На правах рукописи
До Минь Ха
УСТОЙЧИВЫЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ БИКАРБОНАТОВ
03.01.02 — Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА 2011
Работа выполнена на кафедре биоорганической химии биологического факультета МГУ им. .
Научный руководитель: | |
Доктор биологических наук, | |
Официальные оппоненты: | |
Доктор биологических наук, | |
Доктор биологических наук, |
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. РАН.
Защита диссертации состоится «22» июня 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. РАН Москва, ул. Косыгина,.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. РАН.
Автореферат разослан мая 2011 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 002.039.01
кандидат химических наук | |
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы: Углекислый газ и образующиеся при реакции СО2 с водой угольная кислота, бикарбонаты и карбонаты, которые в совокупности именуются углекислотой, присутствуют в разных соотношениях практически во всех природных водных системах. Все биологические жидкости, включая цитоплазму живых клеток и внеклеточные среды, являются бикарбонатными водными системами. Углекислота, образующаяся в организме при окислении органических соединений, играет важную роль в регуляции разнообразных биологических процессов. Так, при дефиците в организме углекислоты, подавляется дыхание как на уровне целого организма [Haldane J., 1927 and Henderson Y., 1938; и др., 1995], так и на клеточном уровне [Bicz W., 1960; Palet A. et al., 1991]. Углекислота влияет на активность многих ферментов, экспрессию генов, систему кровообращения, иммунные реакции [ и др., 2006]. Биологические эффекты углекислоты столь многообразны, что представителей семейства углекислоты можно считать универсальными регуляторами метаболизма.
Механизмы действия углекислоты на клеточном и молекулярном уровнях изучены в настоящее время недостаточно. Углекислота играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного баланса в биологических системах, но механизм ее действия не сводится только к этому фактору. Лишь в последнее время стали появляться работы, свидетельствующие о существенном влиянии углекислоты, в частности, бикарбоната на процессы с участием активных форм кислорода (АФК). c соавт. [1995] было обнаружено, что углекислота служит универсальным регулятором свободнорадикального гомеостаза клеток и тканей у живых организмов. Она влияет на активность супероксиддисмутаз, ксантиноксидазы и других ферментов, участвующих в процессах обмена АФК [Fridovich I. et al., 1976, 2004], на неферментативные окислительные процессы, протекающие в водных системах in vitro и in vivo [Medinas D. B. et al., 2007]. Влияние представителей семейства углекислоты на свободнорадикальные процессы обусловлено тем, что они реагируют с АФК и превращаются в относительно долгоживущие и селективно действующие на свои мишени карбонатные радикалы и пероксикарбонаты [Augusto O. et al., 2002]. Появляется все больше доказательств того, что как АФК, так и свободнорадикальные реакции с их участием служат универсальными регуляторами процессов жизнедеятельности на разных уровнях организации живых систем, а патогенное действие АФК связано с нарушениями регуляции их обмена [Ramasarma T., 1990; Thannickal V. J. and Fanburg B. L., 2000; Droge W., 2002; Voeikov V. L., 2001, 2007]. Поэтому изучение модулирующей роли углекислоты в действии АФК весьма актуально.
Каждая форма углекислоты имеет свои физико-химические свойства, и одним из важных факторов, обеспечивающих многообразие биологических эффектов, служит изменение их соотношения за счет изменения pH водной среды. Однако вода может и непосредственно участвовать в реализации модулирующего действия углекислоты на процессы с участием АФК. В настоящее время появились как экспериментальные [Pollack G., ], так и теоретические [Del Giudice E. and Preparata G., 1995] обоснования возможности расщепления воды на радикалы в мягких условиях, что должно сопровождаться развитием в ней окислительно-восстановительных процессов. Действительно, при действии на воду факторов весьма низкой интенсивности (звук, механическое перемешивание воды, замораживание-оттаивание, воздействие низкочастотными электромагнитными полями) вода служит источником АФК [Домрачев и др., 1992; и др. 1996; Ikeda S. et al., 1999; и др. 2001; Wentworth P., Jr. et al., 2001; Belovolova L. V. et al., 2009]. Учитывая чрезвычайно важную роль, которую играет углекислота как в биологических, так и в других природных водных системах, изучение реакций с участием АФК в водных растворах бикарбонатов может открыть дополнительные возможности для понимания механизмов влияния углекислоты на широкий спектр биологических процессов, что позволит эффективно управлять ими.
Цель данной работы заключалась в исследовании свойств и динамики свободно-радикальных реакций, непрерывно протекающих в водных растворах бикарбонатов, а также влияния разных физико-химических факторов на эти реакции.
Основными задачами исследования являлись:
Выявление присутствия супероксидных радикалов в растворах бикарбонатов с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спинового зонда тайрона (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты) и изучение зависимости сигнала ЭПР от концентрации бикарбонатов, рН, влияния физических (освещение) и химических факторов.
Изучение продукции АФК хемилюминесцентным методом в бикарбонатных растворах в ответ на внесение в них солей двухвалентного железа в присутствии и в отсутствие люминесцентного зонда люминола (ЛМ).
Исследование хемилюминесцентным методом с использованием АФК-зондов ЛМ и люцигенина (ЛЦ) продукции АФК в бикарбонатных и других буферных водных растворах, активированных внесением в них перекиси водорода в низких концентрациях.
Изучение влияния различных факторов (температуры, рН и др.), про - и антиоксидантов и слабых воздействий (космо-физические факторы, гидратированные фуллерены в малых и сверхмалых концентрациях) на параметры сопровождающихся хемилюминесценцией (ХЛ) свободнорадикальных процессов в бикарбонатных водных растворах.
Основные положения, выносимые на защиту:
В водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала, стационарный уровень которого возрастает с увеличением концентрации бикарбоната от 5 до 100 мМ. Интенсивность сигнала тайрона (ЭПР-зонда на супероксидный радикал) возрастает при освещении раствора белым и синим (l=455 нм) светом и максимальна при рН около 9,0. Сигнал отсутствует в дистиллированной воде и в растворах Ва(ОН)2 в этом диапазоне рН, что свидетельствует о специфической роли бикарбоната в продукции супероксидного радикала в воде.
