,
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ПОСТАНОВКЕ РЕАКЦИИ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ (Е-РОК)
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ
В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ
(подготовлены на кафедре микробиологии)
Для студентов, аспирантов и преподавателей
медицинского и аграрного факультетов
Москва
2006
Тема: Оценка количества Т-лимфоцитов в периферической крови человека с использованием метода спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
Цель занятия: Знать методику постановки реакции розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) для количественного учета Т-лимфоцитов периферической крови людей.
Основные вопросы:
1. Функции Т и В - лимфоцитов.
2. Реакции розеткообразования - как способ определения рецепторного аппарата Т и В - лимфоцитов.
3. Патологические состояния, связанные с нарушениями Т и В системы иммунитета.
4. Принципы реакции розеткообразования, ее учет и оценка результатов.
Самостоятельная работа:
1. Зарисовать результаты реакции розеткообразования, отметить основные типы розеток.
2. Подсчитать в препарате число Е-РОК (розеткообразующих с эритроцитами барана клеток). Определить % лимфоцитов, образующих розетки.
3. Оценить, руководствуясь нормальными показателями, состояние иммунной системы обследуемого пациента.
Методические указания к выполнению самостоятельной работы
Задание 1. Ознакомиться с принципом реакции спонтанного розеткообразозания с эритроцитами барана (Е-РОК) и знать область ее применения.
Важная роль в деятельности иммунной система принадлежит иммунокомпетентным клеткам.
Т-лимфоциты обеспечивают клеточные формы иммунного ответа, В - лимфоциты отвечают за активность гуморального иммунитета.
Определение уровней Т и В лимфоцитов входит в комплекс тестов, используемых для оценки иммунного статуса организма.
Изменение числа Т или В лимфоцитов может быть связано с угнетением или стимуляцией их образования в центральных органах иммунной системы (тимус, костный мозг), с нарушением их дифференцировки, изменением количественного соотношения отдельных субпопуляций и т. д. Для понимания регуляторных механизмов иммунитета и возникающей иммунопатологии следует рассмотреть основные этапы развития иммуноцитов. На рисунке 1 представлена схема лимфоидного звена гемопоэза.
При поражении системы на уровне гемопоэтической клетки нарушается весь процесс кроветворения. Блокирование образования лимфоидных стволовых клеток приводит к тому, что в периферической крови уменьшается количество всех лимфоцитов и соответственно снижается уровень Ig - глобулина в сыворотке.
Уменьшение или отсутствие в периферической крови Т-лимфоцитов при нормальном содержании В - лимфоцитов происходит по нескольким причинам:
1. Не образуются предшественники Т - клеток из лимфоидных стволовых клеток.
2. Отсутствует химический гуморальный фактор, обеспечивающий созревание Т - лимфоцитов, т. е. поражены эпителиальные клетки тимуса.
3. Блокировано образование одной или нескольких субпопуляций Т-лимфоцитов.
Аналогичные изменения наблюдаются и при образовании В - лимфоцитов.
Указанные сдвиги могут быть выражены в разной степени, что может проявляться как регуляторная реакция, а при глубоких нарушениях - как патологический процесс. Поэтому контроль за популяционным составом лимфоцитов имеет большое значение в оценке иммунного статуса организма.
Рис. 1. Схема лимфоидного звена гемопоэза.
HSC - гемопоэтическая стволовая клетка
LSC - лимфоидная стволовая клетка
РТС - предшественник Т-клеток
ТЕС - эпителиальная клетка тимуса
тнF - тимический гуморальный фактор
ТH - хелпер
ТE - эффектор
ТS - супрессор
РВС - предшественник В - клеток
B - лимфоцит
|
Bg
BA
Реакция розеткообразования является наиболее простым ориентировочным методом для определения количества Т и В лимфоцитов в общем пуле иммунокомпетентных клеток. Метод основан на способности Т-лимфоцитов человека взаимодействовать с эритроцитами барана, образовывая при этом структуры, напоминающие "розетки". Аналогичным образом В - лимфоциты взаимодействуют с эритроцитами мши. Постановка реакции с двумя видами эритроцитов позволяет определить число Т и В лимфоцитов в общем пуле иммунокомпетентных клеток. У здоровых людей Т-лимфоциты составляют 40-70%, а В - лимфоциты - 15-35% от общего числа лимфоцитов. Кроме клеток, образующих розетки, в периферической крови присутствуют лимфоциты, не взаимодействующие ни с одним из видов эритроцитов - это, так называемые, нулевые лимфоциты, т. е. недифференцированные клетки, количество которых в периферической крови не превышает 5-10% от общего количества всех лимфоцитов.
