Строение белков

Лекция 4

СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ

В строении белков различают четыре уровня организации молекулы: первич­ную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Первые два уровня харак­терны для всех белков. Третичная и четвертичная структуры имеют место только у глобулярных белков.

Первичная структура белков

Образование пептидной связи

Первичная структура белков - это последовательность остатков аминокислот в полипептидной цепи. Порядок аминокислот в белке предопределен генетически последовательностью нуклеотидов в ДНК. Полипептид образуется путем взаимодействия карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой аминокислоты - пептидная связь.

"Голова" (NH2-) одной аминокислоты присоединяется к "хвосту" (-СООН) дру­гой аминокислоты. Между аминокислотами замыкается пептидная связь (-CO-NH-), являющаяся единственным типом связи в первичной структуре белка. Как видно из приведенной схемы, при образовании пептидной связи высвобождается вода. Раз­рыв пептидной связи при гидролизе сопровождается присоединением во­ды по месту расщепляемой связи. Конечный продукт гидролиза белков и полипеп­тидов - свободные аминокислоты.

Пептидная связь прочнее одинарных связей между углеродом и азотом, так как в результате таутомерии на 40% является двойной. По той же причине в полипептидной цепи вращение возможно только вокруг углеродных атомов, связанных с радикалом

Скелет у всех полипептидов одинаковый. Различаются полипептидные цепи характером и последовательностью радикалов. Называют полипептид по числу составляющих его остатков аминокислот: дипептидом, трипептидом и т. д.

Белками называют полипептиды, содержащие более 50 остатков аминокислот. Простейший белок - инсулин. Он содержит всего 51 остаток амино­кислот. Рибонуклеаза включает 124 остатка, гемоглобин 574.

В белках последовательность аминокислот, т. е. первичная структура, строго определенная. Замена остатка одной аминокислоты на другую дает уже но­вый белок. Так, в инсулине быка в девятом положении находится остаток серина, а в инсулине барана - глицина. В инсулине человека и лошади разли­чия касаются трех остатков аминокислот - восьмого, девятого и десятого. Все перечисленные инсулины имеют различную первичную структуру. Белки разных организмов с одинаковой функцией называются гомологичными.

Вторичная структура белков

Различают два основных типа вторичной структуры белков: спираль и складча­тый слой.

β-складчатый слой	α-спираль

Спирали. Благодаря свободному вращению связей вокруг α-углеродного атома в полипептидной цепи, нарушается линейность полипептидной цепи. Это приводит к образованию спиралей. Существует 3 разновидности спиралей.

1. Для кератина характерна α-спираль. Полипептидная цепь кератина как бы накручена на воображаемый цилиндр. Витки друг возле друга удерживаются водород­ными связями между кислородом одной пептидной связи и водородом другой пепти­дной связи. Водородные связи в 20 раз слабее ковалентных связей между кисло­родом и водородом, но благодаря их многочисленности они довольно прочно, удер­живают спираль.

2. β-спираль обнаружена в белке бакте­рий. Один виток р-спирали состоит из 22 остатков аминокислот, β-спираль - по­лая труба, α-спираль - заполненный цилиндр.

3. Ломаная спираль характерна для коллагена. Такая разновидность спирали является следствием высокого содержания в коллагене глицина и пролина с гидроксипролином - аминокислот, нарушающих "правильность" спирали.

Складчатый слой характерен для белка шелка - фиброина. Направление рядом лежащих цепей в складчатом слое противоположное (антипара­ллельны) Друг возле друга цепи удерживаются водородными связями.

Спирали и складчатые слои в фибриллярных белках часто дают сверх-вторичные структуры или суперспирали. Так, 7 α-спиралей кератина дают суперспираль. В свою очередь, 11 суперспиралей кера­тина образуют микрофибриллу волоса.

Вторичная структура глобулярных белков не столь однообразна как у фи­бриллярных белков. Так, в молекуле миоглобина спирализовано 77% полипептидной цепи и 23% не спирализовано. Степень спирализации ин­сулина - 60%, яичного альбумина - 40%, пепсина - 28%. Полипептидная цепь химотрипсина почти не содержит спирализованных участков, однако здесь есть складчатые, слои, петли, изгибы и т. д.

В структуре глобулярных белков с молекулярной массой свыше 20 тыс. Да раз­личают понятие домен - небо­льшие участки в 100-150 остатков аминокислот с характерной структурой. Их на­зывают структурными доменами.

Между доменами и отдельными структурными элементами внутри домена имеются так называемые шарнирные участки. Часто в одном белке обнаруживает­ся несколько похожих однотипных доменов.

