Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицин­ские учреждение лица

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Бактериоскопический метод является простым и экономичным способом, позволяющим при положительном результате исследования мазка мокроты установливать диагноз туберкулеза легких.

Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицин­ские учреждение лица:

— с явными симптомами заболевания;

— с наличием продолжительного (более 3-х недель) кашля, сопровождаю­щегося выделением мокроты, мокроты с кровью и болью в груди;

— контактировавшие с больными, имеющими положительный результат бактериоскопического исследования и соответствующие симптомы заболева­ния;

— имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные в отношении туберкулеза. /

2. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИСЛОУСТОЙЧИВЫХ МИКОБАКТЕРИЙ

Присутствие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом материале может быть установлено при микроскопическом и/или культуральном исследовании. При микроскопическом исследовании мазка из патологического материала нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий и специфически идентифицировать возбудитель туберкулеза.

Возможно дать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчи­вых микроорганизмов.

Это объясняется тем, что в природе существует большое число микроскопически неотличимых от Mycobacterium tuberculosis нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобакте-риозы.

Идентификация микобактерий возможна только при выделении из клинического материала культуры микобактерий.

3. ОРГАНИЗАЦИЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОЛЬНЫХ

Областные отделы здравоохранения организуют выявление больных тубер­кулезом легких бактериоскопическим методом в следующих учреждениях:

— научно-исследовательских институтах медицинского профиля;

— областных, городских и центральных районных больницах;

— взрослых и детских поликлиниках;

— участковых больницах;

— сельских врачебных амбулаториях;

— психиатрических и наркологических больницах;

— санаториях;

— тюрьмах.

4. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫЕ МИКОБАКТЕРИЙ.

Чтобы обнаружить микобактерий туберкулеза при проведении микроскопии, в 1 мл мокроты должно содержаться от 5 000 домикробных клеток. В мокроте пациентов с легочными формами туберку­леза (особенно при наличии у больных полостей распада легочной ткани) обычно содержится значитель­ное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет выявить их при бактериоскопии. Чувстви­тельность этого метода можно повысить, если просматривать несколько мазков от одного пациента. Ре­зультаты многочисленных исследований показали, что изучение двух мазков позволяет распознавать более 90% случаев бациллярных форм туберкулеза. Было установлено, что при серийных исследованиях результативность бактериоскопической диагностики легочного туберкулеза повышается следующим образом: при исследовании одного мазка - 80-83%, второго мазка - на 10-14% больше и при исследовании третьего мазка - еще на 5-8% больше. Таким образом, при подозрении на легочную форму туберкулеза рекомендуется проводить бактериоскопию трех мазков мокроты.

5. ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОЧЕГО МЕСТА И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Оптимальные результаты микроскопического исследования достигаются при использовании - маз-приготовленных из осадка диагностического материала. Осадок предсьавляет собойобогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результа­ты. Основным правилом микробиологического исследования является проведение микроскопии парал­лельно с культуральным исследованием из одного полученного образца. Детальное описание приготов­ление мазков из осадка материала приводится в Части 3 данного руководства.

Наилучшие результаты микроскопии достигаются при использовании люминесцентных красителей. Однако метод люминесцентной микроскопии для исследования нативной мокроты не применяет­ся.

План МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

В лабораториях, функции которых ограничены только микроскопическим исследованием окрашенных по Цилю-Нильсену мазков из нативного материала применяется световая микроскопия. Бактериоско­пическое исследование на туберкулез должно проводиться в отдельной комнате с соблюдением правил безопасности и поточности движения и обработки материала. В объединенных клинико-диагностических лабораториях для бактериоскопических исследований на туберкулез должно выделяться отдельное про­сторное помещение. Стены, потолки и полы должны быть покрыты гладким, не адсорбирующим материа­лом, который можно легко мыть и дезинфицировать. Кроме того, он должен быть устойчив к химическим реактивам, используемым в лаборатории. Пол не должен быть скользким; необходимо достаточное ос­вещение. Как представлено на рисунке 1, в помещении для бактериоскопии должно быть четыре зоны:

• зона для приема исследуемых образцов, заполнения лабораторного журнала и хранения об­разцов;

• хорошо освещенное место для приготовления и окраски мазков;

• специальное место для микроскопии;

• место для регистрации результатов исследований.