При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Fe(II) или K3[Fe(CN)6] в микромолярных концентрациях регистрируется вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии люминесцентного зонда на АФК – ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна при значениях рН водных растворов 8,8-9,0. Интенсивность ХЛ снижается в присутствии тайрона – ловушки супероксидных радикалов и при добавлении каталазы, что свидетельствует о продукции супероксидного радикала и перекиси водорода в водных растворах бикарбонатов.
При внесении в водные растворы бикарбонатов H2O2 в субмиллимолярных концентрациях в присутствии ЛМ они становятся длительными источниками ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев. Интенсивность ХЛ возрастает при внесении в реакционные смеси FeSO4 в микромолярных концентрациях или пероксидазы и подавляется в присутствии каталазы и тайрона, что свидетельствует об участии H2O2 и супероксидного радикала в процессах, сопровождающихся ХЛ. В присутствии ЛЦ интенсивность ХЛ ниже, чем в присутствии ЛМ, и она затухает быстрее, но ее интенсивность вновь возрастает при повторном внесении ЛЦ в «затухший» раствор.
Гидратированные фуллерены (HyFn) в концентрациях выше 10 нМ снижают интенсивность вспышки ХЛ, индуцированной внесением Fe(II) в водные растворы бикарбонатов, а в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ. В водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, HyFn в диапазоне концентраций 10-11 – 10-20 M повышали интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ. При этом зависимость эффекта от дозы HyFn имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в области сверхмалых доз (10-16 – 10-15 M) и “мнимых” концентраций (<10-19 M).
Предложена гипотеза, позволяющая объяснить большинство полученных результатов с учетом особой роли водной среды в осуществлении незатухающих свободнорадикальных реакций в растворах бикарбонатов. Вода рассматривается, как двухфазная система, в которой одна из фаз может служить донором электронов.
Научная новизна исследования:
Впервые обнаружено спонтанное образование супероксидного радикала в водных растворах бикарбонатов, зависящее от концентрации бикарбоната и усиливающееся при освещении.
Впервые обнаружено, что при внесении в водные растворы бикарбонатов солей двухвалентного железа развивается вспышка ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии ЛМ. Интенсивность ХЛ максимальна в районе рН 8,8-9,0, что совпадает с максимумом сигнала ЭПР для водных растворов бикарбонатов.
Впервые обнаружено, что в водных растворах бикарбонатов, активированных перекисью водорода, развивается ЛМ-зависимая ХЛ, которая не затухает в герметично закрытых и изолированных от света сосудах в течение многих месяцев.
Впервые установлено, что гидратированные фуллерены в сверхмалых и «мнимых» концентрациях, повышают интенсивность устойчивой ЛМ-зависимой ХЛ водных растворов бикарбонатов, активированных перекисью водорода.
Впервые показано, что ЛМ в микромолярных концентрациях может выступать в роли усилителя ХЛ в течение чрезвычайно длительного времени (месяцы и годы), что свидетельствует о существовании механизма усиления им интенсивности излучения, сопровождающего свободнорадикальные реакции, который отличается от общепринятого.
Теоретическая и практическая значимость исследования:
Теоретическая значимость работы определяется тем, что она вносит определенный вклад в понимание механизмов участия углекислоты в биологических и других природных процессах, что даст возможность целенаправленно влиять на них.
Поскольку активированные перекисью водорода водные растворы бикарбонатов являются стабильными источниками ХЛ, не затухающей длительное время, и обладают чувствительностью к действию низкоинтенсивных физических и химических факторов, появляется возможность использовать их в качестве тест-систем для регистрации физических полей и исследования свойств препаратов, представляющих собой растворы биологически активных веществ в сверхмалых дозах.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (2008 г., ИБХФ РАН, Москва), Международном научном конгрессе: Наука. Информация. Сознание (2008 г.), XIII Международном Научном Конгрессе по Электрофотонике (2009 г.), VIII International Crimean Conference (2009, Sudak, Crimea, Ukraine), X Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (ОМИП-2009, МЭИ, г. Москва), The 26-th Progress In Electromagnetics Research Symposium (PIERS) (2009, Moscow), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (2009 г., Санкт-Петербург, СПб ГУ), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (2010 г., ИБХФ РАН, Москва).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в научных журналах и 12 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, содержит 2 схемы и 35 рисунков. Состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», « Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Литература». Библиографический список состоит из 126 ссылок, в том числе 31 источников на русском языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных результатов.
Первая глава содержит обзор литературы по теме данного исследования. В нем охарактеризована роль углекислоты в жизнедеятельности. Описаны процессы генерации АФК, карбонатных радикалов и пероксимонокарбоната в растворах бикарбонатов. Свойства структурированных вод и их роль в свободно-радикальных процессах, протекающих в водных системах. Рассмотрены свойства фуллеренов и их гидратированных форм как биологически активных агентов.
Вторая глава посвящена описанию оборудования, реактивов и методики экспериментов. В Разделе 2.1. описаны источники использованных реактивов, их характеристики, способы приготовления запасных и рабочих растворов реагентов. Для приготовления водных растворов использовали дистиллированную деионизированную воду, очищенную на приборе ELSICO-HPLC, электропроводность воды составляла 0,8 мкСм/см. Все реагенты были категории не ниже ЧДА (Reagent grade). Концентрации Н2О2 и люминола в запасных растворах уточняли спектрометрически перед их использованием. Различные буферные растворы готовили в соответствии с рекомендациями «Справочника биохимика» (М.: Мир, 1991). В экспериментах, в которых исследовали влияние на ХЛ гидратированных фуллеренов (HyFn), использовали препарат гидратированных фуллеренов С60 с концентрацией 1мМ в 5мМ NaHCO3, любезно предоставленный . Из исходных растворов HyFn делали серийные десятичные и сотенные разведения HyFn и вносили в 1 мл готовых бикарбонатных растворов по 10 мкл разведений до концентраций 10-9 – 10-20 М.
В Разделе 2.2. описаны методики измерения ХЛ и спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали радиоспектрометром ЭПР РЭ-1307 3-х-сантиметрового диапазона (ЭЗАН, г. Черноголовка). Условия регистрации спектров: мощность СВЧ-излучения 4 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 Гаусс. Измерения проводили при комнатной температуре 20-22оС в плоской кварцевой кювете (внутренний зазор 0,25 мм), куда помещали 35 мкл образца. В случае освещения образца использовали светодиод марки «LXHP-PRO 2» фирмы «Luxeоn LEDs» с длиной волны 455 нм с мощностью 5 Вт при 6,84 В. В качестве спиновой ловушки ЭПР был взят тайрон (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты), концентрация которого в образцах составляла 10 мМ.