Существует еще понятие функциональный домен. В последнем случае один или несколько структурных доменов вместе образуют функционально обособленный участок в молекуле белка: субстратную площадку, окружение актив­ного центра фермента или ингибитора, ионный канал в мембране и др.

Третичная структура - расположение полипептидной цепи (спирализованной, малоспирализованной или неспирализованной) в трехмерном пространстве.

Несмотря на кажущуюся беспорядочность глобулярного клубка, его строение строго определенное и имеет некоторые закономерности.

1.  Полипептидные цепи в глобуле упакованы очень плотно.

2.  Обычно полярные группы белка находятся на поверхности глобулы, а гид­рофобные радикалы спрятаны внутри нее.

Третичная структура белков удерживается следующими силами (см. рисунок):

а) дисульфидными мостиками, об­разующимися между остатками цистеина, расположенных на удаленных участках полипептидной цепи;

б) электростатическим притяжением между противоположно заряженными ионизированными группами (ионными связями);

в, г) водородными связями между пеп­тидными связями, между гидроксильными и карбокси­льными группами и др.;

д) ван-дер-ваальсовыми силами (например, гидрофобным взаимодей­ствием между радикалами гидрофобных (непо­лярных) аминокислот);

Все перечисленные силы слабые, но в ком­плексе способны удержать полипептидную цепь в уникальной конформации. Вместе с тем, благодаря непрочности этих связей, становятся возможными конформационные изменения в молекуле белка, необходимые для его фун­кционирования. Непроч­ность позволяет белку изменять структуру в зависимости от условий окружающей среды.

Четвертичная структура определяется количеством полипептидных цепей в молекуле белка. Не все белки имеют этот уровень структуры, а только олигомерные, в которых 2 и более полипептидных цепи. Отдельные цепи со своей вторичной и третичной структурой называются протомерами олигомерного белка. Так, молекула гемоглобина состоит из 4 полипептидных цепей (протомеров). Четвертичная структура олигомерных белков удерживается теми же силами, что и тре­тичная структура, с той лишь разницей, что они объединяют разные полипептидные цепи.

Свойства белков

Растворимость белков

Белки обладают различной растворимостью в воде (смотри классификацию белков). Будучи коллоидно-дисперсными системами, растворы белков менее устойчивы по сравнению с истинными растворами солей и других веществ. Молекулы белка в растворах склонны к агрегации и седиментации. Гидратная оболочка повышает устойчивость белков в растворах. Эта оболочка образуется вследствие гидратации отдельных гидрофильных групп белка: карбоксильной, аминной, гидроксильной, тиоловой и пептидной связи. У глобулярных белков эти группы нахо­дятся на поверхности глобулы. Гидратная оболочка препятствует объединению (агрегации) молекул белка и, следовательно, разъединяет их.

Другой фактор устойчивости белка - заряд. В растворе при определенных условиях все молекулы данного белка имеют одинаковый по знаку и количеству заряд. Благодаря этому молекулы электростатически отталкиваются друг от друга, не объединяются и не выпадают в осадок.

Лишение белка одного из факторов устойчивости часто приводит к выпадению белка из раствора в осадок. Так, при добавлении к раствору белка достаточного количества солей щелочных и щелочноземельных металлов, спирта или ацетона бе­лок выпадает в осадок. Это осаждение называется высаливанием. Ме­ханизм высаливания заключается в том, что ионы солей и молекулы спирта и ацетона, имея мощную собственную гидратную оболочку, отнимают воду у молекулы белка. Разные белки высаливаются при разной концентрации солей. Глобулины высаливаются в полунасыщенном растворе сульфата аммония, а альбумины только в насыщенном растворе этой соли. Фракционное высаливание используется для разделения и очистки белков.

Некоторые белки выпадают в осадок при рН, соответствующем изоэлектрической точке. Так, казеин осаждается при рН 4,7, поскольку при этом значении рН молекулы не имеют заряда и быстро агрегируются в крупные, неустойчивые в рас­творе частицы. Другие белки более устойчивы, и для их осаждения необходимо воздействие на оба фактора устойчивости белков.

Диализ белков

Диализ. Черные кружки - молекулы белка, белые кружки - молекулы хлористого натрия

Благодаря крупным размерам, молекулы белка не проникают через некоторые пленки; целлофан, рыбий пузырь и др. Это свойство используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, т. е. для диализа.

В целлофановый мешок наливается раствор белка с примесью солей, мешок поме­щается в сосуд, через который протекает дистиллированная вода. Мелкие ионы солей и др. вещества проникают через целлофан в во­ду и удаляются, а раствор белка остается в мешке.

