Онкомаркеры папиллярного рака щитовидной железы

на правах рукописи

РОЖКОВА

Екатерина Борисовна

ОНКОМАРКЕРЫ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

/14.00.15. – «Патологическая анатомия»/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени Росздрава

Научный руководитель – академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Пальцев.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится « » 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.01. при ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени Росздрава ( Москва, Трубецкая ул., д.8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени Росздрава ( Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан « » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Владимир Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Варшавский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

На долю рака щитовидной железы (РЩЖ) приходится от 1 до 4 % всех злокачественных опухолей, а как известно, смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире. Эксперты ВОЗ разрабатывают новые подходы к диагностике РЩЖ, в которых рекомендуется использовать сочетание морфологического метода с молекулярно-биологическими и генетическими с определением биомолекулярных маркеров опухоли (ВОЗ, 2005). Изучение биомолекулярных маркеров и генетической нестабильности в РЩЖ имеет важное значение для определения ее злокачественного потенциала и выбора терапии.

Одним из основных свойств опухоли является автономный безудержный рост, регуляция которого происходит по различным митогенетическим путям. Каждая опухоль может быть индивидуальна в плане активации тех или иных митогенетических цепочек (МЦ), но в то же время могут существовать и стереотипные МЦ для определенных типов опухолей. c-Met, c-еrbB2, c-kit являются трансмембранными рецепторами к факторам роста (тирозинкиназами), которые активируют цитоплазматические киназы, а те – ядерные транскриптазы, что в конечном итоге приводит к росту опухолевой ткани [Sobrinho-Simoes M. et al., 2005]. Сaveolin – 1 также участвует в нескольких МЦ: ингибирует передачу сигналов от EGFR и ERK-2 к ядру и регулирует межклеточное взаимодействие посредством даун-регуляции Е-кадгерина [Cohen A.W. et al., 2004].

В литературе имеются единичные исследования по корреляции мутаций RAS и BRAFV599E с клинико-патоморфологическими параметрами и прогнозом послеоперационного течения папилярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ) [Garcia-Rostan G. et al., 2003; Trovisco V. et al., 2004; Xing M. et al., 2005].

Таким образом, в проблеме ПРЩЖ остаются нерешенными вопросы:

·  о роли маркеров пролиферации (Ki-67, c-kit, c-Еrb B2, c-Met, caveolin-1, EGFR) и апоптоза (p53), дифференцировки (тиреоглобулин, RET-онкоген) и степени злокачественности (CD10, HBME–1) в ПРЩЖ;

·  о частоте мутаций RAS при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами;

·  о частоте мутаций BRAF при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами;

·  о прогнозировании послеоперационной выживаемости больных c разными гистологическими вариантами и стадиями заболевания ПРЩЖ.

Целью настоящей работы явилось изучение маркеров пролиферации и апоптоза, дифференцировки и степени злокачественности, а также мутаций в генах RAS и BRAF в папиллярном, фолликулярном и оксифильном вариантах папиллярного рака щитовидной железы, позволяющих определить злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивов опухоли.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1.  охарактеризовать морфологические и иммуногистохимические особенности папиллярного варианта (ПВ), фолликулярного варианта (ФВ) и оксифильного варианта (ОКФВ) ПРЩЖ в зависимости от стадии заболевания;

2.  определить экспрессию опухолевых маркеров (р53, EGFR, RET-онкоген, тиреоглобулин, виментин, HBME-1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit, Ki-67/MIB-1) (первых четырех посредством иммунногистохимии, остальных методом предварительной tissue microarray) в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

3.  выявить мутации гена NRAS, HRAS экзоны 1 и 2 (посредством проведения ПЦР, SSCP, секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

4.  изучить мутации гена BRAF (посредством проведения ПЦР, SSCP, секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

5.  провести анкетирование пациентов, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы для анализа выживаемости и рецидивирования;

6.  оценить возможности прогнозирования выживаемости и рецидивирования у больных, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы, в зависимости от уровня экспрессии опухолевых маркеров (р53, EGFR, RET-онкоген, тиреоглобулин, виментин, HBME-1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit, Ki-67/MIB-1) и мутациий в генах (BRAF, NRAS, HRAS экзоны 1 и 2) в ПРЩЖ.

Научная новизна.

