Опубликована в журнале «Урология», 2012 г., № 1.
Влияние L-карнитина на показатели эякулята
у мужчин из бесплодных пар
1, 3, 1, 3, 2
1 Башкирский государственный медицинский университет
2 Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ)
3 Медицинский центр «Семья»
Ключевым патогенетическим звеном развития большинства форм бесплодия у мужчин является окислительный стресс сперматозоидов, однако целесообразность использования антиоксидантных препаратов при этом заболевании не является общепризнанной. Это обусловлено не в последнюю очередь недостаточной изученностью клеточных и биохимических аспектов действия антиоксидантов на мужскую репродуктивную систему. Целью исследования было выявление молекулярных механизмов антиоксидантного действия L-карнитина, трансмембранного переносчика длинноцепочечных жирных кислот, при идиопатической патоспермии. Представлены результаты терапии препаратом Карнитон (1 г/сут) 60 мужчин из бесплодных пар. Влияние L-карнитина на антиоксидантный статус эякулята оценивали методом регистрации хемилюминесценции, а также путем прямого определения общей антиокислительной активности колориметрическим методом по изменению окраски хромогена ABTS. Установлена высокая антиокислительная активность препарата при тестировании в модельных системах in vitro, которая имела отчетливый дозозависимый характер. При исследовании in vivo у пациентов, принимавших L-карнитин, было продемонстрировано статистически значимое увеличение доли прогрессивно-подвижных сперматозоидов категории А, обнаружена позитивная динамика показателей люминолзависимой и Fe2+-индуцированной хемилюминесценции эякулята на фоне увеличения антиоксидантной емкости спермоплазмы. Показано, что беременность наступила у 23 % женщин на фоне лечения супруга. Эффект терапии, вероятно, обусловлен нормализацией антиоксидантного статуса эякулята.
Ключевые слова: мужское бесплодие, антиоксиданты, L-карнитин.
Введение
L-карнитин является эссенциальной молекулой, вовлеченной в энергетический метаболизм благодаря участию в транспорте ацильных групп через внутреннюю мембрану митохондрий [1]. Карнитин и ацетилкарнитин найдены в высоких концентрациях в эпидидимисе, где они также выступают в качестве антиокислителей, защищая сперматозоиды от действия активных форм кислорода – АФК [2].
Заместительная терапия карнитином активно применяется при мужском бесплодии. В систематическом обзоре клинических исследований эффективности L-карнитина и/или L-ацетилкарнитина, представленном X. Zhou и соавт. [3], продемонстрирована их позитивная роль в коррекции различных форм мужской инфертильности. В целом данные различных авторов не противоречат друг другу, но большинство работ посвящено в первую очередь влиянию карнитина на показатели рутинной спермограммы, и лишь в немногих случаях были исследованы его эффекты на функциональные характеристики сперматозоидов. Так, и соавт. [4] отметили нормализацию акросомальной реакции сперматозоидов на фоне назначения карнитинсодержащих препаратов. Другими авторами была обнаружена корреляция между концентрацией карнитина в сперме и целостностью ядерной ДНК гамет [5], осмотической резистентностью сперматозоидов [6], а также положительное влияние его назначения на уровни восстановленного глутатиона и 8-гидроксидезоксигуанозина в яичках [2].
Вместе с тем молекулярные механизмы антиокислительного действия карнитина остаются неясными [7], что и послужило предпосылкой для выполнения настоящего исследования.
Материал и методы
Обследованы 60 пациентов с идиопатической патоспермией. Возраст мужчин колебался от 23 до 35 лет. Средний возраст пациентов в группе составил 29,2 ± 0,8 года. Все обследованные мужчины состояли в бесплодном браке от 1 года до 10 лет. Пациенты получали L-карнитина тартрат (Карнитон, ) по 0,5 г перорально дважды в сутки в течение 3 мес, что соответствует продолжительности цикла сперматогенеза.
Исследование спермы до и после лечения проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1999) по исследованию эякулята и спермоцервикальному взаимодействию [8]: определяли концентрацию, подвижность и долю нормальных форм, методом MAR определяли процент сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами.