ХЛ-излучение регистрировали работающими в режиме счета одиночных фотонов люминометрами - «Биотокс 7А», «Биотокс 7», «Биотокс-7С» (АНО «Инженерный центр-экология», Россия). «Биотокс 7» оснащен фотоумножителем ФЭУ-101 с диаметром фотокатода 1 см (темновой ток ~ 10 имп./сек) и имеет термостатируемую камеру для образца; «Биотокс 7А» – фотоумножителем 9750QB/1 (EMI Electronics) с диаметром фотокатода 5 см (темновой ток ~ 25 имп./сек). Область спектральной чувствительности обоих ФЭУ составляет 380-710 нм, а максимальная чувствительность лежит в области 450 нм; «Биотокс-7С» снабжен малошумящими ФЭУ-142 и ФЭУ-101, оба с диаметром фотокатодов 1 см (Россия) (темновой ток ~ 5 имп./сек) с областью спектральной чувствительности ФЭУ 300-600 нм, областью максимальной спектральной чувствительности 380-490 нм. ФЭУ в счетчиках расположены горизонтально и регистрируют излучение с боковой поверхности сосуда, помещенного в камеру для образца. Интенсивность излучения измеряли с дискретой 1 сек (имп./сек). Измерение излучения в большинстве случаев проводили из растворов объемом 1 мл, помещенных в пробирки «Эппендорф». В отдельных экспериментах использовали флаконы для сцинтилляционного счета или кварцевые и стеклянные кюветы. В экспериментах по измерению влияния температуры на ХЛ раствора кварцевую кювету с растворами помещали в медный блок, через полую стенку которого пропускали воду от водяных термостатов, один из которых подавал в блок горячую, другой – холодную воду. Система подачи воды включала краны для переключения подачи воды от термостатов, что позволяло повышать и понижать температуру растворов в кювете. В кювету помещали миниатюрный германиевый датчик температуры, сигнал от которого после преобразования АЦП поступал на компьютер, что позволяло одновременно регистрировать температуру раствора и ХЛ из него. Значения рН растворов измеряли на pH метре-иономере «ЭКСПЕРТ-001» (Эконикс-Эксперт – Россия). Все результаты поступали на компьютер в ASCII-кодах через собственные программы приборов. Полученные файлы переводили в графическую форму с использованием программ Statistica 8 и Microsoft Excel. В этих же программах статистически обрабатывались полученные результаты и строились графики.
В Третьей главе приводятся результаты исследования и их обсуждение.
В Разделе 3.1. описаны эксперименты по выявлению О2─●/НО2● в растворе бикарбонатов с помощью метода ЭПР. Как видно из рисунка 1, в темноте сигнал спиновой ловушки тайрона ЭПР регистрируется из раствора с 10 мМ, но не с 5 мМ NaHCO3. При освещении раствора с 5 мМ NaHCO3 уровень супероксидного радикала в нем становится достаточным для уверенной регистрации сигнала ЭПР. Следует отметить, что амплитуда сигнала ЭПР из 10 мМ раствора NaHCO3 возрастала при освещении в 3,6 раза, по сравнению с его уровнем в темноте. (рис. 1).
А. |
Б. |
|
| Рисунок 1. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона в темноте (А) и при освещении синим светом 455 нМ ( Б ) в растворах NaHCO3 (5 и 10 мМ). | |
Амплитуда спектров ЭПР тайрона зависит от рН (рис. 2). Как на свету, так и в темноте максимальная амплитуда характерна для раствора с рН 9,0. В воде с рН, доведенным 0,1N NaOH до 8,94, сигнал не наблюдался. Сигнал также не наблюдался в растворах Н2О2 (3 мМ) и в боратных буферах при значениях рН в диапазоне 8,5-9,4. Это свидетельствовало о необходимости ионов HCO3─/CO32─ для продукции супероксидных радикалов в растворе и о существовании оптимума рН для их продукции.
При одинаковом значении рН 8,9 амплитуды сигнала ЭПР тайрона возрастают с ростом концентрации HCO3─/CO32─ (рис. 3). Интересно отметить, что при оптимальном значении рН и при освещении, достаточный для регистрации сигнала ЭПР уровень супероксидного радикала имеется даже в 1мМ растворе бикарбоната.
|
|
|
Рисунок 2. Зависимость амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворе NaHCO3 |
| |
|
| |
| Рисунок 3. Амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворах NaHCO3 (1; 5; 25; 100 мМ) со значением рН 8,9 при освещении светом 455 нМ. | |
А.
Б.
Как видно на рис. 4, при добавлении в раствор NaHCO3 перекиси водорода
(3 мМ) амплитуда сигнала ЭПР спиновой ловушки тайрона при освещении раствора бикарбоната NaHCO3 (5 мМ) уменьшается на 45% по сравнению с контролем. При добавлении FeSO4 (10 мкМ) сигнал уменьшается лишь на 20%, а при одновременном добавлении Н2О2 и Fe(II), сигнал ингибируется на ~75%.
|
|
Рисунок 4. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона при освещении синим светом 455 нМ в растворе NaHCO3 (5 мМ) (линия 1), с перекисью водорода (3 мМ) (2), с FeSO4 (10 мкМ) (3), с перекисью водорода (3 мМ) и FeSO4 (10 мкМ) (4). |
В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в водных растворах бикарбонатов спонтанно образуется супероксидный радикал, стационарный уровень которого возрастает при освещении раствора. Таким образом, основной физиологический буфер представляет собой редокс-активную среду.
