ФИДАРОВА АЛАНА МИХАЙЛОВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНО–МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
НА ФОНЕ ГИПОКАЛЬЦИЕМИИ
14.00.16 – ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
ВЛАДИКАВКАЗ – 2008
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель: доктор медицинских наук
ДЖИОЕВ Инал Германович
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор
САЛБИЕВ Казбек Дахцикоевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
ДЗУГКОЕВА Фира Соломоновна
доктор медицинских наук, профессор
ОВСянников Виктор Григорьевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Защита состоится 10 февраля 2009 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 при ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» ( 0).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Автореферат разослан «____» __________ 2009г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Почечная недостаточность, несмотря на значительные достижения в изучении этиологии и патогенеза, профилактики и лечения, продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медицинских проблем (, , 1997; , 2000; , 2007; Nangaku M., 2004; Spoto B., 2007). Ни мало важными остаются осложнения, возникающие при почечной недостаточности, такие как эритропоэтин-дефицитная анемия и гипокальциемия (, , 2001; , , 2003; 2005; Vaziri N. D., 2001).
Однако, несмотря на это, в научной литературе практически нет однозначных сведений о влиянии возникающей при почечной недостаточности гипокальциемии на функциональное и морфологическое состояние почек и на эритропоэз. По поводу последнего отметим, что одни исследователи не выявляли какого-либо угнетающего влияния гипокальциемии на эритропоэз (Zevin D., Levi J., Bessler H., 1991), а другие наблюдали его лишь только при стойкой хронической гипокальциемии (Urena P., Bererhi L., Houhou S., et al., 1995).
С учетом того, что кальций является одним из наиболее значимых для человека и животных неорганических элементов, участвующим в регуляции большинства процессов жизнедеятельности, можно предположить, что его недостаточное содержание должно приводить к серьезным нарушениям, в том числе к изменениям структуры и функции почек ( 1999; 2000).
Поэтому существует необходимость более детального, в данном случае экспериментального, изучения влияния гипокальциемии на течение почечной недостаточности, что и позволило нам выявить и сформулировать очевидную актуальность исследуемой проблемы.
В связи с этим целью настоящего исследования было изучение влияния экспериментальной гипокальциемии на функциональное и морфологическое состояние почек, а также на некоторые гематологические показатели у крыс при почечной недостаточности.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
I. Создать на крысах экспериментальные модели почечной недостаточности (1), гипокальциемии (2) и почечной недостаточности на фоне гипокальциемии (3).
II. Исследовать при всех экспериментальных моделях:
· содержание общего белка в моче и плазме крови;
· морфологическое и морфометрическое состояние почек;
· определить содержание гемоглобина, количество эритроцитов и гематокрит как показателей влияния на эритропоэз;
· влияние на водовыделительную функцию почек в условиях водного и спонтанного диуреза, с изучением основных процессов мочеобразования, а для объяснения обнаруженных механизмов – изучить состояние электролитно-мочевинного профиля слоёв ткани почек;
· влияние на электролитовыделительную функцию почек в условиях водного и спонтанного диуреза, с изучением содержания в крови натрия, калия, кальция и фосфора, а также показателей их обработки в почках (экскреция, фильтрационный заряд, реабсорбция).
Научная новизна состоит в том, что впервые создана на крысах экспериментальная глицероловая модель почечной недостаточности на фоне гипокальциемии, вызванной удалением паращитовидных желёз и изучены изменения водо - и ионовыделительной функции почек, а также вскрыты некоторые механизмы обнаруженных изменений. Впервые выявлено усугубляющее влияние гипокальциемии на степень протеинурии, имеющейся при почечной недостаточности. Впервые показано усиливающее влияние гипокальциемии на характерные для почечной недостаточности патогистологические изменения почек. Впервые установлено усиление и ускорение угнетающего влияния почечной недостаточности на количество эритроцитов и содержание гемоглобина на фоне гипокальциемии.
Научно-практическая значимость. Исследования носят экспериментальный характер, а полученные результаты относятся к области фундаментальных знаний, так как расширяют представления и дают новые знания о возможном влиянии нарушения обмена кальция на механизмы регуляции водно-солевого гомеостаза, функции почек и состояние эритропоэза при почечной недостаточности.
Полученные в работе результаты и сформулированные основные положения используются в учебном процессе на кафедрах нормальной физиологии, патологической физиологии и патологической анатомии Северо-Осетинской государственной медицинской академии. Материалы исследования имеют не только теоретическое, но и практическое значение для врачей нефрологов и терапевтов широкого профиля, так как способствуют лучшему пониманию влияния дефицита кальция на течение почечной недостаточности.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Однократное в/м введение крысам 50% раствора глицерина в дозе 0,8 мл/100г вызывает почечную недостаточность, проявляющуюся снижением водного и спонтанного диуреза (вследствие уменьшения скорости клубочковой фильтрации), протеинурией, гипонатриемией, гипокалиемией, гипокальциемией и гиперфосфатемией, уменьшением в периферической крови количества эритроцитов и содержания гемоглобина, а также явлениями экссудативной гломерулопатии, острого канальцевого некроза и интерстициального нефрита с явлениями межуточного и канальцевого кальциноза.