С помощью комплекса морфологических и иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов была получена характеристика ПРЩЖ в зависимости от гистологического типа, стадии заболевания и наличия рецидивов опухоли. Установлено, что пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типов ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли. В пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb B2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb B2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb B2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности. В ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как c-kit, c-еrb B2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами. Показано, что количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором.

Найдены молекулярные прогностические критерии. Так, CD10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован как прогностический маркер. Риск рецидива ПРЩЖ возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb B2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR. RAS и BRAF мутации являются маркерами агрессивного поведения рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза. Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с МБЗ. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

Практическая значимость работы.

Разработаны иммуногистохимические и молекулярно-биологические критерии, позволяющие охарактеризовать злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивирования ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ. Полученные результаты по участию разных МЦ в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ показывают необходимость разработки индивидуальных методов прогнозирования и дальнейшей таргетной терапии при лечении этих опухолей. При ПРЩЖ р53 не всегда является прогностическим фактором за счет перекрестного реагирования антител. В практической работе врачей-патологоанатомов и онкологов нами рекомендуется использование иммуногистохимического исследования ключевых факторов основных МЦ в ПРЩЖ (c-kit, c-еrb B2, c-Met, caveolin-1), маркеров пролиферации (Ki-67), инвазивного роста (CD10) и злокачественности (HBME–1); а также определение RAS и BRAF мутаций с целью прогнозирования течения заболевания, выживаемости и эффективности таргетной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.  Папиллярный, фолликулярный и оксифильный варианты папиллярного рака щитовидной железы отличаются молекулярно-биологическими особенностями и по-разному экспрессируют маркеры пролиферации, дифференцировки и степени злокачественности.

2.  Полиморфизм HRAS экзона 1 и NRAS мутации являются маркерами агрессивного поведения папиллярного рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза.

3.  Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный маркер плохого прогноза при папиллярном раке щитовидной железы. Обнаружена новая мутация в гене BRAF (кодон S604I) в опухолевой ткани папиллярного рака щитовидной железы.

4.  Прогноз у больных папиллярным раком щитовидной железы определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с морфологическим баллом злокачественности и экспрессией онкомаркеров таких, как тиреоглобулин, c-erb B2, c-Met, c-kit, EGFR и р53. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

Апробация работы.

Апробация диссертации проведена 21 марта 2007 года на заседании кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО ММА им. Росздрава. Материалы работы представлены на научных конференциях кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО ММА им. Росздрава (апрель, декабрь 2006 г.), на заседании общества тиреоидологов Института Патологии и Иммунологии города Порто (Португалия, апрель 2005 г.), на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, январь 2004 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, из них 2 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В приложении приводятся протоколы проведенных исследований. Диссертация содержит 131 страницу машинописного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 19 рисунками (из них 27 микрофотографий, 23 гистограммы). Проанализировано 172 источника литературы, из них 11 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материал и методы исследования.

Исследование выполнено на операционном материале полностью удаленных щитовидных желез (ЩЖ) или их фрагментов от 59 больных, оперированных в ФХК ММА им. (34 случая за период г. г.) и ГКБ №случаев за период г. г.) по поводу узловых образований ЩЖ. Было изучено 3 основных гистологических варианта ПРЩЖ по максимально преобладающему характеру опухолевых структур: ПВ, объединивший в себе классическую и инкапсулированную папиллярную карциному – 29 случаев; ФВ, объединивший в себе неинкапсулированный и инкапсулированный папиллярный рак с фолликулярным строением – 22 случаев, ОКФВ (рак из клеток Гюртля) – 8 случаев. Кроме того, исследована окружающая ткань ПРЩЖ, где был диагностирован тиреоидит Хашимото (12 случаев), а также сохранная ткань щитовидной железы (8 случаев). В представленном материале женщины (52 случая) преобладали над мужчинами (7 случаев) в соотношении 7.4:1. Средний возраст больных ПРЩЖ составил 48.7 лет, возраст больных женщин был несколько выше по сравнению с мужчинами.

В работе использовались гистологический и гистохимический методы.

Технология множественно-тканных парафиновых блоков (ТМА)1. Tissue microarray - множественно-тканный парафиновый блок, в который из донорных блоков перемещают столбики ткани в организованном порядке. В данном случае было 24 столбика разных тканей на одном стекле – 22 образца ткани ЩЖ и 2 образца-контроля (аппендикс и селезенка\молочная железа). Готовые серийные гистологические срезы, сделанные по методике ТМА1, окрашивались гематоксилином и эозином по общепринятым методикам.