В Разделе 3.2. описаны эксперименты по изучению ХЛ растворов бикарбонатов. В Подразделе 3.2.1. показано, что в водных растворах бикарбонатов в ответ на добавление солей сульфатного двухвалентного железа FeSO4 (доноров электронов), возникает вспышка люминесценции, затухающая в течение нескольких секунд – нескольких десятков секунд с момента добавления соли. Максимальная амплитуда и светосумма наблюдалась при концентрации Fe(II) 5-10 мкM, однако развитие ХЛ происходило даже при концентрации Fe(II) 0,1 мкМ. Для усиления сигнала ХЛ вместе с Fe(II) в растворы бикарбонатов добавляли ЛМ (неспецифический зонд на АФК). При этом амплитуда вспышки излучения (Fe(II)-ЛМ-зависимая ХЛ) возрастала приблизительно в 10 раз. Оптимальная концентрация ЛМ составляла 5-10 мкМ. При добавлении к растворам бикарбонатов только ЛМ, ХЛ не наблюдается. Реагент Fe(II)-ЛМ использовали в дальнейших экспериментах для изучения влияния различных факторов на реакции, протекающие в водных растворах бикарбонатов.
А |
Б |
Рисунок 5. Излучение 1 мл свежеприготовленных растворов NaHCO3 (A) (концентрации указаны на графике) при добавлении в раствор реагента Fe(II)-ЛМ (10 мкМ/10 мкМ). Приведены средние значения для 3-х параллельных проб, разброс не выше 5%. Изменение излучения (Б) раствора NaHCO3 (5 мМ ) при его хранении при комнатной температуре. |
В подразделе 3.2.2 представлены результаты исследований зависимости сигнала Fe(II)-ЛМ ХЛ от рН. При добавлении реагента Fe(II)-ЛМ в свежеприготовленные растворы NaHCO3 или КHCO3, амплитуда вспышки ХЛ возрастает с ростом концентрации бикарбоната (рис. 5 А). При хранении этих растворов в контакте с воздухом амплитуды вспышек ХМ возрастали (рис. 5 Б). Оказалось, однако, что различия в интенсивности излучения растворов с разной концентрацией НСО3─ обусловлено различием в рН этих растворов – чем выше концентрация НСО3─ в водном растворе, тем выше значение в нем рН. При хранении водных растворов бикарбонатов в контакте с воздухом значения их рН возрастают.
Для выяснения рН-зависимости интенсивности ХЛ, индуцированной введением в раствор бикарбоната реагента Fe(II)-ЛМ, 5 мМ раствор NaHCO3 титровали NaOH и определяли амплитуду вспышки излучения и светосумму за 60 сек в диапазоне значений рН 7,5 – 10,5. Из графика на рисунке 6 видно, что амплитуда возрастает при увеличении рН до 9, затем резко снижается и вновь начинает расти в щелочной области при рН > 10. Диапазон рН, в котором значения светосумм индуцированных Fe(II) вспышек ХЛ в растворах бикарбонатов максимальны, был сдвинут ближе к рН 8,6. Учитывая, что значения рКа для углекислоты составляют: рКа1=6,35 и рКа2=10,3 (при 25оС), в диапазоне рН, оптимальном для развития индуцированной Fe(II) ХЛ, углекислота в растворе представлена более, чем на 90% бикарбонатом, но несколько процентов ее представлено СО32─.
Для выяснения роли ионов НСО3─ и роли рН в развитии индуцированной реагентами ХЛ, реагент Fe(II)-ЛМ вносили в образцы деионизированной воды, рН которой доводили до значений в диапазоне от 8 до 10,5 с помощью Ba(OH)2. В растворах Ba(OH)2 вспышек ХЛ при рН < 9,0 не наблюдалось и ХЛ появлялась лишь при значениях рН > 9,2. Отсутствие ХЛ в растворах Ba(OH)2 при значениях рН, оптимальных для ХЛ растворов бикарбонатов, может объясняться тем, что BaCO3 слабо растворим в воде, и концентрация бикарбоната, образующегося из СО2 воздуха, в них ничтожна.
| Рисунок 6. рН─зависимость амплитуд вспышек, индуцированных реагентом Fe(II)-ЛМ (концентрации по 10 мкМ), в растворе NaHCO3 (5 мМ), рН в котором доводили до разных значений NaOH. Представлены средние значения для 3-х параллельных образцов. |
Таким образом, вспышки ХЛ, наблюдаемые в ответ на введение в водные растворы бикарбонатов реагента Fe(II)-ЛМ в диапазоне рН до 9,0, обусловлены присутствием в воде бикарбоната, а ХЛ при рН > 9,2 связана со свободно-радикальными процессами другой природы.
В Подразделе 3.2.3. описаны результаты экспериментов по влиянию гидратированных фуллеренов С60 (HyFn) на Fe(II)-ЛМ-зависимые вспышки ХЛ в растворах бикарбонатов.
|
Рисунок 7. Концентрационная зависимость влияния HyFn на светосуммы за 1 мин вспышек ХЛ, индуцированных реагентом Fe(II)-ЛМ (10 мкМ/5 мкМ) в 1 мл NaHCO3 |
HyFn представляют собой водный раствор молекул фуллеренов, в котором каждая молекула С60 окружена многослойной водной оболочкой [Andrievsky G. V. et al., 2002]. HyFn в низких дозах эффективно предохраняют животных от окислительного стресса и формально ведут себя как особого рода антиоксиданты [Andrievsky G. V. et al., 2009]. Из данных, представленных на рисунке 7, видно, что при относительно высоких концентрациях гидратированных фуллеренов (100 нМ) они, действительно, выступают в роли антиоксидантов, подавляя интенсивность индуцированной ХЛ на 35%.
Но в концентрациях < 1 нМ, они усиливают ХЛ, индуцированную в растворе NaHCO3. В присутствии 0,1 нМ HyFn превышение над контролем составляет 22%, и этот эффект достоверен с р < 0,05. Повышение светосуммы ХЛ можно объяснить тем, что в суб-наномолярных концентрациях HyFn ускоряют протекание в растворах бикарбонатов свободно-радикальных процессов.
В Подразделе 3.2.4. описаны результаты экспериментов по изучению влияния тайрона (1 мМ) и каталазы (1,75 ед.) на индуцированные реагентами Fe(II)-ЛМ и K3[Fe(CN)6]-ЛМ вспышки ХЛ в растворах бикарбонатов. Каталаза несколько снижает амплитуды вспышек Fe(II)-ЛМ ХЛ в растворах NaHCO3 c рН 8,4 и 8,5 (рис. 8А), но эффект отсутствует при рН выше 8,6. Это может быть связано либо с тем, что при высоких значениях рН активность фермента снижается [Aebi H., 1984], либо с тем, что вклад реакции Фентона в развитие вспышки люминесценции при внесении в раствор бикарбоната реагента Fe(II)-ЛМ мало значителен по сравнению с вкладом других реакций, сопровождающихся ХЛ. Тайрон эффективнее снижает сигнал Fe(II)-ЛМ ХЛ в более широком диапазоне рН.