Всего в данном помещении должно быть no-крайней мере 2 раковины и четыре стола (Рис.1)

Рисунок 1.

План микроскопической лаборатории I. Зона для приема и регистрации диагностического материала:

1 .Окно для приема образцов

2.Рабочий стол для регистрации поступающих образцов

II. Зона для для приготовления и окраски мазков:

З. Окно;

4. Стол для приготовления мазков (желательно под вытяжкой или в боксе с наличием вытяжного устройства);

4. Стол для приготовления мазков (желательно под вытяжкой или в боксе с наличием вытяжного устройства);

5. Контейнер для отработанных материалов;

6. Лабораторная раковина для окрашивания мазков; 7. Вспомогательный рабочий стол для сушки мазков

III. Рабочее место для микроскопии

8. Стол для микроскопии

9. Раковина для мытья рук

IV. Место для регистрации результатов исследований

10. Стол для учета результатов исследований

11. Рабочий стол и весы

12. Контейнер для отработанных материалов

13. Шкаф для посуды и реактивов.

6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Перед началом работы оборудование и материалы необходимо разместить так, чтобы в дальней­шем было удобно работать.

Все манипуляции по приготовлению мазков должны быть стандартизованными, а для максималь­ной безопасности все материалы и реагенты всегда должны находиться на одних и тех же постоянных местах.

Для приготовления мазков необходимы:

• Флаконы с собранной мокротой

• Бактериологическая петля диаметром 3 мм для забора сгустков мокроты и распределения их по стеклу или деревянные палочки

• Одноразовые предметные стекла(обезжиренные и без царапин)

• Маркировочный карандаш для нанесения идентификационного номера на стекло

• Пинцет

• Емкость с отмытым речным песком, залитым спиртом (95о) или лизолом (колба, эксикатор и т. д.) для очистки бактериологической петли перед стерилизацией в пламени горелки

• Спиртовка или газовая горелка Бунзена для фиксации и окрашивания препаратов, прокалива­ния петли

• Контейнеры для сбора и последующего уничтожения использованного материала. Для окрашивания мазков необходимы:

• Штатив для окраски предметных стекол

• Пинцет

• Штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе

• Краска Циля-Нильсена для окрашивания кислотоустойчивых бактерий

3% спиртовой раствор соляной кислоты или 20-25% раствор серной кислоты для обесцвечива­ния окрашенных мазков

0,3% раствор метиленового синего для докрашивания обесцвеченного мазка Фильтровальная бумага Вода для промывания мазков

Газовая или спиртовая горелка для подогревания препарата.

7. РЕЖИМЫ И КРАТНОСТЬ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ

Режимы и кратность лабораторного обследования для выявления микобактерий могут значительно варьировать от клинического состояния и формы процесса, этапа наблюдения больного и целей самого исследования (верификация специфической природы заболевания, определение степени активности процесса, динамическое наблюдение за эффективностью лечения, этапная проверка групп диспансерного наблюдения и др.) При первом обращении больного к врачу с симптомами, подозрительными на туберкулез, необходимо в течение последующих 2-х или 3-х дней исследовать не менее 3-х порций мокроты, собранных под наблюдением медицинского персонала.

8. СБОР ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

В данной главе приводятся основные правила сбора диагностического материала при проведении первичного скрининга по выявлению туберкулеза среди лиц, обращающихся за медицинской помощью с респираторными и. или интоксикационными жалобами, либо характерными для туберкулеза симптомами («выявление по обращаемости»),а также при активном обследовании лиц, входящих в группы риска по заболеванию туберкулезом.