2. Удаление у крыс паращитовидных желез вызывает повышение водного и спонтанного диуреза (вследствие уменьшения объема канальцевой реабсорбции воды) и развитие протеинурии, меняет обмен электролитов таким образом, что приводит к гипокальциемии, гипонатриемии, гиперкалиемии и гиперфосфатемии, снижает количество эритроцитов в периферической крови и содержание гемоглобина, вызывает экссудативную гломерулопатию и острый канальцевый некроз, но с более выраженными геморрагическим и воспалительным компонентами.
3. Создание у крыс на фоне гипокальциемии почечной недостаточности вызывает выраженные функционально-морфологические изменения почек, проявляющиеся более интенсивным снижением водного и спонтанного диуреза (вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации и повышения объема канальцевой реабсорбции воды), значительным снижением содержания общего белка в плазме крови и увеличением степени протеинурии; увеличением выделения натрия и кальция с мочой, что усиливает гипонатриемию и гипокальциемию, а также увеличением имеющейся гиперкалиемии, но уменьшением, по отношению к паратиреоидэктомии, гиперфосфатемии; более значимо снижает количество эритроцитов и содержание гемоглобина, вызывает наиболее выраженные изменения как клубочков, вплоть до их сморщивания, так и эпителия канальцев в сочетании с многочисленными кровоизлияниями и воспалительными инфильтратами.
Апробация диссертационной работы. Основные положения работы доложены и обсуждались на: VI и VII научной конференции молодых ученых ГОУ ВПО СОГМА Росздрава (Владикавказ, 2007; 2008); межвузовской научной конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы морфологии» (Махачкала, 2007); VI региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения» (Владикавказ, 2007); совместном заседании сотрудников кафедр гистологии, нормальной физиологии, патологической физиологии, патологической анатомии, фармакологии, биологии, терапии с общей врачебной практикой (семейной медицины) ФПДО и ЦНИЛ Северо-Осетинской государственной медицинской академии.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста, включая библиографию и приложение. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, общих выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 233 источника, из них 175 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 49 рисунками и, размещенными в приложении, 9 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования. Исследования проводились на 180 половозрелых крысах-самцах линии Wistar одной возрастной группы (9-12 месяцев), средней массой 220-250 г. Опытные животные в период исследований содержались на стандартном рационе в условиях свободного доступа к воде и пище. Световой режим соответствовал естественному.
Модель почечной недостаточности, так называемую, глицероловую, по методу G. Greven (1981), создавали путем однократного внутримышечного введения крысам 50% водного раствора глицерина в дозе 0,8 мл на 100г веса, с последующим проведением экспериментов через 3 дня, 1, 2 и 4 недели, 1 и 2 месяца. Контролем для этой группы были интактные крысы. Модель гипокальциемии создавали на крысах путем оперативного удаления у них, методом выжигания, паращитовидных желез, с последующими исследованиями через 1.5, 2 и 2.5 месяца. В качестве контроля для этой группы были взяты ложнооперированные крысы, которые также подвергались операции, но без удаления паращитовидных желез. Сочетанную модель почечной недостаточности на фоне гипокальциемии создавали путем введения глицерина в аналогичной дозировке через 1,5 месяца после паратиреоидэктомии, а затем на них дважды проводили эксперименты: первый раз через 2 месяца после паратиреоидэктомии и 2 недели после сделанной инъекции глицерина, а повторно – через 2.5 месяца после паратиреоидэктомии и 4 недели после инъекции глицерина. Контролем для крыс этой группы были и паратиреоидэктомированные, и с почечной недостаточностью в соответствующие временные периоды.
Изучение основных процессов мочеобразования, анализ содержания электролитов в крови (натрия, калия, кальция и фосфора) и их почечной обработки проводили в условиях как спонтанного, так и водного диуреза. Для изучения функций почек в условиях спонтанного диуреза животные помещались в специальные клетки, где у них в течение 6 часов производился сбор мочи. Водную нагрузку создавали однократным введением через зонд в желудок водопроводной воды в объёме, равном 5% массы крыс, после чего у них также собирали мочу в течение 3-х часов (через каждый час). Во время экспериментов часть крыс забивалась путем декапитации для исследования некоторых параметров крови и морфологии почек. В собранной моче и плазме крови спектрофотометрически мы определяли содержание креатинина (по методу Поппера), белка (по Лоури и биуретовым методом), мочевины (с помощью диацетилмоноаксима), кальция (с помощью эриохрома синего) и фосфора (с помощью молибденово-кислого аммония). Содержание натрия и калия, в том числе и в ткани почек, после предварительной экстракции, определяли методом пламенной фотометрии. Содержание гемоглобина в крови определяли по методу Драбкина. Количество эритроцитов подсчитывали в счетной камере Горяева, а гематокрит исследовали по классической методике. Мазки крови, окрашенные по методу Романовского-Гимза, исследовались микроскопически, а образцы почек, после предварительной фиксации в 10% формалине, заливки в парафин, приготовления срезов толщиной 10 микрон и окраски гематоксилин-эозином – в проходящем свете микроскопа Микмед-1 под 200, 600 и 1500-кратным увеличением, с одновременным проведением морфометрии и микрофотографирования.