Для выяснения того, присутствует ли перекись водорода в растворе NaHCO3 в диапазоне рН, оптимальном для развития вспышки в ответ на добавление реагента Fe(II)-ЛМ, мы использовали другой реагент, K3[Fe(CN)6] - ЛМ, который часто применяют для определения присутствия в растворах перекиси водорода в широком диапазоне рН [Shevlin and Neufeld, 1970]. Каталаза и особенно тайрон подавляли индуцированные реагентом K3[Fe(CN)6]-ЛМ вспышки ХЛ из растворов NaHCO3 намного более эффективно, чем вспышки, индуцированные реагентом Fe(II)-ЛМ (Рис. 8Б).
Таким образом, в растворах бикарбонатов, во-первых, непрерывно происходит генерация АФК, в частности, супероксидного радикала и перекиси водорода, а, во-вторых, вклад, который вносят супероксид радикал и Н2О2 в развитие вспышки ХЛ при внесении в раствор реагента Fe(II)-ЛМ, является далеко не исчерпывающим. Можно предположить, что в развитие волны ХЛ при добавлении в раствор бикарбоната Fe(II) вносят вклад также и карбонатные радикалы, которые окисляют Fe(II) до Fe(III), а сами превращаются в исходные бикарбонат или карбонат-ионы [Alvarez, et al., 2007].
А |
Б |
Рисунок 8. Влияние каталазы (1,75 ед) и тайрона (1 мМ) на амплитуду вспышек ХЛ, индуцированной введением в раствор NaHCO3 (5 мМ) (А) реагента Fe(II)-ЛМ или (Б) реагента K3[Fe(CN)6]-ЛМ (конечные концентрации -- по 10 мкМ). рН растворов доводили NaOH до указанных значений. Каталазу добавляли в раствор NaHCO3 за 30 мин до внесения реагента, а тайрон – за 30 сек до внесения реагента. За 100% принимают максимальную амплитуду вспышек ХЛ в данном эксперименте. Данные представлены как средние значения из 3-х параллелей ± стандартные отклонения от среднего. |
В Разделе 3.3. представлены результаты, полученные при исследовании ХЛ-свойств водных растворов бикарбонатов, в которые вносили Н2О2. Недавно было обнаружено, что Н2О2 реагирует с HCO3─/СО2 с образованием пероксимонокарбоната (НООСОО─), [Richardson D. E. et al., 2003], при разложении которого возникает богатый набор АФК и повышается интенсивность окислительно-восстановительных и, в частности, свободно-радикальных реакций, протекающих в физиологических условиях [Medinas D. B. et al., 2009]. В связи с этим представляло интерес исследовать сопровождающиеся ХЛ свободно-радикальные процессы в водных растворах бикарбонатов, активированных введением в них Н2О2.
Как показано в Подразделе 3.3.1 в водных растворах бикарбонатов Na или К (1-5 мМ), к которым добавлена перекись Н2О2 (0,3-3 мМ), развиваются процессы с участием АФК, которые сопровождаются ЛМ-зависимой ХЛ даже без внесения в раствор Fe(II), хотя в присутствии Fe(II) интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ выше, чем в его отсутствие (рис. 9).
В отличие от быстро затухающей вспышки ХЛ, развивающейся в ответ на внесение в раствор бикарбоната реагента Fe(II)-ЛМ, в активированных Н2О2 растворах бикарбонатов, помещенных в герметично закрытые пробирки или запаянных в стеклянные ампулы, ЛМ-зависимая ХЛ не исчезает в течение многих месяцев и даже лет. На рисунке 10 представлена типичная многомесячная динамика излучения растворов натрия бикарбоната (5 мМ), находящихся в герметично закрытых пробирках «Эппендорф» (1 мл), в которые 14 октября 2008 года внесли Н2О2 (1,5 мМ) и ЛМ (5 мкМ). Каждая точка на графике в течение первых двух месяцев – среднее значение, полученное при измерении пяти идентично приготовленных и хранившихся между измерениями в одинаковых условиях образцов. Стандартные отклонения для каждой точки варьировали в разные дни измерений от 5 до 16%, т. е. наблюдаемые на графике колебания активности в большинстве случаев высоко достоверны.
|
|
Рисунок 9. ХЛ растворов NaHCO3 | Рисунок 10. ЛМ-зависимая ХЛ 1 мл раствора NaHCO3 (5 мМ), Н2О2 (1,5 мМ) в герметично закрытых пробирках «Эппендорф». Приведены средние значения излучения для 5-ти параллельных проб. |
Несмотря на тенденцию к снижению интенсивности ХЛ активированные Н2О2 растворы бикарбонатов сохраняют способность к ЛМ-зависимой ХЛ более полутора лет после их приготовления. Наиболее устойчивые и длительные сигналы ЛМ-зависимой ХЛ активированных растворов были получены при концентрации Н2О2 выше 0,15 мМ (оптимум концентрации в области 1,5-3 мМ), при концентрации бикарбонатов 5-10 мМ и ЛМ 5-10 мкМ. При концентрациях этих компонентов выше оптимальных ЛМ-зависимая ХЛ становится менее устойчивой.
В выше описанных экспериментах образцы между измерениями хранили в темноте, но для проведения измерений их было необходимо извлекать на свет и помещать в счетчик фотонов. Как описано в Подразделе 3.3.3, образцы при этом подвергались воздействию света и непроизвольно встряхивались. Чтобы исключить эти факторы, пробирку с излучающим раствором помещали в измерительную камеру счетчика одиночных фотонов «Биотокс 7», которую термостатировали при 21,5±0,1 оС с использованием водяного термостата и осуществляли непрерывную регистрацию ХЛ в течение нескольких недель. На рисунке 11 приведена типичная запись ЛМ-зависимого излучения из 5 мМ активированного раствора NaHCO3 за период с 02.02.09 по 07.02.09. Этот раствор активировали 3 мМ Н2О2 11 ноября 2008 г., а непрерывная регистрация излучения в счетчике была начата 26.01.09, т. е. приведенный на рисунке 11 график соответствует излучению, длящемуся уже более 2,5 месяцев. В течение нескольких дней тенденции к снижению интенсивности излучения не происходит, и оно варьирует с суточной ритмикой вблизи одной и той же средней величины.
