К вопросу определения мутации V617F в гене Янус-киназы - 2

575.224.22

К ВОПРОСУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИИ V617F В ГЕНЕ ЯНУС-КИНАЗЫ - 2

Е. Е. Ануфриева

Сибирский федеральный университет, г. Красноярск

Красноярский филиал гематологического научного центра

Минздрава России

Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) – группа клональных гематологических болезней, в основе патогенеза которых лежит опухолевая трансформациия с последующей пролиферацией миелоидных клеток, длительно сохраняющих способность к дифференцировке. В 2005 году была открыта точечная соматическая мутация (Jak2V617F) в гене Янус-киназы-2 (Jak2), которая ведет к постоянной активация Jak2, вне зависимости от связывания цитокинового рецептора со своим лигандом. Определение данной мутации имеет решающее значение для диагностики и мониторинга терапии полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза. Jak2 V617F мутационный статус и его аллельная нагрузка коррелируют с клинико-гематологической картиной больных эссенциальной тромбоцитемией. У лиц, позитивных по данному маркеру, наблюдается более высокий уровень нейтрофилов, большая скорость тромбообразования и риск возникновения миелофиброза. В связи с этим актуально определять данную мутацию не только качественными, но и количественными методами.

Целью работы явилось сопоставление результатов тестирования проб коммерческим набором для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени с данными определения аллельной нагрузки методом пиросеквенирования. Нами было проанализировано 116 проб крови пациентов с подозрением на ХМПЗ. В качестве объекта исследования использовалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови реагентами «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ Литех) и «ДНК – сорб - В» (Амплисенс).

При проведении определения мутации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с качественной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с набором «SNP-экспресс-РВ» (НПФ Литех) на амплификаторе iCycler iQ5 (BioRad) мы столкнулись с проблемой правильной интерпретации результатов. Разработчики предлагают схему интерпретации анализа соматической мутации аналогичную для наследственных мутаций, присутствующих во всех клетках. В соответствии с инструкцией, с образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Анализ осуществляется по кривым накопления фонового сигнала от каждого образца в каждом из задействованных каналов. Для гетерозиготного образца с наследственной мутацией разница циклов выхода кривых накопления флуоресцентного продукта с нормальным и мутантным вариантом должна быть меньше, либо равна 1,5. При анализе соматической мутации мы столкнулись с примерами, когда разница циклов составляла 1,68; 1,88; 2,2. В 36 образцах после ПЦР, прошедших как «гетерозиготы» и «гомозиготы» по мутантному аллелю, а так же с разницей в циклах от 1,68 до 4, мы количественно определяли мутацию V617F методом пиросеквенирования с применением системы генетического анализа серии PyroMark «АмплиСенс Пироскрин» на приборе пиросеквенатор PyroMarkТМ Q24 (Qiagen). Оценивалась зависимость разницы между циклами выхода кривых флуоресценции и аллельной нагрузкой. Из цикла выхода мутантного аллеля вычитали цикл выхода нормального, таким образом, для «гомозиготных» образцов по мутантному аллелю разница циклов была отрицательной.

Рис.1 Зависимость разницы циклов выхода кривых флуоресценции в РТ ПЦР от процента аллельной нагрузки.

Коэффициент ранговой корреляция Спирмена составил - 0,88 (Р <0,05). Выявлено, что при низкой аллельной нагрузке разница циклов может составлять от 2 до 5, что требует более корректного подхода к интерпретации результатов определения соматических мутаций данным методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Научные руководители – канд. биол. наук, доцент , канд. мед. наук, доцент , канд. биол. наук, профессор .