Оценку состояния свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности (АОА) эякулята проводили посредством хемилюминесцентного анализа с использованием отечественного хемилюминометра ХЛ-003 [9].
Исследование эякулята начинали через 60 мин от момента сбора материала, после наступления разжижения. Перед измерением свечения исследуемый объем спермы смешивали с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5 М, помещали в светоизолированную камеру прибора и вели запись хемилюминесценции (ХЛ) при 37 °C в течение 5 мин.
Об интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК.
Для регистрации Fe2+-индуцированной ХЛ 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе, генерирующей АФК. Конечная концентрация FeSO4 в среде инкубации составляла 2,5 ммоль. Запись свечения проводили в течение 5 мин при постоянном перемешивании.
При оценке Fe2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительность латентного периода с момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуду быстрой и медленной вспышки.
Определение суммарной АОА спермоплазмы для оценки мужской фертильности включало в себя оценку Fe2+-индуцируемой ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; проведение повторной регистрации ХЛ при добавлении спермоплазмы; определение суммарной АОА спермоплазмы по степени подавления свечения модельной системы.
В норме суммарная АОА, определенная при обследовании здоровых фертильных мужчин – доноров спермы, колеблется от 35 до 43 %. При более низких значениях общая АОА является недостаточной [10].
Общую активность антиокислительных систем в эякуляте определяли также колориметрическим методом с помощью стандартного тест-набора Total antioxidant status (Randox Laboratories, Великобритания). Принцип метода основан на подавлении развития окраски хромогена в тестируемой пробе пропорционально концентрации антиоксидантов. Хромоген ABTSR (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолина сульфонат]) при инкубации с пероксидазой и Н2О2 образует радикал ABTSR+. Полученный раствор имеет стабильный зелено-голубой цвет, интенсивность которого оценивают при 600 нм [11]. Количественное определение ТБК-активных продуктов проводили с использованием набора реактивов «ТБК – Агат («Агат-Мед», Россия).
Результаты и обсуждение
На первом этапе были изучены антиоксидантные свойства L-карнитина в модельных системах in vitro. В качестве модели, в которой вызывали образование АФК, использовали фосфатный буфер с добавлением цитрата натрия и люминола. Образование АФК инициировали введением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа. Реакция сопровождалась ХЛ, избирательно усиливающейся в присутствии люминола.
Полученные данные свидетельствуют о высокой АОА препарата: на рис. 1 видно, что Карнитон в различных дозах значительно подавляет свечение модельной системы, генерирующей АФК.
Рис. 1. Запись ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, при добавлении препарата в различных дозах
1 – контроль, 2 – 0,005 мл Карнитона, 3 – 0,1 мл Карнитона, 4 – 0,3 мл Карнитона (раствор 500 мг/мл).
Для того чтобы установить, сохраняются ли антиокислительные эффекты L-карнитина в биологической среде, была дана оценка его влияния на перекисное окисление липидов (ПОЛ). С этой целью препарат добавляли в различных дозах к липидам куриного желтка, сходным по составу с липидами крови [12].
На представленных хемилюминограммах (рис. 2) видно, как уменьшаются показатели медленной вспышки при добавлении в данную модельную систему L-карнитина т. е. антиокислительные свойства препарата сохранялись и в биологической среде.
Рис. 2. Запись ХЛ в модельной системе, инициирующей реакции ПОЛ, при добавлении препарата в различных дозах
1 – контроль, 2 – 0,001 мл Карнитона, 3 – 0,1 мл Карнитона, 4 – 0,3 мл Карнитона (раствор 500 мг/мл).
Антиоксидантный эффект препарата был дозозависимым – с повышением концентрации L-карнитина снижалась интенсивность ХЛ (рис. 3).
Рис. 3. Степень угнетения ХЛ модельной системы, инициирующей реакции ПОЛ, в зависимости от дозы Карнитона (раствор 500 мг/мл)
Таким образом, в различных модельных системах, в которых индуцировали образование АФК и процессы ПОЛ, Карнитон дозозависимо подавлял ХЛ вплоть до полного угнетения свечения.