Заряд белка

В составе белка, как правило, сумма кислых, отрицательно заряженных ами­нокислот (глутаминовой, аспарагиновой) не равняется сумме основных, положи­тельно заряженных аминокислот (лизина, аргинина, гистидина). В си­лу этого белки в воде имеют заряд либо положительный, либо отрицательный. При подкислении рас­твора такого белка, (в избытке Н+), будет подавляться ионизация карбоксильных групп и наступает такой момент, когда сумма положительно заряженных групп будет равна сумме отрицательно заряженных. В этом случае молекула белка в целом не имеет заряда. Такое состояние белка называется изоэлектрическим, а рН, при котором наступает изоэлектрическое состояние, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). ИЭТ - одна из важнейших характеристик белка.

При дальнейшем подкислении раствора белок становится положительно заряженным. Происхо­дит перезарядка молекул белка. Если же взять положительно заряженный белок, то при подщелачивании он приобретает вначале изоэлектрическое состояние, а затем становится заряженным отри­цательно.

Общее правило такое: белок при рН ниже ИЭТ за­ряжен положительно и является катионом, а при рН выше ИЭТ заряжен отрицательно и является анионом.

Различие в заряде белков позволяет разделить их в постоянном электриче­ском поле. Этот метод разделения называется электрофорезом.

В основе ионообменной хроматографии также лежит различие в заряде раз­деляемых веществ смеси.

Денатурация белков

Денатурацией называется любое негидролитическое изменение структуры белков, сопровождающееся изменением их биологической активности и функции. Денатурацию могут вызвать многие факторы: кипячение, высокая темпе­ратура, ультрафиолетовое и ионизирующие излучение, избыточное давление, соли тяжелых металлов, экстремальные значения рН (крепкие кислоты и щелочи), неко­торые органические соединения.

Нагревание и различного вида излучения разрушают в белке водородные и ионные связи. Сильные кислоты, щелочи и концентрированные растворы солей раз­рывают ионные связи. Тяжелые металлы дают прочные связи с карбоксианионами и разрывают ионые связи. Органические растворители и детергенты нарушают гидро­фобные взаимодействия и разрывают водородные связи в белках.

При денатурации изменяются или разрушаются все слабые связи в белке: во­дородные, электростатические, гидрофобные и т. д., но остаются нетронутыми пе­птидные связи.

Признаками денатурации являются:

1)  изменение растворимости. Растворенный в воде белок выпадает в осадок или, наоборот, нерастворимый белок переходит в раствор;

2)  изменение оптической активности, например, угла вращения плоскости по­ляризованного луча;

3)  появление новых реакционноспособных групп, спрятанных до денатурации внутри белковой глобулы;

4)  главный и первый признак денатурации - потеря функции. Структурный белок становится рыхлым, ферменты теряют каталитическую активность и т. д.

После освобождения от денатурирующего агента белок постепенно приобрета­ет свои первоначальные свойства. Этот процесс называется ренатурацией.

Оптические свойства белков

За исключением хромопротеинов белки не имеют окраски. Белки поглощают ультрафиолетовый свет с максимумом при λ=280 нм за счет аромати­ческих аминокислот. Второй максимум поглощения при λ=216 нм принадлежит пептидной связи.

Растворы белков прозрачны, но обладают опалесценцией - при боковом осве­щении просматривается мутность. Перечисленные свойства используются для количественного опреде­ления белка.

МОНОНУКЛЕОТИДЫ

Мононуклеотиды - соединения, построенные из пуринового или пиримидинового основания, рибозы или дезоксирибозы и ос­татка фосфорной кислоты. Фосфат в мононуклеотиде чаще всего присприсоединяется к пятому уг­леродному атому рибозы.

Функции мононук­леотидов:

1) являются мономерами нуклеиновых кислот,

2) их производные принимают участие в энергетическом обмене, например АТФ,

3) некоторые моно - и динуклеотиды являются коферментами (ФАД, НАД, ФМН и др.)

Наиболее часто в нуклеотидах встречаются пять азотистых оснований: с пуриновым ядром: аденин, гуанин; с пиримидиновым ядром: урацил, цитозин, тимин.

Пурин Гуанин Аденин	Пиримидин Цитозин Тимин Урацил

Кроме перечисленных оснований, встречаются метилированные, серосодержащие и др. производные азотистых оснований. Их называют минор­ными основаниями. Например, у прокариот встречаются: риботимидин, инозин, ксантин, гипоксантин и др. Всего известно около 60 азотистых оснований.