Первичный скрининг туберкулеза должен осуществляться всеми лечебно-диагностическими учре­ждениями системы здравоохранения и включать оценку клинической симптоматики и анамнеза пациента, микроскопическое исследование мокроты ( при ее наличии) или другого диагностического материала и лучевое обследование.

При положительных или сомнительных результатах первичного скрининга больной направляется в противотуберкулезное учреждение для подтверждения или исключения диагноза туберкулеза более со­вершенными методами диагностического исследования.

Необходимо подчеркнуть, что правила сбора диагностического материала для культуральных ис­следований существенно отличаются от правил сбора материала для микроскопии. Подробное изложение этих правил представлено в части 3 данного пособия.

Материал для исследования на микобактерии туберкулеза собирают в стерильные флаконы (кар­манные плевательницы) с плотно завинчивающимися крышками. Применение герметизированных фла­конов преследует двоякую цель:

— предотвращение просачивания содержимого и загрязнения окружающей больного среды чрез­вычайно стойкими к сризическим воздействиям микобактериями и

— предохранение сохраняющегося в флаконе исследуемого материала от загрязнения широко распространенными вегетирующими в окружающей среде кислотоустойчивыми микобактериями.

В связи с указанным флаконы для сбора качественного диагностического материала должны отве­чать ряду обязательных требований:

— должны быть изготовлены из ударостойкого материала, не допускающего просачивание жидко­сти; желательно, чтобы по возможности использовались контейнеры одноразового применения, изготов­ленные из горючего материала, легко поддающегося расплавлению при автоклавировании;

— иметь плотно завинчивающиеся или герметически закрывающиеся крышки;

— объем флаконов должен составлять мл, что вполне достаточно для проведения всех ви­дов исследований;

— иметь широкое отверстие для сбора мокроты (не менее 35 мм в диаметре), чтобы пациент мог легко сплевывать мокроту внутрь флакона, не подвергая загрязнению его наружную поверхность;

— флаконы должны быть изготовлены из прозрачного материала, чтобы можно было оценить ко­личество и качество собранной пробы, не открывая крышку;

— материал, из которого изготовлены флаконы, должен легко подвергаться маркировке и надежно сохранять ее на всем протяжении хранения, транспортировки и проведения исследования;

При отсутствии возможности использовать одноразовые флаконы можно применять традиционные для России толстостенные бутылочки из темного стекла (карманные плевательницы многоразового поль­зования),простерилизованные, тщательно вымытые, и повторно простерилизованные. В таких случаях во избежание лабораторного загрязнения диагностического материала лаборатория должна постоянно сле­дить за качеством мытья и стерилизации плевательниц.

Для получения оптимальных результатов при исследовании клинических материалов необходимо соблюдать следующие условия:

— при исследовании мокроты желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты в течение 3 следующих один за другим дней, что существенно повышает результативность исследования;

— собранный материал необходимо как можно быстрее доставить

— в лабораторию; в случае невозможности немедленной доставки материал сохраняется в холо­дильнике при 5 - 10°С не более 5 дней;

— при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за сохранностью флаконов.

9. СБОР МАКРОТЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сбор мокроты для исследования на микобактерии туберкулеза • весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкости проведения которого во многом зависит результат ис­следования. Необходимо также иметь в виду, что в момент откашливания больным мокроты создается очень высокий риск воздушно-капельного распространения инфекции. В связи с этим желательно, чтобы сбор мокроты производился в специально выделенном для этих целей отдельном хорошо вентилируемом помещении, оснащенном бактерицидными лампами и средствами дезинфекции или на открытом воздухе.

Сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии среднего ме­дицинского персонала. При этом лицам, ответственным за сбор мокроты, следует руководствоваться сле­дующими правилами:

1. Объяснить больному причины исследования и необходимость откашливать не слюну или носо­глоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей, что достигается в результате про­дуктивного кашля, возникающего после одного или нескольких глубоких вдохов. Необходимо также преду­предить больного, что он должен предварительно почистить зубы и прополаскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатки пищи, загрязняющие мокроту и затрудняющие ее обработку.

2. Участвующий в сборе мокроты медицинский работник в маске, резиновых перчатках и резиновом фартуке должен находиться за спиной больного. выбирая свое положение таким образом, чтобы направ­ление движения воздуха было от него - к больному. Медицинский работник должен открыть стерильный флакон для сбора мокроты, снять с него крышку и передать больному только данную часть флакона.

3. Стоя позади больного, следует рекомендовать ему держать флакон как можно ближе к губам и сразу же сплевывать в него мокроту по мере ее откашливания. Выделение мокроты усиливается после одного или нескольких глубоких вдохов.

4. По завершении сбора мокроты медицинский работник должен оценить ее количество и качество. Флакон с порцией мокроты достаточного объема (желательно не менее 3-5 мл), содержащей уплотненные или гнойные комочки без слюны, тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, маркируют и поме­щают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию.

Если же больной не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и в скудном количе­стве, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты следует дать больному отхаркивающее средство (мукалтин, бромгексин, амброксол и др.) или применить раздражающие ингаляции. Последние провоцируют усиление секреции бронхов, кашель и отделение мокроты. Собранный таким образом мате­риал не подлежит консервации. Приготовление мазков необходимо проводить вдень забора материала.

10. ХРАНЕНИЕ, КОНСЕРВАЦИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

При проведении бактериологических исследований одной из важнейших проблем является органи­зация сбора диагностического материала, его консервации и быстрой транспортировки в лабораторию. Наличие дефектов в каком-либо одном звене этих мероприятий может привести к резкому снижению ре­зультативности исследования.

Если в данном учреждении не проводятся микроскопические исследования для выявления кисло­тоустойчивых микобактерии, собранный диагностический материал должен централизованно доставлять­ся в лабораторию как можно скорее. В учреждениях, не имеющих собственной лаборатории, сбор мате­риала производится ежедневно в флаконы с консервантом. По окончании рабочего дня флаконы опеча­тываются и до момента отправки хранятся в опечатываемом и запирающемся холодильнике.

Консервация. Если до перевозки в лабораторию мокроту приходится хранить несколько дней, не­обходимо использовать химические методы консервации.

Согласно последним рекомендациям ВОЗ (1998), наиболее приемлемые результаты консервации достигаются при использовании одного

из 3-х следующих методов:

— смешать свежесобранную мокроту с равным объемом 1% цетилпиридин хлорида (cetilpyridinium chloride) в 2% растворе хлористого натрия. В этой смеси микобактерии сохраняют жизнеспособность в течение 1 недели, тогда как загрязняющая микробная флора погибает;

— добавить в свежесобранную мокроту безводный карбонат натрия из расчета 50 мг реагента на каждые 2 мл материала;

— если срок хранения материала до его доставки в лабораторию не превышает 24 часа, материал можно смешать с равным объемом 23% раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия.

В практике отечественной микобактериологии при сроке хранения материала до 5 дней использу­ется 10% водный раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия или 0,05-0,1% водный раствор хлоргексидина биглюконата синоним - пливасепт. Диагностический материал заливают двумя объемами консерванта и хранят при комнатной температуре. В день поступления материала в лабораторию консер­вированный материал центрифугируют и из осадка приготавливают мазки для световой или люминес­центной микроскопии.

Транспортировка. Во время транспортировки материал должен предохраняться от воздействия прямых солнечных лучей и тепла. Если транспортировка и хранение занимают не более 48 часов, мате­риал можно пересылать без консерванта. В летний период и в районах с теплым климатом консервация необходима, если транспортировка занимает более 24 часов. В условиях Крайнего Севера диагностиче­ский материал при длительной транспортировке может подвергаться воздействию значительных колеба­ний температуры. При этом необходимо учитывать, что допускается пересылка материала в заморожен­ном состоянии без консерванта. Однако ни в коем случае нельзя допускать повторное оттаивание и замо­раживание материала, так как это способствует снижению жизнеспособности микобактерии.