На следующем этапе были изучены антиоксидантные свойства Карнитона in vivo. Интегральным критерием состояния мужской репродуктивной функции является анализ эякулята. Результаты исследования спермы представлены в табл. 1.
Таблица 1. Показатели эякулята обследованных мужчин до и после приема Карнитона
Показатель | До лечения | После лечения | |
Объем эякулята, мл | 3,5 ± 0,2 | 3,6 ± 0,2 | |
рН | 7,4 ± 0,1 | 7,4 ± 0,1 | |
Концентрация сперматозоидов, млн/мл | 23,5 ± 2,2 | 22,5 ± 2,4 | |
Морфологически нормальные формы, % | 20,9 ± 0,8 | 21,8 ± 0,8 | |
Подвижность сперматозоидов, % | 19,2 ± 1,7 | 26,3 ± 2,1* | |
категории B | 22,8 ± 1,9 | 17,4 ± 2,0 | |
категории C | 20,8 ± 2,2 | 19,9 ± 1,7 | |
категории D | 36,3 ± 2,0 | 36,2 ± 2,3 |
Примечание. * – достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05.
При анализе спермограмм патоспермия выявлена у всех 60 пациентов, олигозооспермия – у%), астенозооспермия – у%), тератозооспермия – у%).
С целью оценки эффективности Карнитона через 3 мес после начала лечения было выполнено контрольное исследование эякулята.
Как показали наши исследования, достоверных изменений стандартных параметров спермограммы на фоне лечения, за исключением содержания прогрессивно-подвижных сперматозоидов категории А, не наблюдалось. Однако суммарная доля сперматозоидов категорий А и В практически не изменялась, что противоречит данным литературы о позитивном влиянии L-карнитина на двигательную активность гамет.
Каких-либо побочных эффектов при приеме Карнитона не выявлено.
Следует подчеркнуть, что результаты MAR-теста у всех обследованных мужчин до и после лечения не превышали нормальных значений.
Наряду с этим, за 3 мес лечения, т. е. за период, в течение которого полностью завершается процесс созревания сперматозоидов, беременность наступила у жен%) пациентов.
Постулируемым, но недостаточно изученным свойством L-карнитина является его АОА. Дисбаланс между продукцией АФК и антиоксидантной способностью различных отделов мужского репродуктивного тракта независимо от этиологического фактора рассматривается как ключевой индикатор окислительного стресса, который хорошо коррелирует со степенью мужской инфертильности [13, 14].
Процессы генерации АФК в сперме изучали у всех мужчин до и после назначения Карнитона по методике, разработанной и соавт. [15].
В качестве основного параметра интенсивности ХЛ рассматривали светосумму свечения за 5 мин измерения. Показатели ЛЗХЛ до и после лечения представлены в табл. 2.
Таблица 2. Уровень ЛЗХЛ (в отн. ед.) семенной жидкости мужчин
до и после приема Карнитона
Показатель | До лечения | После лечения |
Светосумма | 3,8 ± 0,53 | 2,5 ± 0,34* |
Спонтанная светимость | 1,4 ± 0,23 | 0,9 ± 0,21 |
Максимальная светимость | 1,2 ± 0,19 | 1,1 ± 0,13 |
Примечание. * – достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05.
Как следует из анализа полученных данных, достоверные различия были выявлены только по величине показателя светосуммы, который на фоне приема препарата снизился более чем в 1,5 раза. Данные различия свидетельствуют о том, что при поступлении L-карнитина наблюдается усиление защитных свойств спермоплазмы в виде повышения уровня суммарной АОА.
Этот параметр является наиболее информативным критерием генерации АФК в сперме. Таким образом, результатами определения состояния прооксидантного звена ПОЛ подтверждается гипотеза о влиянии L-карнитина на способность сперматозоидов продуцировать АФК.
Изучение процессов генерации АФК в сперме у здоровых доноров авторами использованной нами методики позволило разработать нормативные значения показателей ЛЗХЛ эякулята: для светосуммы они составили 2,9 ± 0,8 отн. ед., для спонтанной светимости – 0,9 ± 0,3 отн. ед., для максимальной светимости – 0,7 ± 0,2 отн. ед. [15].