Расчеты диуреза, скорости клубочковой фильтрации, объёма канальцевой реабсорбции воды, экскреции и фильтрационных зарядов натрия, калия, кальция и фосфора, относительной канальцевой реабсорбции натрия, кальция и фосфора производились по формулам (1974). Полученные результаты обрабатывались статистически параметрическим методом сравнения средних величин с помощью t-критерия Стьюдента. Для расчетов и построения графиков, с доверительными отклонениями, использовалась программа «Prisma 2.01».
Результаты исследований и их обсуждение. Учитывая, что одним из следствий поражения почек является протеинурия, мы проводили её определение у крыс всех экспериментальных групп. При модели почечной недостаточности, уже через 2 недели после инъекции глицерина в условиях водной нагрузки, в моче, собранной за 3 часа, отмечалось повышение на 81,5% содержания общего белка (контроль (4,23±0,22 мг/мл). Одновременно с этим достоверно (р<0,01) снижалось содержание общего белка в плазме крови с уровня контроля, равного 57,06±1,15 г/л. Аналогичными были изменения и при спонтанном диурезе, с той лишь разницей, что в этом случае повышение протеинурии имело равномерно ступенчатый характер. Выявленные изменения как в условиях водного, так и спонтанного диуреза, усиливались на всём протяжении опытов. Стойкая протеинурия отмечалась и после удаления паращитовидных желёз, когда уже через полтора месяца в условиях водной нагрузки содержание белка в моче повысилось в 1,9 раз, а при спонтанном диурезе – в 1,85 раз (20,32±1,62 мг/мл), а содержание в плазме крови снизилось в среднем на 25% от уровня контроля, равного у ложнооперированных крыс 58,48±1,44 г/л. У крыс с сочетанной моделью почечной недостаточности на фоне гипокальциемии были наиболее выраженные изменения содержания белка в моче и плазме крови, как при водном, так и спонтанном диурезе. На первом этапе исследования в условиях водной нагрузки суммарно за три часа содержание общего белка в моче от уровня контроля увеличилось в 2,7 раз и, примерно, в 1,5 раза по сравнению с модельными группами. Еще через две недели оно, соответственно, увеличилось в 4.3, 2.35 и 1.8 раз по отношению к интактному уровню, паратиреоидэктомированному и при почечной недостаточности. Одновременно с этим, по отношению ко всем группам, достоверно снизилось содержание общего белка в плазме крови.
Гистологическое исследование почек у крыс после инъекции глицерина выявило, что уже через две недели увеличились клубочки (71,35х88,45мкм против 67,4х83,8мкм у интактных крыс), в которых, на фоне диссоциации капиллярных сегментов, отмечались мелкие кровоизлияния в петли, а также набухание эндотелия и мезангия. Изменения затронули и канальцы, которые подвергались зернистой или вакуольной трансформации с накоплением в расширенных просветах белковых слепков (рис.1). Высота эпителиоцитов, по сравнению с контролем, уменьшилась с 12,25±0,6мкм до 10,03±0,82мкм. Одновременно отмечались явления слабо выраженного застоя в венозном секторе, очаги кровоизлияний, инфильтраты из лимфоцитарно-гистиоцитарных элементов и мелкие петрификаты (кальциноз). Спустя месяц выявленные нарушения несколько уменьшились, а через два месяца после введения глицерина наблюдалось дальнейшее уменьшение размеров клубочков (до 63,48х81,66 мкм), диффузные дистрофические изменения эпителия преимущественно слабой степени, активация стромальных элементов и сохраняющиеся инфильтраты. В целом, у крыс развивалась экссудативная гломерулопатия, острый канальцевый некроз и интерстициальный нефрит, частично на застойно-геморрагическом фоне, с явлениями межуточного и канальцевого кальциноза.
Морфологические изменения при гипокальциемии можно также описать как острый канальцевый некроз и интерстициальный нефрит. Наряду с увеличенными клубочками (72,84х92,8мкм) отмечалась зернистая трансформация, а местами апикальная или полная деструкция эпителия канальцев с накоплением в расширенных просветах десквамированного материала. Высота эпителиоцитов в канальцах, по сравнению с нормой, снизилась до 9,98±0,5мкм. В целом, в отличие от изменений, описанных при почечной недостаточности, в данном случае не было явлений кальциноза, но были более выражены геморрагический и воспалительный компоненты (рис.2). Проведенные повторные морфологические исследования спустя 2 и 2.5 месяца после паратиреоидэктомии, каких-либо новых изменений не выявили.