Для транспортировки материала рекомендуется пользоваться биксами или специальными транспортировочными ящиками с мягкими легко стерилизующимися прокладками на дне и с гнездами для фла­конов или пробирок. Флаконы или пробирки с диагностическим материалом должны быть плотно закупо­рены или снабжены завинчивающимися крышками. Мазки для микроскопического исследования транс­портируются в специальных планшетах.

Каждая проба материала должна быть снабжена соответствующей этикеткой, а вся партия - запол­ненным сопроводительным бланком (см. Приложение). Во избежание инфицирования бланка направле­ния желательно помещать его в чистый конверт. Категорически запрещается заворачивать флакон с ма­териалом в бланк направления, что необходимо объяснить больному.

На всех этапах сбора, оформления сопроводительных документов, хранения и транспортировки материала работники лаборатории должны проводить инструктаж лиц, непосредственно ответственных за сбор диагностического матtриала, контролировать его качество, правильность консервации и транспор­тировки и своевременность доставки в лабораторию.

При поступлении материала, не отвечающего вышеуказанным требованиям, а также при отсутст­вии направления и маркировки (этикетки) на флаконе с материалом он подлежит уничтожению с обяза­тельным извещением об этом учреждения, направившего материал.

Перечисленные вопросы находятся в компетенции руководителя лаборатории. На практике реализуются два принципа централизованной доставки материала, или\и мазков для микроскопического исследования:

— автотранспортом лаборатории "на себя" или

— автотранспортом обслуживаемого лабораторией учреждения "от себя".

В обоих случаях должен быть составлен график транспортировки материала, согласованный в обеих инстанциях. Водитель машины должен быть обучен правилам обращения с инфекционным мате­риалом.

График работы сотрудников лаборатории должен предусматривать прием, регистрацию и немед­ленную обработку доставленного машиной материала, а также выдачу взамен стерильной посуды и пр.

Перед отправлением транспортного средства, перевозящего материал, а также при приеме дос­тавленного материала в лабораторию обязательна проверка следующих положений:

— число доставленных в лабораторию флаконов с материалом должно соответствовать числу их, указанному в сопроводительном листе;

— идентификационный номер каждого флакона с материалом должен точно соответствовать но­меру маркировки, указанному в сопроводительном листе;

— в сопроводительном листе должны быть полностью указаны необходимые данные каждого па­циента.

— на сопроводительном листе должна быть указана дата отправки материала и подпись сотрудни­ка, ответственного за отправку.

11. ПРАВИЛА РАБОТЫ С ДИАГНОСТИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ

ПОЛУЧЕНИЕ ПОСТУПАЮЩИХ ПРОБ

Поступающие пробы для исследования принимают на отдельном столе, следуя следующим инст­рукциям:

Прием поступающих проб и их осмотр следует, по возможности, проводить в одноразовых перчатках.

• Проверьте, нет ли на поверхности флакона следов протечки материала. Если имеются призна­ки интенсивной протечки, уничтожьте этот флакон (автоклавирование или сжигание).

• Продезинфицируйте транспортный контейнер, протерев наружную его поверхность тампоном, смоченным соответствующим дезинфектантом (например, 5% раствором хлорамина)

• Аккуратно откройте крышку и проверьте целостность флаконов с материалом. Ни в коем слу­чае не используйте поврежденные флаконы (разбитые или с трещинами) - уничтожьте их или автоклавируйте и запросите новый образец.

• Проверьте наличие идентификационных номеров на этикетках и сверьте их с номерами в со­проводительных документах.

• Занесите в лабораторный журнал сведения о каждом пациенте и полученном от него материа­ле.