При сравнении данных, полученных у нашего контингента обследованных, с нормативными показателями свечения был выявлен отчетливый тренд к увеличению всех трех параметров до лечения, но эти различия не достигали уровня статистической значимости.
Ранее в исследовании [16] был показан повышенный уровень свободных радикалов в эякуляте бесплодных мужчин.
На следующем этапе работы была дана оценка суммарной АОА эякулята до и после назначения препарата. При оценке Fe2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительность латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуду быстрой и медленной вспышки. Антиокислительные свойства спермоплазмы выражали в процентах от величины угнетения свечения модельной системы при добавлении к последней 0,1 мл спермоплазмы. До лечения данный показатель составил 38,2 ± 3,7 %, после лечения – 27 ± 2,9 % (р<0,05 по сравнению с контролем).
При сопоставлении данных, полученных при исследовании ЛЗХЛ и Fe2+-индуцированной ХЛ, привлекает внимание то обстоятельство, что на фоне терапии L-карнитином уровень светосуммы свечения в исследуемых образцах спермы уменьшался пропорционально степени угнетения свечения модельной системы, генерирующей АФК.
Выявленные методом регистрации ХЛ особенности состояния процессов липопероксидации в сперме инфертильных мужчин нашли подтверждение при определении в тех же образцах общей АОА и концентрации ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) (табл. 3).
Таблица 3. Содержание ТБК-РП и общей АОА спермоплазмы до и после терапии Карнитоном
Показатель | Группа обследованных | ||
Бесплодные мужчины | Фертильные доноры | ||
До лечения | После лечения | ||
ТБК-РП, нМ/мг белка | 0,48 ± 0,05 | 0,32 ± 0,05* | 0,33 ± 0,06 |
Общая АОА, нМ/мл | 1,0 ± 0,07 | 2,33 ± 0,22* | 2,54 ± 0,30* |
Примечание. *– достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05.
Из представленных в табл. 3 данных видно, что при бесплодии происходит накопление продуктов липопероксидации в семенной жидкости по сравнению с фертильными донорами.
По данным литературы, уровни ТБК-РП в семенной жидкости и в сперматозоидах практически идентичны, в отличие, например, от окиси азота [17]. На основании этого полученные нами результаты можно экстраполировать и на сперматозоиды, в которых также возможна активация свободнорадикальных процессов.
Для нормального функционирования сперматозоидов необходимо соблюдение тонкого равновесия между системами, обеспечивающими продукцию АФК и разрушение АФК. У мужчин при бесплодии наблюдается нарушение этого равновесия, что нашло отражение в повышении образования АФК.
В отличие от концентрации ТБК-РП суммарное содержание антиоксидантов (неферментативное звено защиты) в условиях наблюдения изменялось более существенно – обнаружено более чем 2-кратное увеличение этого показателя после приема L-карнитина. В результате антиоксидантная емкость спермоплазмы на фоне приема препарата фактически не отличалась от показателей фертильных доноров.
Протективное действие Карнитона было сопоставимо с эффектами прямого добавления антиоксидантных ферментов к цельной сперме, сперматозоидам или семенной плазме, как было показано в работах ряда авторов [18, 19], что позволяет рекомендовать использование Карнитона в комплексной терапии идиопатического мужского бесплодия.
Заключение
Очевидно, что нормализация антиоксидантных характеристик семенной жидкости является обязательной предпосылкой восстановления оплодотворяющей способности эякулята. Несмотря на прочную связь оксидативных повреждений с низким качеством спермы, мужчины очень редко проходят проверку на окислительный стресс или получают лечение от него, т. е. сам факт его существования игнорируется большинством специалистов по лечению бесплодия.
Рандомизированные плацебо-контролируемые исследования показывают, что антиоксидантная терапия защищает сперматозоиды от оксидативных повреждений и приводит к увеличению количества беременностей [13, 20]. Следовательно, разумно было бы использовать прием антиоксидантов во всех случаях мужского бесплодия, связанного с окислительным стрессом. В настоящий момент на Западе треть мужчин в бесплодных браках проходит такое лечение [21], что демонстрирует готовность пациентов принимать антиоксиданты в дополнение к традиционным процедурам, включая вспомогательные репродуктивные технологии.