При почечной недостаточности на фоне гипокальциемии, по сравнению с другими экспериментальными группами, отмечались наиболее выраженные изменения как клубочков, вплоть до их сморщивания, так и эпителия канальцев, с их полной деструкцией в сочетании с многочисленными кровоизлияниями и более крупными воспалительными инфильтратами (рис.3), то есть, отмечалось суммирование повреждающих эффектов глицерина и гипокальциемии.
|
| ||||
Рис.1. Морфология почек крыс через две недели после инъекции глицерина. Окраска гематоксилин-эозином. х1500 | |||||
А - клубочек с эритроцитарными стазами, набуханием эндотелия и мезангия | |||||
Б - вакуольная дистрофия эпителия канальцев |
|
| ||||
Рис.2. Морфология почек крыс через полтора месяца после паратиреоидэктомии. Окраска гематоксилин-эозином. х600 | |||||
А - выраженная зернистая дистрофия эпителия канальцев с расширением просветов и скоплением в них десквамированного материала | |||||
Б - многочисленные массивные кровоизлияния |
|
| ||||
Рис.3. Морфология почек крыс при почечной недостаточности на фоне гипокальцие- мии через два с половиной месяца после паратиреоидэктомии и четыре недели после инъекции глицерина. Окраска гематоксилин-эозином. х1500 | |||||
А - ишемически сморщенный клубочек и дистрофия эпителия канальцев различной степени | |||||
Б - тотальная деструкция эпителия канальцев |
Результаты исследования некоторых гематологических показателей выглядели следующим образом. Спустя две недели после инъекции глицерина отмечалось, по сравнению с результатами интактных крыс, снижение гематокрита до 41,6±0,71% (р<0,05), содержания гемоглобина – на 23% (р<0,001) с уровня контроля в 136,8±2,15 г/л и количества эритроцитов с 6,08±0,32х1012/л – на 19,1% (р<0,002). В мазках крови наряду с нормохромными дискоцитами, встречались микро-, стомато - и сферостоматоциты, то есть предгемолитические формы эритроцитов. Через месяц эти показатели крови не только вернулись к нормальным значениям, но и несколько превысили их. Однако еще через месяц исследований они стали достоверно (р<0,001) ниже показателей, как интактных крыс, так и своих двухнедельных результатов: гемоглобин снизился до 97,26±1,75 г/л; количество эритроцитов – до 4,27±0,15х1012/л и гематокрит – до 37,3±1,12%. Выявленные изменения, возможно, являлись следствием вначале сниженной выработки эритропоэтина, затем с некоторым компенсаторным повышением его продукции в печени, а в дальнейшем - с истощением резервных возможностей и угнетением продукции эритропоэтина.
Исследование гематологических показателей в условиях гипокальциемии показало их достоверное прогрессирующее снижение, причем в отличие от животных при почечной недостаточности, без тенденции к нормализации. Так, спустя два с половиной месяца исследований отмечалось снижение уровня гемоглобина до 109±1,6 г/л, количества эритроцитов – до 4,9±0,17х1012/л и гематокрита – до 37±1,01%. При этом выявленные изменения, возможно, связаны с уменьшением выработки эритропоэтина за счет угнетения синтеза простагландинов.
Исследование гематологических показателей у крыс с сочетанной моделью выявило суммирование угнетающих эффектов почечной недостаточности и гипокальциемии, что подтверждалось наиболее низкими гематологическими показателями без тенденции к повышению. Так, уже через 2 недели после инъекции глицерина у данной группы крыс уровень гемоглобина снизился до 89,3±1,93 г/л (на 35%), количество эритроцитов – до 4,06±0,25х1012/л (на 33%), а гематокрит – до 37,6±1,06% (на 16%), то есть имело место их достоверное снижение по сравнению с результатами контроля (р<0,001).
При последующих исследованиях у оставшихся 11-и крыс этой группы эти показатели продолжали снижаться: гемоглобин был уже на 40% меньше контроля, количество эритроцитов на 46%, а гематокрит – на 24%.
Исследование водовыделительной функции почек у крыс при экспериментальной почечной недостаточности в условиях водной нагрузки показало, что через трое суток после инъекции глицерина отмечалась лишь только тенденция к снижению диуреза за все три часа сбора мочи, в результате чего процент выведения введённой нагрузки с контрольного уровня интактных крыс, равного 85,4±4,26%, снизился до 80,34±5,12%. Через одну неделю после введения глицерина количество мочи, выделившейся за первые два часа экспериментов, стало достоверно (р<0,05) меньше, и суммарное выведение нагрузки за три часа, по сравнению с контролем, снизилось на 17,0%. Более выраженное угнетение диуреза (р<0,001) мы имели через две недели, как отдельно по каждому часу, так и суммарно за три часа, а выведение водной нагрузки уменьшилось до 46,82±4,13%. Спустя четыре недели после инъекции глицерина снижение диуреза, по сравнению с результатами интактных крыс, сменилось достоверным повышением. При этом, если сравнивать с результатами двухнедельных экспериментов, он увеличился в 2,34 раза. Однако через месяц диурез вновь уменьшился, стал достоверно меньше контрольного уровня по каждому часу (р<0,05, р<0,02 и р<0,02, соответственно), что было за 3 часа меньше на 22,6%.
Колебания спонтанного диуреза были аналогичны результатам после водной нагрузки, и были обусловлены изменениями скорости клубочковой фильтрации и объёма канальцевой реабсорбции воды, как факторов, определяющих объём первичной и окончательной мочи (табл.1).