Относительная стабильность интенсивности излучения резко нарушилась 9 февраля 2009 г. (рис. 1В 17:34 начался резкий подъем интенсивности излучения, а в 19:38 на кривой наблюдался пик (врезка А на рис. 12). В этот день в Москве наблюдалось полное лунное затмение, которое началось в 17:37, а полное затмение наступило в 19:38. Таким образом, начало роста интенсивности излучения и острый пик излучения совпали с двумя ключевыми моментами затмения.
|
|
Рисунок 11. Непрерывная регистрация ЛМ-зависимой ХЛ 5 мМ раствора NaHCO3, активированного Н2О2 11.11.2008. Приведены данные по излучению в течение 6 дней пребывания раствора в камере счетчика. | Рисунок 12. Продолжение регистрации излучения из образца, приготовленного 11.11.2008 г. в течение недели с 9 февраля по 15 февраля 2009 г. Пояснения в тексте. |
После затмения интенсивность излучения начала варьировать с характерным суточным ритмом на уровне, превышающем исходный в 2-3 раза. Через двое суток после начала затмения интенсивность излучения резко снизилась до значений, предшествовавших ему, а через 3 суток после затмения интенсивность излучения вновь возросла более чем в 2 раза, но вскоре упала до начального уровня. Интересно отметить, что на нисходящих ветвях излучения вновь наблюдались пики повышения его интенсивности, отстоящие друг от друга почти точно на 24 часа (врезки В и С).
После того, как интенсивность излучения вышла на уровень, предшествующий затмению, еще в течение нескольких дней наблюдались вспышки излучения, которых не было ни в период, предшествующий затмению, ни в последующие недели. Следует отметить, что счетчик с образцом в это время не подвергался никаким механическим воздействиям.
В Подразделе 3.3.4. показано влияние гидратированных фуллеренов в малых, сверхмалых и «мнимых» концентрациях на ХЛ активированных растворов NaHCO3. На рисунке 13 представлена динамика ЛМ-зависимой ХЛ 5 мМ растворов NaHCO3, активированных Н2О2 7 октября 2008 г., в которые внесли HyFn до конечных концентраций 10-12 – 10-9 М. В первые дни после приготовления образцов HyFn в концентрациях 10М либо не влияли, либо снижали интенсивность излучения из активированных растворов NaHCO3, тогда как в присутствии 10-12 М HyFn интенсивность излучения с самого начала была выше, чем в контроле.
|
|
Рисунок 13. Влияние HyFn на интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ из 5 мМ растворов NaHCO3, активированных Н2О2 (1,5 мМ). К – контроль (без HyFn), 1 – 10-9 М, 2 – 10-10 М, 3 – 10-11 М, 4 – 10-12 М HyFn в образцах. Представлены средние значения для 3-х параллельных образцов (стандартное отклонение от среднего – не выше 10%). | Рисунок 14. Влияние сверхмалых и «мнимых» концентраций HyFn на интенсивность ЛМ-зависимого излучения из растворов NaHCO3 (5 мМ), активированных Н2О2 (1,5 мМ). Данные приведены для 5-го дня после приготовления образцов. Представлены средние данные для 3-х параллельных проб. |
На рисунке 14 видно, что в диапазоне концентраций HyFn 10-20 – 10-9 М, зависимость доза-эффект носит немонотонный характер. Такая зависимость характерна для действия в разнообразных системах in vitro других биологически активных веществ в диапазоне сверхмалых и «мнимых» концентраций [Davenas E. et al., 1988; Maltseva E. L. et al., 1998]. Как отмечалось выше, влияние гидратированных фуллеренов на протекающие в активированных растворах бикарбонатов процессы объясняются, вероятнее всего, изменением состояния водной среды, в которой протекают свободнорадикальные реакции в растворах бикарбонатов.
В Подразделе 3.3.5. приводятся данные по влиянию различных анти - и про-оксидантов на протекающие в активированных растворах бикарбонатов процессы. Так, Fe(II) в диапазоне концентраций 1-100 мкМ, при внесении в растворы спустя несколько дней после запуска процесса, увеличивал в них интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ.
|
Рисунок 15. Влияние каталазы (20 ед./мл), тайрона (10-3 M) и пероксидазы (0,2 ед./мл) на ЛМ-зависимую ХЛ в активированных H2O2 (1,5 мМ ) растворах NaHCO3 (25 мМ) в присутствии ЛМ (5 мкМ).
Как видно на рисунке 15, пероксидаза хрена (0,2 ед./мл) усиливает ХЛ, каталаза в дозе 20 ед./мл через 3 минуты практически полностью ингибирует ХЛ, а тайрон (1 мМ) подавляет ее сразу. Полученные результаты подтверждают участие О2─● и Н2О2 в длительной стабильной ЛМ-зависимой ХЛ в активированных растворах бикарбонатов.
Подраздел 3.3.6. Для выяснения вклада рН раствора и специфичности НСО3─ в обеспечении длительной ХЛ активированных растворов бикарбонатов сравнили поведение деионизированной воды, рН которой доводили до разных значений с помощью NaOH или Ba(OH)2, боратного и фосфатного буферов с разными значениями рН, в которые вносили H2O2 (1,5 мМ), с поведением ЛМ-зависимой ХЛ активированного 5 мМ раствора NaHCO3 при разных значениях рН.