Продезинфицируйте внутреннюю поверхность транспортного ящика, а после работы с флако­нами выбросите одноразовые перчатки и вымойте руки.

12. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С МАТЕРИАЛОМ

M. tuberculosis передается аэрогенным путем, вместе с аэрозольными частицами диаметром 1-5 мкм, которые достаточно малы, поэтому легко проникают в легочные альвеолы и вызывают инфекцию. Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения необходимо свести к минимуму возможность образования аэрозолей. Для защиты лабораторных работников от инфицирующих частиц необходима хорошая вентиляция.

Оптимальным является приготовление мазков под вытяжкой или в боксе с наличием вытяжного устройства. Аэрозоли могут образовываться во время открывания флаконов с материалом и во время приготовление мазков.

Основными источниками образования таких аэрозолей в лабораториях являются манипуляции, ко­торые связаны с приготовлением мазков для бактериоскопии. К ним относятся следующие манипуляции:

1. открывание флаконов с материалом; эта манипуляция особенно опасна, если между наруж­ной стенкой горлышка флакона и внутренней поверхностью крышки находятся частицы высохшей мокро-ты или если непосредственно перед открыванием флакон подвергался встряхиванию;

2. приготовление мазков путем нанесения материала на предметное стекло и распределение его по поверхности стекла;

3. прожигание бактериологических петель, используемых для переноса материала на стекло.

4. попытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала.

При выполнении этих манипуляций следует соблюдать особую осторожность.

13. КАЧЕСТВЕННОЕ ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА

Выбрать небольшую порцию от мокроты выбирая комочки гноя. Иногда эти комочки трудно отделимы от мокроты. Нельзя встряхивать контейнеры с мокротой перед приготовлением мазка так как это умень­шает возможность обнаружения КУБ.

Используя петлю берём одну порцию мокроты. Мокроту следует размазывать на предметном стекле спиралеобразным движением равномерно площадью на 2-3 см. Нельзя готовить мазок с большей площадью, чем 2x3 см, так как при этом возникает вероятность отрицательных результатов.

Если мазок размазывается прямолинейно или кругообразно, то толщина мазка будет не равномерной. Если толщина мазка тонкая, тогда можно добавить еще одну петлю мокроты. Так же надо помнить, что если мазок размазан толстым слоем, то трудно подсчитать КУБ.

Mycobacteria теряет способность краситься под действием солнечного луча, под бактерицидными лучами, при высокой температуре, поэтому во время размазывания мазка нужно избегать эти воздействий.

Приготовленный мазок сушить при комнатной температуре, нельзя высушивать на спиртовке. Спиртовку используют только для фиксации мазка.

М. tuberculosis (H 7 RV)
увеличенный в 14000 раз с
помощь электронного
микроскопа.

14. МИМ (Метод Циль-Нильсена)

Приготовление мазка 1-6

1.  Нумерация мазков

На предметное стекло записывают лаборатор­ный номер и номер исследования

2.  Размазывание мазка Проволочной петлей вы­бирают желтоватые час­тицы мокроты и разма­зывают равномерно пло­щадью 2x3 см. Петля должна быть диаметром 3 мм без царапин и дефектов.

3.  Очистка петли Частицы прилипшей мокроты удаляются с проволоки путем дви­жения его вверх и вниз в специальном сосуде с песком. В сосуд с пес­ком наливают 95% спирт и 5%-ый раствор лизола).

1.

4.  Стерилизация петли Простерилизовать петлю нужно держа в пламени спиртовки до тех пор, пока проволока не станет крас­ной.

5.  Высушивание и фиксация мазка Не применять пламя для высушивания. Приготов­ленные мазки должны су­шиться на воздухе. Для фиксации мазка провести его через пламя спиртовки в течение 3-5 секунд два-три раза.

