. ученых России с междунар. уч. 19-22 мая: "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Приложение к журн. «Вестник Российской Академии медицинских наук».– М., 2008. – №6.– С.483.

Печать

Подписано к печати 09.04.2009. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф.

Гарнитура «Таймс». Печ. л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 777

Санкт-Петербург 2009