Образцы помещали в пробирки, которые герметично закрывали и в течение 1 недели регистрировали ЛМ-зависимую ХЛ из них. Как видно из рисунка 16, после 7-дневной инкубации образцов с рН в диапазоне 8,8 − 9,2 излучение из раствора NaHCO3 локально максимально. В щелочных водах длительная ХЛ отсутствует. Эти результаты указывают на важную роль HCO3─ в длительной ЛМ-зависимой ХЛ растворов, активированных перекисью водорода. Интересно отметить, что в фосфатном буфере при щелочных значениях рН, в который также вносили H2O2, тоже наблюдается длительная ХЛ, которая может быть связана с образованием пероксимонофосфата [LaButti J. N. and Gates K. S., 2009].
| Рисунок 16. рН-зависимость излучения из растворов: 1 – NaHCO3 (5 мМ); 2 – боратный буфер (5 мМ); 3 – фосфатный буфер (5 мМ); 4 – деионизированная вода с NaOH; |
В Подразделе 3.4. представлены результаты, полученные при регистрации ХЛ активированных H2O2 растворов бикарбонатов c использованием ЛЦ. ЛЦ представляет собой специфический ХЛ-зонд на супероксидные радикалы [Greenlee L. et al., 1962]. В присутствии ЛЦ в активированных растворах бикарбонатов наблюдается длительная ХЛ, но она затухает через 1-3 недели в зависимости от концентрации ЛЦ и H2O2. В отличие от ЛМ, для которого наблюдался оптимум концентрации в диапазоне 5-10 мкМ, с увеличением концентрации ЛЦ от 1 до 50 мкМ как интенсивность ХЛ, так и ее длительность росла. Добавление ЛЦ в реакционную смесь на стадии затухания реакции сопровождалось повышением интенсивности ХЛ, т. е., в отличие от ЛМ, ЛЦ расходовался в реакционной системе. Внесение тайрона (0,25 мМ) в активированные растворы с ЛМ полностью устраняло ХЛ, тогда как при использовании ЛЦ тайрон снижал интенсивность ХЛ на 75-80%. ЛМ, в отличие от ЛЦ, является зондом на все виды АФК. Полученные результаты свидетельствуют о ключевой роли супероксид радикала в развитии ХЛ в активированных растворах.
Заключение.
Для спонтанной генерации АФК в водных растворах бикарбонатов, служащих моделью биологических жидкостей, в них должен присутствовать источник электронов, обеспечивающий постоянное образование АФК. Таким источником электронов может служить вода. Исследования последнего времени свидетельствуют, что в воде сосуществуют фазы динамически организованной низкоэнтропийной воды и гораздо менее организованной (объемной) воды [Huang C. K. et al., 2009]. Размеры устойчивых наноассоциатов организованной воды в растворах ряда веществ в малых и сверх-малых концентрациях достигают сотен нанометров [ и др., 1999; и др., 2009] и даже микрон [Lo S. Y., 2009 ]. Вода, смачивающая гидрофильные поверхности («пограничная вода»), обладает свойствами жидкого кристалла. Ширина этой зоны (фазы) может составлять десятки и сотни микрон [Zheng J.-M. et al., 2006]. Пограничная вода, а также вода стабильных наноассоциатов заряжена отрицательно, и разность потенциалов между организованной и объемной водой достигает многих десятков милливольт [Pollack G. and Clegg J., 2008]. Таким образом, одна из водных фаз является потенциальным донором электронов. В соответствии с одной из моделей структурной организации пограничной воды, объясняющей целый ряд ее необычных свойств, в ней присутствуют квази-полимерные структуры с общей формулой (Н3О2)-n. [Pollack G., 2010]. По-видимому, в воде в отсутствие посторонних доноров и акцепторов электронов на границе между пограничной и объемной водой устанавливается динамическое равновесие:
(Н3О2)-n ßà n ( H2O + HO● + e-aq)
В водных растворах бикарбонатов это равновесие нарушается. НСО3─/СО32─ легко окисляются гидроксил радикалом HO● до карбонат-анион радикала (СО3─●). Регенерация квази-полимерной воды тормозится, и появляется возможность восстановления растворенного в воде кислорода до O2─\●/НО2●, которые регистрируются спиновой ловушкой
─ тайроном. При облучении пограничной квази-полимерной воды источниками видимого и ИК-света возрастают ширина ее зоны и ее электрон-донорная емкость, что может объяснить усиление сигнала тайрона при освещении бикарбонатного раствора [Chai B. et al., 2009]. Стационарной уровень супероксидного радикала определяется как скоростью его синтеза, так и скоростью устранения в реакции дисмутации и при рекомбинации с карбонатными радикалами, при которой регенерируются карбонаты [Mazellier P. et al., 2002]. В ходе этих реакций образуются продукты в электронно-возбужденном состоянии, в частности, синглетный кислород. Вспышку ХЛ в бикарбонатных растворах при добавлении Fe(II), можно лишь частично объяснить появлением в растворе H2O2. Гораздо быстрее Fe(II) окисляется СО3─● [Alvarez M. N. et al., 2007], и наличие вспышки излучения свидетельствует о спонтанной продукции этих радикалов в водных растворах бикарбонатов.
Появление длительной собственной и ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении в бикарбонатный раствор H2O2 связано, по-видимому, с тем, что при реакции H2O2 и НСО3─ образуется пероксимонокарбонат (НООСОО─). При его разложении возникает богатый набор АФК: СО3─●, HO●, O2─●/НО2● и синглетный кислород (1О2) [Lin J.-M. and Liu M., 2009]. Скорости протекания всех свободнорадикальных реакций в системе увеличиваются, что сопровождается увеличением интенсивности ХЛ, тогда как стационарные уровни АФК снижаются. Это отражается на уменьшении сигнала ЭПР тайрона. Протекающие в активированном водном растворе бикарбонатов реакции являются циклическими, т. е. расходования реагентов не происходит. Состояние водной среды небезразлично для устойчивого протекания этих сопряженных процессов, на что указывает влияние на интенсивность ХЛ HyFn в сверх-малых концентрациях, в которых они влияют на структурную организацию воды.
Таким образом, водный раствор бикарбонатов представляет собой активную среду, пребывающую в устойчиво неравновесном состоянии в течение чрезвычайно длительного времени. Поддержание такого состояния требует постоянного притока энергии извне. Поскольку облучение организованной воды ИК-светом в области 2-3 мкм существенно повышает ее электрон-донорную емкость [Chai B. et al., 2009], источником энергии может служить тепловая энергия и энергия внешних низкочастотных электромагнитных полей. В бикарбонатных растворах разность электрических потенциалов между организованной и объемной водой преобразуется в энергию свободно-радикальных реакций. Таким образом, бикарбонатные растворы исполняют роль «повышающих трансформаторов», преобразуя энергию низкой плотности в энергию высокой плотности ─ энергию электронного возбуждения. Поскольку все биологические жидкости представляют собой бикарбонатные растворы, описанные выше процессы должны, по-видимому, играть важную роль в поддержании устойчиво неравновесного состояния живых систем.