6.  Расположение мазков Мазки на подставке рас­положить равномерно на определенном расстоянии друг от друга. На одной подставке разместить не более 9-ти мазков, они не должны прикасаться друг друга.

Окрашивание мазка 7-18.

7.  Окрашивание Покрыть всю поверхность мазков раствором карболо­вого фуксина Циля, что очень важно для равно­мерного окрашивания.

8.  Нагревание мазка Нагреть мазки снизу на пламени до образования пара. (Ни в ком случае нельзя доводить окраши­вающий раствор до кипе-чения или до высыхания). Подержать мазки в горячем испарении в течении 5 минут.

9.  Очистка от лишней краски Наклоняя мазки сливают лишнюю краску.

10.  Промывание мазка Окрашиванные мазки осторожно промыть в нежной струе проточ­ной воды.

11.  Высушивание мазка Наклоняя мазки сли­вать воду, и сушить на воздухе.

12.  Обесцвечивание Покрыть мазки 3% - ым раствором соляной кислоты 3-4 раза, после чего красный цвет должен исчезнуть.

13.  Промывание мазка Осторожно смыть водой соляную кислоту.

14.

15.

16.

17.

Высушивание мазка

Наклоняя мазки сли­вают промывную воду, и сушат на воздухе.

Дополнительное окра­шивание

Покрыть каждый мазок в отдельности 0.1%-ным раствором метиле-нового синего и дер­жать не менее 10 секунд.

Очистка от метилено-вого синего

Наклоняя мазки слить 0.1%-ый раствор мети-ленового синего.

Промывание мазка

Осторожно смыть водой 0.1%-ый раствор метиленового синего.

18.

Высушивание мазка

Сушить мазки на воздухе при комнатной температуре. Нельзя их ставить на солнечный свет. Оставить до полного высушивания.

Микроскопическое исследование 19-24.

19. Применение иммерсионного масла

Каплю иммерсионного мас­ла помещают на край предметного стекла. Иммер­сионный апликатор не дол­жен касатся предметного стекла во избежание его загрязнения КУБ-ами.

20. Чтение мазка

Туберкулезные бациллы при 1000 кратном увеличении на синем фоне выглядят, как красные палочки. (Приложение 5).

21. Подсчет мазков

Просмотреть 300 микрос­копических иммерсионных полей с каждого приго­товленного мазка. Резуль­таты записывают в ТВ 04.

В ходе копирования утеряны рисунки. С этой методикой можно ознакомиться в Учебном пособии «Диагностика туберкулеза методом микроскопии» Иркутск, 2009г. (Обращаться к ,

Морфологические характеристики кислотоустойчивых 

микобактерии при окраске по Цилю-Нильсену

§  Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза имеют в длину примерно 1-10 мкм; обычно они видны в виде тонких изящных палочек но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые палочки.

§  При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слег­ка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул; микроорга­низмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне.

§  Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окра­шивания, в результате чего они похожи на "бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде "полос".

§  Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к M. tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек до кокковых форм с различной интенсивностью окрашивания.

§  Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерии, но и у других микроорганизмов. Это могут быть различные виды Rhodococcus, Nocardia и Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora.

§  Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски (с час­тичной потерей кислотоустойчивой окраски — фиолетово-малинового цвета).

Причины ошибок при бактериоскопии по Цилю-Нильсену

— плохое качество или недостаточное количество исследуемого материала;

— плохая обработка многоразовых флаконов для, сбора материала, в которых могут оставаться микобактерии;

— неправильная маркировка флаконов;

— повторное использование предметных стекла после положительного предыдущего мазка;

— использование загрязненных бактериологических петель, пипеток или деревянных палочек;

— применение предметных стекол с царапинами и другими дефектами, в результате чего появля­ются артефакты, которые ошибочно могут быть приняты за микобактерии;

— использование непрофильтрованного раствора фуксина, содержащего кристаллы;

— недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к сохранению на некоторых сапро­фитных бактериях красной окраски;

— отсутствие маркировки на мазке, если она была повреждена или смыта при обесцвечивании;

— наличие микобактерии в иммерсионном масле, если иммерсионные линзы не очищались после положительных препаратов;

— неправильная регистрация результатов.

16. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВЫАНИЯ ПРИ ОКРАСКЕ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ

Количество микобактерий, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным информационным показателем, так как оно характеризует степень эпидемиологической опасно­сти больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно и количественным. Целесообразна следующая градация результатов све­товой иммерсионной микроскопии при использовании объектива 90х или 100х и окуляра 7х-10х:

— отсутствие кислотоустойчивых микобактерий (МБ) в 300 полях зрения — отрицательный результат;

— 1 - 3 МБ - в 300 полях зрения - отрицательный результат с рекомендацией повторного исследова­ния

— 1 - 9 МБ - в 100 полях зрения — положительный результат — единичные МБ в препарате с указани­ем числа;

—1МБ - в 100 полях зрения — положительный результат — единичные МБ в поле зрения (1+);

— 1 -10 в 1 поле зрения - положительный результат - умеренное количество МБ (2+);

— более 10 МБ - в поле зрения — значительное количество МБ (3+).

Таблица 2. Градация результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нильсену

Количество кислотоустой­чивых микобактерий (МБ)	Число иммерсионных полей зрения	Ответ
Качественный	Количественный
МБ отсутствуют	300	Отрицательный	0
1-3	300	Отрицательный	Рекомендуется повтор­ное исследование
От 1 до 9 МБ '	100	Положительный	Единичные в препарате с указанием числа МБ
От 10 до 99 МБ	100	Положительный	Единичные в поле зрения (1+)
От 1 до 10 МБ	1	Положительный	Умеренное количество (2+)
Больше 10 МБ	1	Положительный	Значительное количество (3+)

Приложение 2

Рецепт приготовления реагентов

Необходимые предметы и реактивы

1. Сухой фуксин, метиленовый синий

2. Соляная кислота (HCL)

3. Фенол

4. Дистиллированная вода

5. Спирт 90%

6. Весы, ложечка

7. Сосуд для растворов (Зшт)

8. Плитка, сосуд с водой

9. Пипетка с баллоном

Количество раствора

• Раствор Циля 1000 мл 500 мл 100 мл

а/ Основной раствор

Фуксин 3 гр 1.5 гр 0.3 гр
Спирт 96% 100 мл 50 мл 10 мл

Кристалики фуксина тщательно перемешать в спирте до полного их растворения.

б/ 5% раствор фенола

Жидкий фенол 50 мл 25 мл 5 мл
Дистиллированная вода 950 мл 475 мл 95 мл

Сосуд с фенолом помещают в кипяток до расплавления, и набирают с помощью пипетки с баллоном. Фенол добавляют в сосуд с водой по немногу.

в/ Раствор Циля

Основной раствор 100 мл 50 мл 10 мл
5% раствор фенола 900 мл 450 мл 90 мл

Бутылку с основным раствором хорошо встряхнуть и перемешать с 5% раствором фенола. Потом профильтрировать фильтровальной бумагой.

• 0.1%-ный раствор метиленового синего

1/ Дистиллированная вода 1000 мл 500 мл 3 мл
2/ Метиленовый синий 1 гр 0.5 гр 0.1 гр
Перемешать до полного растворения метиленового синего

• Раствор соляной кислоты

1/ Соляная кислота (чистая) 30 мл 15 мл 3 мл
2/ Спирт 96% 970 мл 485 мл 100 мл

- Осторожно каплями влить соляную кислоту на 96% спиртовой раствор. Ни в коем случае не лить спирт на соляную кислоту. На один мазок используется 5 мл раствор Циля, 10 мл 3% раствора соляной кислоты, 5 мл 0.1% раствора метиленового синего. На данном основании рассчитывают и контролируют снабжение реактивами.