Индивидуальная чувствительность крыс к нейропептидам и ноотропам после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе (стр. 1 )

На правах рукописи

СТЕЦЕНКО

Владимир Петрович

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КРЫС

К НЕЙРОПЕПТИДАМ И НООТРОПАМ ПОСЛЕ МОДУЛЯЦИИ СИСТЕМ СТРЕССА И АНТИСТРЕССА В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

03.03.01 – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2013

Работа выполнена в Федеральном казенном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская
академия им. » МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор ,

доктор биологических наук профессор

Официальные оппоненты:

, доктор медицинских наук,

ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ,

начальник отдела обитаемости Научно-исследовательского центра

, доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. » МЗ РФ, заведующий кафедрой нормальной
физиологии

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский

университет им. » МЗ РФ

Защита состоится 25 июня 2013 года в 13.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 215.002.07 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ

( г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ.

Автореферат разослан «____» мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Борис Николаевич Богомолов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Концепция стресса, описывающая реакцию гипофизарно-надпочечнико­вой системы на действие факторов внешней и внутрен­ней среды, сформулированная канадским исследователем Г. Селье еще в 1930-е гг., до настоящего времени не устарела в основных ее прояв­лениях. Она была существенно дополнена в 1950-е гг., когда были от­крыты, описаны и изучены пептидные гормоны гипофиза и гипоталамуса (рилизинг-гормоны), однако принципиальных изменений не претерпела (, , 2003; , , 2005).

Кортикотропинрилизинг-гормону (КРГ), или кортиколиберину отводят роль центрального регулятора стресса, запускающего каскад гормональных и вегетативных реакций, участвующих в адаптации (, 2010). С другой стороны, были открыты и изучены белки теплового шока (БТШ), по мнению большинства исследователей ( и др., 2005; , , 2009), выполняющие роль антистрессорных агентов. БТШ вырабатываются в ответ на разные экстремальные воздействия среды и выполняют роль внутриклеточных шаперонов (Andreeva L. I. et al., 2004). Наиболее изучены БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ-70), представленные стабильной и индуцибельной формами, которые по-разному реагируют на внешние факторы среды. По сути, стрессорный ответ стали рассматривать как системный ответ организма, опосредованный действием гормональных факторов на исполнительные органы, в которых, в свою очередь, запускаются и антистрессорные системы (системы внутриклеточных шаперонов). Центральным органом системы стресса-антистресса является головной мозг. Любые внешние воздействия на эту систему существенно не меняют функционального значения отдельных образований системы гипоталамус → гипофиз → надпочечники → гипофиз (гипоталамус), но вся система может функционировать с большим или меньшим напряжением в зависимости от действия на нее стрессогенных факторов и их выраженности (силы).

Открытие внегипоталамической системы КРГ, локализованной главным образом в миндалине и гиппокампе (Alheid G. F., Heimer L., 1996; с соавт., 2006; , , 2007; Shabanov P. D., 2008; Shabanov P. D., Lebedev A. A., 2008), поставило ряд важных вопросов, в том числе: каково функциональное значение этих экстрагипоталамических рецепторов КРГ, сходно ли оно с функцией гипоталамических рецепторов и если нет, в какой степени они вовлекаются в реализацию центральных механизмов стресса, каково их значение в онтогенетическом развитии особи и, наконец, насколько они могут определять эффекты фармакологических веществ центрального действия?

Степень разработанности темы

Несмотря на явные успехи в выяснении многих вопросов, затрагивающих механизмы реализации стрессорного ответа и включения системы стресса-антистресса (стресс-активирующей и стресс-лимитирующей систем по терминологии , 2000), значительная часть из них остается недостаточно изученной (, 2012). Это касается, прежде всего, выяснения внутримозговых механизмов формирования реакции на стресс, ее нейромедиаторных, гормональных и нейропептидных компонентов, формирования стрессорной реакции в онтогенезе и ее нейрохимического обеспечения, наконец, возможностей управления стрессорной реакцией с помощью фармакологических средств.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение индивидуальной чувствительности самцов и самок крыс к нейропептидам после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе.

В задачи исследования входило:

1. Оценить поведенческие последствия у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода);

2. Оценить морфологические изменения в надпочечниках и эмоциогенных структурах мозга половозрелых крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе;

3. Оценить поведенческие эффекты пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина) у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе.