Выводы:
1. Показано что, в водных растворах бикарбонатов спонтанно происходит образование супероксидного радикала.
2. При внесении в водные растворы бикарбонатов солей Fe(II) регистрируется вспышка ХЛ. Интенсивность ХЛ возрастает в присутствии люминола, максимальна при рН 8,6-9,0, снижается в присутствии каталазы и тайрона.
3. Активированные H2O2 растворы бикарбонатов в присутствии люминола становятся длительными источниками ХЛ, интенсивность которой возрастает в присутствии пероксидазы и железа (II) и подавляется в присутствии каталазы и тайрона.
4. Гидратированные фуллерены (HyFn) в концентрациях 100 нМ и выше снижают интенсивность вспышки Fe(II)-ЛМ-зависимой ХЛ в растворах бикарбонатов, в концентрациях ниже 1 нМ усиливают ХЛ.
5. В диапазоне концентраций 10-20 – 10-9 M HyFn повышают интенсивность ЛМ-зависимой ХЛ растворов бикарбонатов, активированных H2O2. Зависимость эффекта от дозы HyFn имеет полимодальный характер.
6. Предложена гипотеза, позволяющая объяснить полученные результаты с точки зрения участия водной среды как двухфазной системы в свободно-радикальных процессах, спонтанно протекающих в растворах бикарбонатов.
Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
1. До Минь Ха, , , Андриевский гидратированных фуллеренов в суб-наномолярных концентрациях на окислительно-восстановительные реакции в водных средах и на активность ферментов. XII Международный Конгресс по биоэлектрографии. 5-7 июля 2008 г. Санкт-Петербург. Тезисы и труды Конгресса, с. 95-96.
2. , , До Минь Ха, , , Андриевский гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на макроскопические флуктуации скоростей реакций в водных системах. IV Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: Тезисы докладов. 28-29 октября 2008 г. М:РУДН, 2008, с. 24-25
3. До Минь Ха, , , Андриевский гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на щелочную фосфатазу и пероксидазу in vitro. IV Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: Тезисы докладов. 28-29 октября 2008 г. М:РУДН, 2008, с. 34-35.
4. , До Минь Ха, , , Малышенко перекисью водорода водные растворы бикарбонатов – длительный источник сверх-слабого излучения и чувствительная тест-система для физических и химических факторов крайне низкой интенсивности. Материалы Международной научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы обеспечения спорта высших достижений». Минск, 8-10 апреля 2009 г. Минск: БГУФК, 2009, с. 178-180.
5. , До Минь Ха, , , Малышенко раствор бикарбоната – модель биологических жидкостей, служащих источниками биофотонного излучения. Труды Х Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» 23-26 июня 2009 г. Москва. Издательский дом МЭИ. 2009, с. 406-409.
6. , До Минь Ха, , , Малышенко сверхмалых доз гидратированных фуллеренов и лизатов крови на сверх-слабое излучение водных растворов бикарбонатов. Труды Х Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» 23-26 июня 2009 г. Москва. Издательский дом МЭИ. 2009, с. 410-413.
7. , До Минь Ха, , , Малышенко раствор бикарбонатов – стабильный источник сверхслабого излучения и детектор сверх-слабых воздействий. Тезисы V Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург, 29.06.2009-03.07.2009, с. 46.
8. , До Минь Ха, , , Богачук неравновесное состояние водных растворов бикарбонатов. Proceedings of XIII International Congress on GDV Bioelectrography “Science. Information. Spirit.” St. Petersburg. July 4-5, 2009. St. Petersburg, с. 72-76
9. , До Минь Ха, , , Богачук A. С. Устойчиво неравновесное состояние и чувствительность к сверх-слабым факторам внешней среды бикарбонатных вод и их роль в биосфере. VIII Международная крымская конференция «Космос и биосфера». Судак, Крым, Украина, 28 сентября-3 октября 2009, с. 10-11.
10. Voeikov V. L., Do Minh Ha, Mukhitova O. G., Vilenskaya N. D., Malishenko S. I. Bicarbonate Aqueous Solutions Activated with Hydrogen Peroxide -- Long-term Sources of Low-level Photon Emission and Test Systems for the Effects of Ultra-weak Intensity Physical and Chemical Factors. Progress In Electromagnetics Research Symposium Abstracts, Moscow, Russia, August 18-21, 2009, p. 1024.
11. Voeikov V. L., Do Minh Ha, Mukhitova O. G., Vilenskaya N. D., Malishenko S. I. & Bogachuk A. S. Activated bicarbonate solutions as models of confined ontic open system and prototypes of living respiring systems. Int. J. of Design & Nature and Ecodynamics. 2010, Vol. 5, No. 1, pp. 30–38
12. , До Минь Ха, , , Буравлева водные растворы находятся в устойчиво неравновесном состоянии и реагируют на космические события. Материалы Международного научного Конгресса «Наука – информация – сознание» (Биоэлектрография). Санкт-Петербург, 3-4 июля 2010 г, с. 279-281.
13. , , До Минь Ха, Малышенко -активность карбонатных водных систем: роль в биологических процессах. «Биоантиоксидант»: Тезисы докладов VIII Международной конференции. Москва, 4-6- октября 2010 г. М.:РУДН, 2010, с. 85-87.
14. Voeikov V. L., Do Minh Ha, Vilenskaya N. D., Malishenko S. I., Bouravleva E. V. Bicarbonate aqueous systems exhibit sustained non-equilibrium state and display sensitivity to cosmic events. La Medicina Biologica, 2010 Ottobre-Dicembre № 4, pp. 45-53.
15. До Минь Ха, , , Воейков перекисью водорода водные растворы бикарбонатов – долговременные источники низкоинтенсивного излучения, реагирующие на слабые и сверх-слабые воздействия. Биомедицинская радиоэлектроника. 2011 № 2, с. 28-38.