Азотистые основания и соединения, построенные из них, интенсивно погло­щают свет в ультрафиолетовой области (260-280 нм). Это свойство используется для количественного определения веществ, содержащих в своем составе азотистые основания.

Соединения, построенные из азотистого основания и рибозы или дезоксирибозы, называются нуклеозидами. В зависимости от строения пентозы различают рибонуклеозиды и дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды легко расщепляются кислотами, но устойчивы к щелочам Нуклеозиды, к которым присоединены два или три остатка фосфорной кислоты называются нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатами.

Нуклеозидди - и нуклеозидтрифосфаты (АДФ, АТФ, ГТФ, УТФ и т. д.) содержат богатые энергией связи - макроэргические связи. Они обозначаются знаком ~ тиль­да. В отличие от обычной фосфатной связи, при гидролизе макроэргической связи высвобождается большое количество энергии, используемое клеткой.

Важным производным нуклеозидов является цАМФ. Она образуется из АТФ при участии фермента аденилатциклазы. цАМФ участвует в регуляции метаболических процессов в клетке. В частности, она выполняет роль второго посредника в действии некоторых гормонов на клетку.

Соединения, построенные по типу нуклеотидов, входят в состав некоторых сложных ферментов, выполняя роль коферментов. Часто в составе таких кофермен­тов обнаруживаются азотистые вещества, отличающиеся по строению от пуриновых и пиримидиновых оснований. Они не синтезируются в организме животных, а поступают с пищей (витамины).

Флавинмононуклеотид (ФМН) - фосфорилированный рибофлавин (витамин В2).

Флавинадениндинуклеотид (ФАД) состоит из двух нуклеотидов АМФ и ФМН.

АМФ

ФМН

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) состоит из АМФ и второго нуклеотида, включающего в качестве азотистого основания никотинамид - витамин РР.

Нуклеотид с никотинамидом

НАД

АМФ

Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) отличается от НАД тем, что АМФ этого динуклеотида фосфорилирована по гидроксилу третьего углерода рибозы.

Перечисленные выше соединения входят в состав дегидрогеназ - ферментов, осуществляющих транспорт электронов и протонов в окислительно - восстановительных ре­акциях.

Кофермент А (коэнзим А, коА) состоит из фосфорилированной АМФ и фосфопантотеина (фосфорилированный витамин B3).

Фосфопантотеин

коА

Фосфорилированная АМФ

Коэнзим А осуществляет активацию и перенос ацильных радикалов, которые с помощью тиоэфирной связи присоединяются к SH-гpyппe.

В зависимости от переносимой кислоты соединения называют: ацетил-коэнзим А, малонил-коэнзим А, сукцинил-коэнзим А.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты - дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК) являются полимерами из дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов соответсвенно. Мононуклеотиды в нуклеиновых кислотах соединяются через остаток фосфорной кислоты между пятым углеродом рибозы и третьим углеродом рибозы соседнего нуклеотида.

Строение ДНК

В 1950 году Чаргафф обнаружил ряд закономерностей в нуклеотидном составе ДНК, которые впоследствии были названы правилами Чаргаффа. Вот эти правила: 1) Пур=Пир, 2) А=Т, 3) Г=Ц, 4) А+Ц=Г+Т. Правила"Чаргаффа помогли сформулиро­вать комплементарную модель строения ДНК.

Первичная структура ДНК представлена полинуклеотидными цепями.

Структура ДНК

Есть ряд закономерностей в цепочках ДНК:

1) У вирусов и прокариот почти вся последовательность ДНК уникальна, у эукариот 30-40% ДНК составляют повторяющиеся последовательности, особенно много повторяющихся участков в ДНК в области центромеров.

2) Цепи ДНК не имеют разветвлений.

3) В ДНК много (тысячи) обратно бегущих последовательностей - палиндромов, "перевертышей". Примеры перевертышей в русском языке: "нажал кабан на бакла­жан". Палиндромы образуют крестообразные структу­ры - шпильки, играющие существенную роль в регуляции экспрессии (работе) генов.

Вторичная структура ДНК

В 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик установили, что ДНК - это двойная спираль антипараллельных полинуклеотидных цепей. Удерживаются цепи друг возле друга водородными связями, образующимися между азотистыми основаниями, причем между аденином и тимином связь двойная, а между цитозином и гуанином - тройная. Снаружи двойной спирали ДНК расположен сахарофосфатный остов.

cпираль А cпираль В cпираль Z

Комплементарно связанные азотистые основания обращены вовнутрь. В стопке азотистые основания смещены относительно друг друга. Существует несколько разновидностей спирали ДНК:

1) спираль типа В, обнаруживается при репликации ДНК;

2) спираль типа А, наблюдается при транскрипции;

3) спираль типа Z, закрученная влево, а не вправо как спираль А или В, бывает при кроссинговере.