Научная новизна

В работе обоснован научный тезис, что модуляция систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе приводит к развитию у половозрелых животных девиантных форм поведения, заключающихся в изменении двигательных, исследовательских и эмоциональных компонентов поведения, а также индивидуальной чувствительности животных к действию пептидных препаратов ноотропного типа действия. В основе измененной реактивности организма лежат постстрессорные перестройки в эмоциогенных структурах мозга, отличающиеся в зависимости от природы вводимого стрессогена. К ним относятся избирательные дистрофические изменения в дофаминергических структурах головного мозга (прежде всего, в вентральной области покрышки, дающей начало медиальному переднемозговому дофаминергическому пучку, иннервирующему лимбические структуры мозга). Последствия дистрофических процессов в нейроглиальных комплексах эмоциогенных структур проявляются изменением поведенческих эффектов пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина), зависимых от пола животного. Трансформация ноотропных эффектов в большей степени касается эмоциональных реакций, которые могут меняться на противоположные (анксиолитический эффект на анксиогенный, антидепрессантный на депрессантный, и наоборот). Указанные изменения необходимо учитывать при оценке индивидуальной чувствительности к фармакологическим средствам вообще, и ноотропным препаратам, в частности.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическое значение работы состоит в доказательстве научного положения, что индивидуальная чувствительность к фармакологическим средствам ноотропного типа действия во многом определяется особенностями развития организма в раннем онтогенезе, включая даже однократные (!) стрессогенные воздействия. Последствия таких воздействий реализуются в программе развития субъекта и могут проявляться в половозрелом возрасте отклонениями (девиациями) исследовательской активности, двигательными нарушениями (по типу гиперкинетических), но, самое главное, эмоциональным реагированием на факторы окружающей среды, включая лекарственные средства. В условиях применения, например, ноотропных средств, предназначенных для восстановительных и реабилитационных целей у здоровых и больных субъектов, реактивность (индивидуальная чувствительность) может меняться, трансформируя биологический ответ из анксиолитической формы в анксиогенную, из антидепрессантной в депрессантную. Такая реактивность зависит также от половой конституции субъекта, причем имеются выраженные гендерные различия в индивидуальной чувствительности. Эти различия определяются сформировавшимися изменениями в эмоциогенных структурах головного мозга в процессе онтогенеза. Наконец, полученные данные доказывают необходимость проведения исследований по оценке действия лекарственных препаратов не только на самцах животных (как принято во всех странах мира), но и на самках, поскольку поведенческие эффекты у животных разного пола существенно отличаются друг от друга, часто трансформируясь в противоположные по знаку. В этом заключается практическая значимость настоящего исследования.

Методология и методы исследования

Методология исследования состояла в изучении поведенческих последствий у половозрелых самцов и самок крыс (389 крысят и половозрелых животных) после модуляции систем стресса (введение КРГ) и антистресса (введение БТШ-70) в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода) с помощью батареи тестов («открытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, ротационный тест, «чужак-резидент», тест Порсолта), морфологическом изучении изменений в надпочечниках и эмоциогенных структурах мозга половозрелых крыс после модуляции систем стресса и оценки поведенческих эффектов пептидных препаратов (ноопепта, дилепта и кортексина) у половозрелых самцов и самок крыс после модуляции систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе (7-е сутки постнатального периода). Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Военно-медицинской академии им. МО РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1.  Модуляция систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе однократным введением КРГ или БТШ-70 изменяет эмоциональное и двигательное поведение половозрелых животных, морфологию эмоциогенных структур головного мозга и эффекты пептидных препаратов ноотропного типа действия;

2.  Существуют гендерные различия в отсроченных эффектах модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе. У самцов эти различия сводятся к изменению, прежде всего, двигательных форм поведения, у самок – эмоциональных и исследовательских форм поведения;

3.  Ноотропные препараты пептидной природы (ноопепт, дилепт, кортексин) после модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе выявляют индивидуальную чувствительность, наиболее выраженную при оценке противотревожных и антидепрессантных эффектов препаратов;

4. Индивидуальная чувствительность ноотропных препаратов пептидной природы (ноопепт, дилепт, кортексин) после модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе связана с морфологическими перестройками в эмоциогенных структурах головного мозга крыс (черная субстанция, вентральная область покрышки, подлимбическое поле, поясные поля).

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность определяется большим количеством экспериментальных животных (389 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими, морфологическими, биохимическими и фармакологическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.

Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии имени , кафедры психиатрии и наркологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. , кафедры нервных болезней и психиатрии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. . Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ № и №).

Материалы диссертации доложены на XX съезде Всероссийского физиологического общества им. (Москва, 2007), Х научной конференции «Нейроиммунология-2007» (Санкт-Петербург, 2007), V Всероссийской научной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию (Санкт-Петербург, 2007), III съезде Российского научного общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2011), международной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Гродно, 2011). По теме диссертации опубликованы 14 научных работ (8 статей и 6 тезисов), из них 3 статьи в журналах списка, рекомендованных ВАК РФ. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии им. .

Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех эта-пах работы и состоял в планировании опытов, их непосредственном выполне-нии, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферата. Участие автора в вы-полнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, в написа-нии статей и тезисов – 90%, написании диссертации и автореферата – 95%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 3 раздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 31 таблицей. Библиографический указатель содержит 193 наименования, в том числе 84 отечественных и 109 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы и описывает современные представления о нейрохимических механизмах стресса и их становлении в онтогенезе.

Глава 2 включает описание основных методических приемов, которые были использованы при выполнении диссертации.

Глава 3 объединяет результаты собственных исследований автора.

Глава 4 представляет собой обсуждение полученных результатов.

В заключении обобщены основные перспективы исследования, приведены выводы, научно-практические рекомендации и список использованных литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор животных. Опыты выполнены на 389 крысах Вистар массой 200-220 г, выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Крысятам в возрасте 7 дней внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мкг/крысу КРГ (Sigma, США) или 5 мкг/крысу БТШ-70 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Животных содержали в однополых группах в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22±2оС. Все поведенческие опыты проводили на половозрелых животных в возрасте 90-100 дней в осенне-зимний период. После проведения всех поведенческих опытов животных декапитировали, извлекали надпочечники и мозг и готовили гистологические препараты.

Исследование поведения крыс в «открытом поле». Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля» (, , 2007), представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см с 16 отверстиями (норками) диаметром 3 см каждая. Продолжительность одного опыта составляла 3 мин. Регистрировали ряд элементарных двигательных актов и поз: горизонтальную и вертикальную активность, груминг, заглядывание в норки, дефекацию.

Исследование поведения в приподнятом крестообразном лабиринте. Лабиринт состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 мин.

Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент». Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте «чужак-резидент» в соответствии с описанием этологического атласа (, , 2007). Смысл методики состоит в том, что к крупному самцу, находящемуся в клетке (резиденту), подсаживают более мелкое животное (чужака). Регистрировали число поведенческих проявлений агрессивности и защиты, а также общее число поведенческих актов, описывающих взаимоотношение двух особей крыс.

Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта. Плавательный тест «отчаяния» Порсолта (Porsolt R. D., Bertin A., 1977) предусматривает оценку двигательной активности крыс, помещенных в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 27±1оС. Крысу помещали в цилиндр на 6 мин, регистрировали время активного и пассивного плавания и время иммобилизации. Увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации расценивали как антидепрессантный эффект.

Морфологические исследования. Надпочечники и головной мозг крыс в возрасте 3,5-4 мес. через 3 мин после декапитации фиксировали в 9%-ном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике. Производили ленточные серийные срезы головного мозга во фронтальной плоскости от лобного полюса правого полушария до рострального отдела моста. Шаг лезвия бритвы составлял 8 мкм, для последующей съемки на CCD Camera (320 КРixel) через микроскоп Laboval – 5 мкм. Срезы в гистологических микропрепаратах окрашивали гематоксилином-эозином и по Нисслю. Составление блоков иллюстраций производили с помощью системы Microsoft Windows XP (, 2006).

Фармакологические вещества для анализа. Для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения использовали отечественные синтетические пептиды ноопепт и дилепт (НИИ фармакологии им. РАМН, Москва), а также органопрепарат кортексин (, Санкт-Петербург), которые вводили половозрелым крысам в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно за 40 мин до тестирования перед каждым поведенческим тестом.