Через две недели после инъекции глицерина канальцевая реабсорбция воды оставалась в пределах контроля (93,96±0,36% за 3 часа) и, несмотря на то, что окончательный объём мочи в большей степени зависит от обратного всасывания воды в канальцах почек, одновременное уменьшение скорости клубочковой фильтрации за каждый час, соответственно, с 22,48±0,78; 21,15±0,63 и 17,61±0,59 мл/час/100г (контроль) до 11,34±0,89; 10,38±1,02 и 9,25±0,76 мл/час/100г (опыт), было столь значительным (за 3 часа более чем в два раза), что приводило к достоверному (р<0,001) снижению диуреза. К концу четвёртой недели экспериментов происходило и ускорение клубочковой фильтрации (72,64±3,17 мл/3часа/100г), и торможение канальцевой реабсорбции воды (92,72±0,66% за 3 часа), что и привело к увеличению количества мочи. В конце второго месяца, клубочковая фильтрация начала снижаться, став на 21% меньше контроля, равного 61,24±2,0 мл/3часа/100г. Канальцевая же реабсорбция воды была на уровне, несколько большем (94,51±0,45% в среднем за 3 часа), чем в контроле (93,96±0,36%), то есть, повторное снижение диуреза было обусловлено в первую очередь снижением клубочковой фильтрации.
Таблица 1.
Спонтанный диурез, клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция воды у крыс при почечной недостаточности, при гипокальциемии и при почечной недостаточности на фоне гипокальциемии
Стат. показатели | Диурез (мл/6часов/100г) | Клубочковая фильтрация (мл/6часов/100г) | Канальцевая реабсорбция (%) |
Интактные крысы (контроль) (n=39) | |||
М+m | 1,03±0,029 | 78,93±2,32 | 98,71±0,08 |
Через 2 недели после введения глицерина (n=28) | |||
М±m // p | 0,54±0,024 // <0,001 | 37,02±2,77 // <0,001 | 98,66±0,06 // ٭ |
Через 4 недели после введения глицерина (n=23) | |||
М±m // p | 1,61±0,052 // <0,001 | 99,38±4,87 // <0,002 | 98,58±0,08 // <0,01 |
Через 2 месяца после введения глицерина (n=17) | |||
М±m // p | 0,83±0,051 // <0,002 | 64,44±2,98 // <0,001 | 98,69±0,1 // ٭ |
Ложнооперированные крысы через 1,5 месяца после операции (n=39) | |||
М±m // p | 0,98±0,03 // ٭ | 76,53±2,54 // ٭ | 98,72±0,09 // ٭ |
Через 2 месяца после паратиреоидэктомии (n=20) | |||
М±m // рло | 1,68±0,063 // <0,001 | 83,55±4,66 // ٭ | 98,04±0,07 // <0,001 |
Через 2,5 месяца после паратиреоидэктомии (n=14) | |||
М±m // рло | 1,49±0,06 // <0,001 | 81,71±3,63 // ٭ | 98,17±0,06 // <0,001 |
Через 2 месяца после паратиреоидэктомии и 2 недели после инъекции глицерина (n=19) | |||
М±m | 0,87±0,06 // 18 | 58,24±3,72 // 19 | 98,86±0,05 |
рптэ 2 мес рпн 2 нед | <0,001 // <0,001 | <0,001 // <0,001 | <0,001 // <0,02 |
Через 2,5 месяца после паратиреоидэктомии и 4 недели после инъекции глицерина (n=14) | |||
М±m | 0,73±0,07 | 49,76±3,32 | 98,83±0,07 |
рптэ 2,5 мес рпн 4 нед | <0,001 // <0,001 | <0,001 // <0,001 | <0,001 // <0,02 |
٭ – отсутствие достоверных изменений
р – достоверность отличий к результатам интактных крыс
рло – достоверность отличий результатов паратиреоидэктомированных крыс к данным ложноопери-
рованной группы
рптэ 2 мес, и 2,5 мес. – достоверность отличий результатов крыс при почечной недостаточности на фоне
рпн 2 нед. и 4 нед. паратиреоидэктомии к соответствующим данным паратиреоидэктомированных
крыс и при почечной недостаточности
Изменения основных процессов мочеобразования при спонтанном диурезе были аналогичны результатам, полученным у крыс после нагрузки водопроводной водой, и они представлены в таблице 1.
В группе паратиреоидэктомированных крыс через полтора месяца после удаления паращитовидных желез отмечалось достоверное повышение водного диуреза за каждый час трехчасового опыта (р<0,001, р<0,01, р<0,02, соответственно), а выведение введённой водной нагрузки за три часа превосходило уровень ложнооперированных крыс (84,26±4,88%) на 25%. В ходе повторных экспериментов, через 2 и 2.5 месяца после паратиреоидэктомии, также отмечалось повышение диуреза.
Результаты спонтанного диуреза, также имели аналогичную, в сторону полиурии, направленность изменений (табл.1).