4) Описаны еще спирали типа С и SBS. Последняя не закручена.

У вирусов может встречаться одноцепочечная ДНК.

Третичная структура ДНК

У прокариот молекулы ДНК кольцевые. У эукариот концы ДНК свободны - это линейная форма ДНК. У вирусов бывают линейные и кольцевые ДНК.

У прокариот нет ядра. У них ДНК вместе с белками прикрепляется к цитоплазматической мембране, образуя нуклеоид.

У эукариот ДНК отделена от остальной части клетки ядерной мембраной. В интерфазе ДНК эукариот сосредоточена в хроматиновых нитях. Хроматин, кроме ДНК содержит белки. 50% белка хроматина - гистоны. Гистоны содержат большое число остатков диаминокарбоновых кислот: аргинина и лизина. Это очень консервативные глобулярные белки практически одинаковые у всех эукариот. Вторая половина белков хроматина - негистоновые белки, характеризующиеся большим разнообразием.

В хроматине рассматривается несколько уровней организации:

1) Нуклеосомы. На ядре из четырех пар молекул гистонов на­мотано почти два витка ДНК. Это - кор. Между корами расположен линкер - 40 пар нуклеотидов, частично покрытых гистоном и (или) негистоновыми белками или вообще не покрытых белками. Гистоны участвуют в активации и репрессии генов на уровне транскрипции.

2) Соленоиды: 6-10 нуклеосом дают один виток соленоида.

3) Петли. На скелете из негистоновых белков обнаруживаются петли в 30-90 тыс. пар нуклеотидов, у которых начало и конец располагаются рядом.

4) Высшим уровнем организации ДНК у эукариот является хромосома. Основу хромосомы сотавляет белковый матрикс, к которому крепится ДНК. На концах хромосомы находятся участки ДНК, называемые теломерами. С теломер может начинаться реп­ликация; теломеры защищают концы хромосом от деградации.

При каждой репликации теломеры укорачиваются. Достигнув определенной критически малой величины теломер, клетка гибнет. Теломераза - фер­мент, восстанавливающий длину теломеров, делает клетку бессмертной. Теломе­раза есть в половых, стволовых и раковых клетках, в других клетках ее нет. В центре хромосомы находится центромера - тоже некодирующая ДНК, обеспечивающая правильное расхождение хромосом при делении клеток.

Большая часть ДНК находится в петлях. Здесь расположены гены. В каждой петле локализованы один или несколько генов. С матриксом хромосомы пе­тли взаимодействуют некодирующими участками ДНК.

Физико-химические свойства ДНК

Хромосома - это одна молекула ДНК. У прокариот всего одна хромосома. Раз­меры ДНК различны от 5000 нуклеотидов у вирусов до 5 млрд (ее длина - 8см) у человека. Длина ДНК всех хромосом одной клетки че­ловека около 2 м.

ДНК - белая волокнистая масса. Растворы очень вязкие. Вязкость увеличивается с увеличе­нием молекулярной массы. Растворы ДНК поглощают ультрафиолетовый свет с мак­симумом при 260 нм. ДНК в воде заряжена отрицательно.

В кислой, щелочной средах при температуре° С в присутствии формамида, мочевины и ряда др. факторов происходит расхождение полинуклеотидных цепей ДНК - денатурация. При денатурации разру­шаются водородные связи - ДНК "плавится". Температу­рой плавления считается такая, при которой ДНК денатурирует напо­ловину (разрушена половина водородных связей). При плавлении наблюдается по­вышение оптической плотности растворов при 260 нм - гиперхромный эффект.

Чем больше в ДНК Г-Ц пар, тем выше температура плавления, потому что Г-Ц пары прочнее, чем А-Т, поскольку удерживаются тремя водородными связями.

После снижения температуры денатурированная теплом ДНК восстанавливает свою вторичную структуру, происходит ренатурация, или отжиг, кислоты.

Если ДНК разных источников в смеси подвергнуть денатурации и отжигу, то произойдет гибридизация чужеродных цепей ДНК по законам комплементарности. Возможна гибридизация цепей ДНК и РНК. В этом случае образуется гибридная нуклеиновая кислота, в которой одна цепь - РНК, другая - ДНК.