Статистическая обработка полученных материалов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 крыс. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, однофакторного дисперсионного анализа с последующим множественным межгрупповым сравнением по критерию Ньюмана-Кейлса.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Поведенческие последствия модуляции систем стресса и антистресса

в раннем онтогенезе (характеристика модели)

КРГ, вводимый на 7-й день постнатального развития (0,5 мкг/крысу) менял поведение половозрелых крыс. У самцов отмечено умеренное снижение вертикальной двигательной активности, груминговых реакций и эмоциональности в «открытом поле», агрессивных поведенческих реакций в тесте «резидент-интрудер», практически отсутствие анксиолитического действия в приподнятом крестообразном лабиринте и типичный антидепрессантный эффект (снижение вдвое времени иммобилизации) в тесте Порсолта. У самок регистрировали умеренное снижение горизонтальной активности при повышении эмоциональности в «открытом поле», возрастание общительности и агрессивности в тесте «резидент-интрудер», типичный анксиогенный эффект в приподнятом крестообразном лабиринте и депрессантный эффект в тесте Порсолта.

После введения БТШ-70 в раннем постнатальном периоде (на 7-й день жизни) также отмечали гендерные отличия в поведении половозрелых крыс. У самцов выявлено умеренное снижение эмоциональности без изменения двигательной и исследовательской активности в «открытом поле», снижение общительности и проявлений агрессии в тесте «резидент-интрудер», отсутствие выраженного анксиолитического эффекта в приподнятом крестообразном лабиринте и депрессивности/антидепрессивности в тесте Порсолта. Для самок было характерно снижение двигательной и исследовательской активности при сохранении низкой эмоциональности в «открытом поле», отсутствие изменений в тесте «резидент-интрудер», типичный анксиолитический эффект в приподнятом крестообразном лабиринте и умеренная антидепрессантная активность в тесте Порсолта (табл. 1).

Таблица 1

Поведенческие последствия модуляции систем стресса-антистресса

в раннем постнатальном периоде (7-й день жизни)

Показатели	Контроль	КРГ	БТШ-70
самцы	самки	самцы	самки	самцы	самки
«Открытое поле»
Число пересеченных квадратов	56,4±3,2	66,3±10,2	48,7±10,6	49,4±3,5*	46,2±14,9	33,6±1,3**
Число стоек	5,9±1,4	6,2±1,4	3,0±0,8*	10,4±1,6*	5,3±2,9	2,1±1,3*
Число заглядываний в норки	14,3±2,1	13,9±1,7	10,6±2,8	7,4±0,8*	11,3±6,6	7,3±3,1*
Акты груминга	6,5±1,2	4,9±1,5	2,3±1,4*	3,5±1,4	4,8±2,3	1,3±0,6*
Болюсы дефекаций	3,8±1,1	0,1±0,1	0,9±0,5*	2,0±1,6*	0,8±0,5*	0,2±0,2
«Резидент-интрудер»
Индивидуальное поведение	35,2±3,4	77,2±6,3	51,9±29,2	52,6±4,9*	70,2±10,9*	79,6±16,5
Коммуникативное поведение	47,1±5,1	24,5±7,1	40,1±17,7	44,3±3,4*	27,6±8,8*	22,4±16,2
Агрессивное поведение	18,2±5,6	0,2±0,2	5,9±3,3*	3,6±2,9*	0,1±0,1**	0,2±0,2
Защитное поведение	0,2±0,2	0,1±0,1	0,1±0,1	0,2±0,2	2,2±0,9*	1,2±0,8
Приподнятый крестообразный лабиринт
Время в открытых рукавах, с	19,6±3,7	39,4±2,7	26,3±9,9	11,8±4,0**	30,9±15,1	59,6±13,2*
Число выглядываний из закрытых рукавов	4,9±1,2	5,6±1,4	12,3±2,9*	4,3±0,9	10,1±2,6*	4,4±2,0
Число свешиваний с платформы лабиринта	4,9±1,6	6,2±1,4	2,1±0,8*	2,3±1,3*	0,4±0,2**	7,7±4,2
Число переходов через центральный отсек	2,8±1,2	1,7±0,6	1,4±0,6	1,6±0,7	2,6±0,7	0,9±0,9
Тест Порсолта на депрессивность (с)
Активное плавание	240±24	324±77	256±88	229±68	331±79	154±14*
Пассивное плавание	187±49	203±29	270±69	225±92	106±74	343±21*
Время иммобилизации	176±16	75±44	70±33*	151±28*	169±88	109±14
Число попыток выбраться	14±3	26±3	11±4	18±7	9±4	3±1***
Число нырков	4±2	7±3	5±3	3±2	5±3	3±1
Число грумингов	4±1	5±2	3±1	4±2	3±2	2±1*

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 в сравнении с соответствующим контролем.