Столь выраженному повышению диуреза, как водного, так и спонтанного, не могла способствовать клубочковая фильтрация, так как она, по сравнению с результатами ложнооперированных крыс (61,95±2,19 мл/3часа/100г), практически не менялась. Но одновременное достоверное (р<0,001) снижение канальцевой реабсорбции воды до 91,03±0,36%, как раз и было непосредственной причиной повышения диуреза.
При повторных исследованиях, спустя 2 и 2,5 месяца после паратиреоидэктомии, все выявленные изменения основных процессов мочеобразования сохранялись.
Наиболее интересными оказались результаты исследования водовыделительной функции у крыс с сочетанной моделью почечной недостаточности на фоне гипокальциемии. Диурез у этих животных отличался от всех полученных нами ранее результатов: и от интактных, и при почечной недостаточности, и при паратиреоидэктомии. Так, через две недели после инъекции им глицерина водный диурез за первые два часа был достоверно (р<0,001) меньше результатов интактных крыс и, в среднем, за три часа уменьшился на 25%, став 3,43±0,21 мл/3часа/100г, а при сопоставлении с данными паратиреоидэктомированных крыс (5,28±0,21 мл/3часа/100г) – снизился на 45,5%, но на 32%, наоборот, повысился по сравнению с данными, полученными при двухнедельной почечной недостаточности (2,36±0,21 мл/3часа/100г).
Спустя еще две недели, то есть когда с момента паратиреоидэктомии прошло 2.5 месяца, а после сделанной инъекции глицерина 4 недели, диурез у крыс снизился, став меньше результата интактных животных, паратиреоидэктомированных, с почечной недостаточностью, а также на 24,6% меньше, собственного, полученного двумя неделями ранее.
Примерно такая же картина была и в отношении спонтанного диуреза (табл.1).
Исследование основных процессов мочеобразования показало, что через две недели после сделанной инъекции глицерина в условиях водной нагрузки скорость гломерулярной фильтрации за три часа (44,56±3,6 мл/3часа/100г) была достоверно (р<0,01) меньше на 31,5%, чем у крыс через два месяца после удаления паращитовидных желёз (64,26±5,2 мл/3часа/100г) и, одновременно, достоверно (р<0,001) на 44% больше результатов крыс с двухнедельной почечной недостаточностью (30,97±2,67 мл/3часа/100г). Канальцевая реабсорбция воды особо не отличалась от контроля и данных при почечной недостаточности, но была достоверно больше, чем у паратиреоидэктомированных крыс, то есть изменения диуреза в этот период были связаны с изменениями клубочковой фильтрации.
Повторные эксперименты через две недели показали, что уменьшение диуреза, по сравнению с результатами крыс гипокальциемических и при почечной недостаточности, было вызвано не только снижением скорости клубочковой фильтрации, но и увеличением объёма канальцевой реабсорбции воды.
Рассматривая основные процессы мочеобразования в условиях спонтанного диуреза, можно отметить, что выявленное двукратное уменьшение диуреза, по сравнению с интактными крысами, было обусловлено уменьшением скорости клубочковой фильтрации, а по сравнению с паратиреоидэктомированными крысами – достоверным (р<0,001) снижением скорости клубочковой фильтрации и одновременным (р<0,001) повышением канальцевой реабсорбции воды (табл.1). При сравнении же с результатами, которые были получены через две недели после инъекции крысам глицерина, отмечались достоверное ускорение клубочковой фильтрации и усиление канальцевой реабсорбции воды (табл.1). Спустя ещё две недели снижение спонтанного диуреза у крыс, по сравнению с паратиреоидэктомированными, также было вызвано достоверным (р<0,001) уменьшением клубочковой фильтрации и повышением канальцевой реабсорбции воды. Если же сравнивать с данными при почечной недостаточности, то изменения диуреза были связаны со снижением скорости клубочковой фильтрации и одновременным повышением канальцевой реабсорбции воды (табл.1). Таким образом, изменения спонтанного диуреза обусловлены нарушениями не только клубочковой фильтрации, но и канальцевой реабсорбции воды.
Для выяснения механизмов изменения процессов мочеобразования мы исследовали электролитно-мочевинный профиль слоев ткани почек, как на высоте водной нагрузки, то есть через один час после её введения, так и при спонтанном диурезе. В обоих случаях результаты имели одинаковую направленность.
При этом через две недели и два месяца после инъекции глицерина, отмечалось достоверное повышение содержания мочевины в корковом веществе, наружной медулле и в почечном сосочке (рис.4), что приводило к повышению осмолярности интерстиция. Как результат этого, должна была повышаться канальцевая реабсорбция воды, однако через две недели, по сравнению с контролем, она практически не изменилась, а через два месяца имела недостоверное отличие в сторону повышения (рис.4). Уровни же натрия (25,06±0,73 мкмоль/г влажного веса), калия (27,41±0,55 мкмоль/г влажного веса) и содержание воды (77,43±0,47%), хоть и отличались от контрольного, но не имели достоверного отличия. Определение содержания мочевины в ткани почек через четыре недели показало незначительное её повышение (рис.4), но одновременное снижение содержания натрия (р<0,05) уменьшило осмолярность интерстиция, что и привело к снижению канальцевой реабсорбции воды и, как следствие, к повышению диуреза. Вместе с этим отмечалось достоверное (р<0,01) снижение экскреции мочевины с мочой, и, почти 3-х кратное, повышение её содержания в плазме крови.