Поверхностные рецепторы у различных субпопуляций лимфоцитов имеют различную плотность, поэтому образуемые с ними розетки могут выглядеть по-разному. На одних лимфоцитах возможна фиксация 2-3 эритроцитов, на других - более трех. Иногда на одном лимфоците фиксируется так много эритроцитов, что их трудно сосчитать. В этом случае розетка имеет вид "Морулы".
Задание 2. Изучить принцип постановки реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-POK).
Лимфоциты, полученные из крови человека, смешивают с эритроцитами барана в соотношении 1:10, центрифугируют и выдерживают 1 час при +4°С.
Затем из этой смеси делают мазок, фиксируют спиртом и окрашивают метиленовым синим.
Микроскопируют с использованием иммерсионной системы при увеличении х900.
В препарате подсчитывают число свободных лимфоцитов и количество лимфоцитов, образовавших розетки. Лимфоцит от других форменных элементов крови отличается размером (=10 мкм), правильной округлой формой, плотным ядром строго округлой формы, окруженным тонким, почти незаметным ободком цитоплазмы. За "розетку" считают лимфоцит, к которому прикрепилось не менее 2 эритроцитов. В тетрадь зарисовывают микроскопическую картину реакции. Результаты подсчета лимфоцитов вносят в таблицу 1.
Таблица 1.
Количество Е-РОК у пациента
№ мазка | Число лейкоцитов | Число E-POK | % E-POK от общего числа лейкоцитов |
1 2 3 |
Полученные значения Е-РОК сравнивают с данными уровня Т-лимфоцитов здоровых людей соответствующей возрастной группы (табл.2.).
Таблица 2.
Уровень Т-лимфоцитов у здоровых людей
Возрастная группа (лет) | Уровень Т-лимфоцитов в % |
7-10 20-30 31-40 41-60 70-90 | 72±8 65±4 63±5 68±8 55±4 |
Делается предварительное заключение о состоянии Т-системы иммунитета у пациента.
Контрольные вопросы по теме:
1. Перечислите иммунокомпетентные клетки и укажите их функцию.
2. По каким причинам происходит изменение количества Т-лимфоцитов в периферической крови.
3. Для какой цели применяется реакция спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
4. Объясните принцип постановки реакции розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
5. Какое количество Т-, В - и недифференцированных лимфоцитов содержится в периферической крови здоровых людей.
Тестовый контроль
1. Методом количественной оценки Т-лимфоцитов периферической крови человека является реакция:
A) фагоцитоза;
Б) связывания комплемента;
В) спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК);
Г) розеткообразования с эритроцитами мыши;
Д) розеткообразования с эритроцитами, обработанными антителами и комплементом (ЕAC-PОK).
2. Реакция розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) считается положительной, если на 1 лимфоците адсорбируется:
A) один эритроцит барана;
Б) С3 фракция комплемента;
B) более 3-х эритроцитов барана;
Г) антиген бактерии.
3. У здорового человека в периферической крови количество Т-лимфоцитов составляет:
A) 5-10%;
Б) 40-70%;
B)15-35%.
4. При смешивании эритроцитов барана с лимфоцитами периферической крови человека образуются "Е-розетки" только с теми клетками, которые являются:
A) В – лимфоцитами;
Б) недифференцированными лимфоцитами;
B) Т - лимфоцитами
5. При смешивании эритроцитов мыши с лимфоцитами периферической крови человека образуются “Е-розетки” с теми клетками, которые являются:
А) В - лимфоцитами;
Б) недифференцированными лимфоцитами;
В) Т - лимфоцитами.
Ответы на тестовые вопросы
1 – В; 2 – В; 3 – Б; 4 – В; 5 – А.