Литература
1. Кузин хлорид (25 лет в клинической практике) // РМЖ. – 2003. – № 10. – С. 609–610.
2. Abd-Allah A., Helal G., Al-Yahya A. et al. Pro-inflammatory and oxidative stress pathways which compromise sperm motility and survival may be altered by L-carnitine // Oxid. Med. Cell. Longev. – 2009. – V. 2. – P. 73–81.
3. Zhou X., Liu F., Zhai S. Effect of L-carnitine and/or L-acetyl-carnitine in nutrition treatment for male infertility: a systematic review // Asia Pac. J. Clin. Nutr. – 2007. – V. 16 (Suppl. 1.) – P. 383–390.
4. , , Теодорович акросомальной реакции сперматозоидов в результате комплексной терапии карнитином, фруктозой и лимонной кислотой // Пробл. репрод. – 2003. – № 6. – С. 49–52.
5. De Rosa M., Boggia B., Amalfi B. et al. Correlation between seminal carnitine and functional spermatozoal characteristics in men with semen dysfunction of various origins // Drugs R. D. – 2005. – V. 6. – P. 1–9.
6. Yeste M., Sancho S., Briz M. et al. A diet supplemented with L-carnitine improves the sperm quality of Pietrain but not of Duroc and Large White boars when photoperiod and temperature increase // Theriogenology. – 2010. – V. 73. – P. 577–586.
7. Wang Y., Yang S., Qu C. et al. L-carnitine: safe and effective for asthenozoospermia // Zhonghua Nan Ke Xue. – 2010. – V. 16. – P. 420–422.
8. WHO laboratory manual for the examination of human sperm and semem-cervical mucus interaction. 4 th ed. – Cambridge: University Press, 1999.
9. , Лиховских методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. – Уфа: БГМУ, 2005. – 90 с.
10. , , Галимов активных форм кислорода в формировании мужской инфертильности // Казанский мед. журнал. – 2007. – № 4. – С. 23–24.
11. Said T., Kattal N., Sharma R. et al. Enhanced chemiluminescence assay vs colorimetric assay for measurement of the total antioxidant capacity of human seminal plasma // J. Androl. – 2003. – V. 24. – P. 676–680.
12. Клебанов антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. – 1988. – № 5. – С. 59–62.
13. Tremellen K. Oxidative stress and male infertility – a clinical perspective // Hum. Reprod. Update. – 2008. – V. 14. – P. 243–258.
14. Turner T., Lysiak J. Oxidative stress: a common factor in testicular dysfunction // J. Androl. – 2008. – V. 29. – P. 488–498.
15. , , Шемагонов регистрации активных форм кислорода в семенной жидкости для оценки фертильности. – Патент РФ на изобретение № 000 // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». – 2006. – № 8. – С. 674.
16. Iwasaki A., Gagnon C. Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients // Fertil. Steril. – 1992. – V. 2. – P. 409–416.
17. Gallardo J. Evaluation of antioxidant system in normal semen // Rev. Invest. Clin. – 2007. – V. 59. – P. 42–47.
18. Chi H., Kim J., Ryu C. et al. Protective effect of antioxidant supplementation in sperm-preparation medium against oxidative stress in human spermatozoa // Hum. Reprod. – 2008. – V. 23. – P. 1023–1028.
19. Martínez-Pastor F., Aisen E., Fernández-Santos M. et al. Reactive oxygen species generators affect quality parameters and apoptosis markers differently in red deer spermatozoa // Reproduction. – 2009. – V. 137. – P. 225–235.
20. Ross C., Morriss A., Khairy M. et al. A systematic review of the effect of oral antioxidants on male infertility // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – V. 20. – P. 711–723.
21. Zini A., Fischer M., Nam R., Jarvi K. Use of alternative and hormonal therapies in male infertility // Urology. – 2004. – V. 63. – P. 141–143.