У паратиреоидэктомированных крыс в содержании мочевины (рис.4) и натрия наблюдались однотипные изменения – их уровень, по сравнению с контролем, был достоверно снижен во всех слоях почек, что привело к уменьшению осмолярности интерстиция, угнетению обратного транспорта воды и, как следствие, обусловило полиурию. При этом отмечалось достоверное (р<0,05) усиление выделения мочевины с мочой и снижение её содержание в плазме крови (3,94±0,46 ммоль/л).
Электролитно-мочевинный профиль слоев ткани почек крыс с сочетанной моделью отличался от результатов интактных крыс, при почечной недостаточности и при гипокальциемии. Спустя два месяца после паратиреоидэктомии и две недели после инъекции глицерина, определялось достоверное (р<0,001) повышение содержания мочевины (рис.4) и натрия в корковом веществе почек. В наружной медулле и почечном сосочке это повышение имело достоверное отличие только по отношению к интактным и паратиреоидэктомированным животным, но не к результатам при почечной недостаточности.
Рис. 4. Содержание мочевины в слоях ткани почек через один час после водной нагрузки у крыс при почечной недостаточности, при гипокальциемии и при почечной недостаточности на фоне гипокальциемии
При повторных экспериментах, наряду с достоверным повышением уровня мочевины в слоях ткани почек (рис.4), мы также выявили увеличение натрия, калия и воды в корковом веществе. Вместе с тем содержание мочевины в плазме крови было достоверно выше, чем в остальных группах животных, и к концу опытов превосходило интактный уровень в 3,26 раза (при водном диурезе) и в 3,35 раза (при спонтанном диурезе), а уровень почечной недостаточности, которая сама способствовала повышению мочевины в крови – в 1,64 и 1,69 раз, соответственно. Экскреция же мочевины с мочой у группы крыс этой сочетанной модели уменьшалась и была меньше результатов других исследуемых групп.
Одновременно отмечались изменения ионовыделительной функции почек, изучение которой проводилось только в условиях спонтанного диуреза. Так, в группе крыс при почечной недостаточности во все периоды исследований отмечалось достоверное прогрессирующее снижение содержания натрия в плазме крови с контрольного уровня в 136,48±2,48 ммоль/л, до 123,8±2,43 ммоль/л (р<0,002) через два месяца после введения глицерина, обусловленное увеличением экскреции его с мочой, превысившим норму (86,64±5,12 мкмоль/6часов/100г) к концу второго месяца экспериментов в 2,7 раз. При этом основной причиной усиленного выведения натрия из организма было угнетение (р<0,001) его реабсорбции в канальцах почек (99,15±0,08% – контроль, 96,92±0,76% – опыт). Содержание же калия в плазме крови колебалось. Так, через две недели отмечалась гиперкалиемия (5,39±0,32 ммоль/л – контроль, 6,34±0,29 ммоль/л – опыт, р<0,05), возможно, обусловленная рабдомиолизом, которая затем сменилась достоверной (р<0,01) гипокалиемией (4,16±0,2 ммоль/л, р<0,01). Одновременно с изменениями калия в плазме крови, менялось и его выделение с мочой, что проявлялось снижением его экскреции, а затем достоверным (р<0,001) повышением, превысившим к концу второго месяца контрольный уровень в 2,8 раз. На протяжении всего эксперимента мы выявляли гипокальциемию, одной из причин которой было нарастание экскреции кальция с мочой в основном за счет достоверно (р<0,001) низкой канальцевой реабсорбции. Параллельно отмечалась гиперфосфатемия, причиной которой на уровне почек было уменьшение экскреции фосфора с мочой за счет усиленной реабсорбции в канальцах почек.
У крыс второй экспериментальной группы после удаления паращитовидных желёз отмечались следующие изменения. Вследствие угнетения канальцевой реабсорбции развивался натрийурез, способствующий достоверному (р<0,05) уменьшению содержания натрия в плазме крови. Также отмечалось достоверное (р<0,05) снижение экскреции калия с мочой и повышение его содержания в плазме крови. Одновременно тормозилась канальцевая реабсорбция кальция, что приводило к развитию кальцийуреза и гипокальциемии. Кроме того, достоверно (р<0,001) увеличивалась реабсорбция фосфора и снижалась его экскреция, что способствовало повышению, по сравнению с уровнем контроля, содержания фосфора в плазме крови более чем в два раза.
В группе крыс с сочетанной моделью наиболее выраженные изменения ионовыделительной функции почек наблюдались через два с половиной месяца после паратиреоидэктомии и четыре недели после сделанной инъекции глицерина. При этом экскреция натрия достоверно (р<0,001) увеличилась по сравнению с результатами всех групп сравнения, в том числе и своими двухнедельными, в результате выраженного снижения канальцевой реабсорбции. Это привело к уменьшению содержания натрия в плазме крови, как по отношению к результатам паратиреоидэктомированных крыс, так и данным при почечной недостаточности.
Исследование обмена калия показало, что, по сравнению с крысами паратиреоидэктомированными и с почечной недостаточностью, сочетанная модель практически не оказывает влияния на экскрецию калия, но при этом достоверно усиливается гиперкалиемия по отношению к данным крыс интактных (р<0,001), паратиреоидэктомированных (р<0,05) и при почечной недостаточности (р<0,05). Изучение обмена кальция показало прогрессирующее снижение концентрации кальция в плазме крови. При этом экскреция кальция, несмотря на имеющееся снижение фильтрационного заряда, достоверно (р<0,001) превосходила интактный уровень, паратиреоидэктомированный и при почечной недостаточности, что было обусловлено выраженным угнетением канальцевой реабсорбции кальция.
При усиливающейся гипокальциемии, содержание фосфора в крови, по сравнению с результатами паратиреоидэктомированных крыс, снизилось, но по сравнению с данными при почечной недостаточности, было ещё достоверно (р<0,001) высоким. Экскреция же фосфора стала больше, по сравнению с интактными (вначале за счет увеличения фильтрационного заряда, а затем – снижения канальцевой реабсорбции) и паратиреоидэктомированными крысами (вследствие снижения канальцевой реабсорбции).
Выявленные изменения отражены в следующих патогенетических схемах:
Схема 1. Функционально-морфологические изменения почек крыс после инъекции
глицерина
Схема 2. Функционально-морфологические изменения почек после паратиреоидэктомии
- изменения, выявленные автором в ходе эксперимента
ВЫВОДЫ
1. Однократное в/м введение крысам 50% раствора глицерина вызывает почечную недостаточность, сопровождающуюся снижением водного и спонтанного диуреза, а создание экспериментальной гипокальциемии путем удаления паращитовидных желез приводит к полиурии спонтанной и при функциональной 5% водной нагрузке. Сочетание же обеих моделей, когда на фоне гипокальциемии вводится глицерин, нивелирует гипокальциемическое повышение диуреза и угнетает его более интенсивно, чем при почечной недостаточности.
2. Экспериментальная почечная недостаточность, созданная на фоне гипокальциемии, сопровождается снижением скорости клубочковой фильтрации и повышением канальцевой реабсорбции, что более значимо уменьшает диурез. При почечной недостаточности отмечается снижение клубочковой фильтрации, а при гипокальциемии – уменьшение канальцевой реабсорбции воды.
3. При экспериментальной почечной недостаточности снижается экскреция мочевины, а содержание её в плазме крови и в слоях ткани почек увеличивается; при гипокальциемии же, наоборот, происходит увеличение её экскреции, снижение уровня в крови и в ткани почек. При сочетанной модели усиливаются проявления, характерные для почечной недостаточности. Одновременно в ткани почек повышается содержание натрия, что усиливает осмолярность интерстиция, способствуя повышению канальцевой реабсорбции воды и снижению диуреза.
4. Сочетание экспериментальной гипокальциемии и почечной недостаточности усиливает, характерные и для почечной недостаточности, и для гипокальциемии, протеинурию и гипопротеинемию.
5. При сочетанной модели патологии у крыс усиливается угнетение канальцевой реабсорбции натрия и кальция, увеличивается их экскреция и снижается содержание в плазме крови; экскреция калия не меняется, но при этом наблюдается гиперкалиемия; канальцевая реабсорбция фосфора тормозится, что снижает его экскрецию (по сравнению к почечной недостаточности), уменьшает повышенное содержание в плазме крови (по сравнению к гипокальциемии).
6. Создание на фоне экспериментальной гипокальциемии почечной недостаточности вызывает суммирование угнетающих эффектов на количество эритроцитов в периферической крови, гематокритное число и содержание гемоглобина в крови.
7. У крыс при сочетанной модели почечной недостаточности и гипокальциемии отмечаются наиболее выраженные изменения как клубочков, вплоть до их сморщивания, так и эпителия канальцев, в сочетании с многочисленными кровоизлияниями и воспалительными инфильтратами.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Фидарова экспериментальной гипокальциемии на некоторые функции почек // Владикавказский медико-биологический вестник. –2007. –т.7, вып.13. –С.331-332.
2. , , Гиреева и функциональные изменения почек при экспериментальной острой почечной недостаточности у крыс // Материалы межвузовской научной конференции «Фундаментальные проблемы морфологии». –Махачкала, 2007. –С.81-84.
3. Фидарова морфологические и функциональные особенности почек в условиях острой почечной недостаточности // Тезисы докладов VI конференции молодых ученых СОГМА. – Владикавказ, 2007. –С.116-117.
4. , Джиоев функция почек крыс в условиях паратиреоидэктомии // Сборник научных трудов АН ВШ РФ. –Владикавказ, 2007. –№ 5. –С.103-104.
5. , Джиоев некоторых гематологических показателей в условиях различной обеспеченности кальцием крыс // Вестник МАНЭБ. –2008. –т.14, №3. –С.48-51.
6. , Фидарова особенности функции и морфологии почек крыс в условиях различных моделей экспериментальной почечной недостаточности // Вестник новых медицинских технологий. –2008. –т.15, №1. –с.38-39.