Иммуногистохимический метод. Иммуногистохимические реакции проводились на серийных парафиновых срезах (тиреоглобулин, р53, RET – онкоген и EGFR) и на срезах, сделанных по методике ТМА (HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki67). Демаскировка антигена осуществлялась путем инкубации срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 мМ цитратного буфера с рН 6.0 (тиреоглобулин, р53, RET – онкоген, EGFR, HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki-67). Эндогенная пероксидаза блокировалась при обработке срезов в течение 10 мин в 3 % перекиси водорода. В качестве первичных антител использовались моноклональные антитела к тиреоглобулину (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:100), продукту экспрессии онкогенов RET (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:40), р53 (DAKO, Германия, в концентрации 1:50) и EGFR (DAKO, Германия, в концентрации 1:100), HBME–1(DAKO, Германия, в концентрации 1:50), c-Met (Zymed, США, в концентрации 1:100), c-erb B2 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:60), caveolin-1 (BD Transduction Laboratories, США, в концентрации 1:400), CD10 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:150), c-kit (DAKO, Германия, в концентрации 1:500), Ki-67 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:50). В качестве вторичных антител использовались биотинилированные иммуноглобулины мыши и кролика (DAKO, Германия, в концентрации 1:200). В качестве фонового окрашивания применялся гематоксилин. Позитивным контролем в реакциях с тиреоглобулином, р53 и EGFR являлись фолликулы окружающей ткани ЩЖ; в

1Выражаю искреннюю благодарность профессорам М. Собрино-Симоэшу и П. Соареш, а также молекулярным биологам ИПАТИМУП (Института Патологии и Иммунологии Университета г. Порто), Португалия за помощь в проведении исследовательской работы.

реакциях с RET – онкогеном использовалась в качестве контроля ткань медуллярного рака ЩЖ. Позитивным контролем в реакциях с HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki67 являлась ткань аппендикса. Негативный контроль проводился без первичных антител. Результаты иммуногистохимических реакций в случае цитоплазматической локализации продукта реакции (тиреоглобулин, RET, EGFR, HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit) оценивались в баллах (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (n): n менее 20 % - 1-2 балла; n от 20 до 50 % - 3-4 балла; n более 50 % - 5-6 баллов. В случае ядерной локализации продукта реакции (р53, Ki-67) подсчитывался процент окрашенных ядер на 300 опухолевых клеток из разных участков препарата.

ПЦР, изучение конформационного одноцепочечного полиморфизма и секвенирование. ДНК опухоли была оценена на предмет точечных мутаций в кодонах 12 и 61 H и NRAS, а также на наличие мутаций в гене BRAF экзон 15 путем ПЦР или последовательных реакций - ПЦР-SSCP. При SSCP образцы были проанализированы гелевыми матрицами, повышающими обнаружение мутации (MDE; FMC BioProducts, США) при 180V и 8◦C в течение 15 часов. Продукты ПЦР-SSCP визуализировались стандартным серебрением ДНК. Повторно амплифицированные участки ДНК были выделены, подвергнуты очистке посредством экзонуклеазы I («New England Biolabs», Великобритания) и щелочной фосфатазы («Amersham Bio­sciences», США) с последующим автоматическим секвенированием. Секвенирование было выполнено на приборе ABI prism 3100 Genetic Analyser («Perkin-Elmer», США). Определялась частота мутаций BRAFV599E, H и NRAS в процентах.

Изучение прогноза по данным клинического обследования и разработок архивных материалов. Было обследовано 25 пациентов, прооперированных за период г. г. в московской городской клинической больнице № 61 по поводу узловых образований щитовидной железы, до операции и велось наблюдение за данными пациентами с момента операции и по сегодняшний день. Были проведены разработка архивных материалов и анкетирование данных пациентов для проведения сравнительного анализа между уровнем экспрессии опухолевых маркеров (р53, EGFR, ret-онкоген, тиреоглобулин, HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit, Ki67, BRAF, H и NRAS) в ПРЩЖ и выживаемостью, метастазированием. Для распределения больных по группам риска использован прогностический индекс, составленный ar и соавторами в 1979 году. Суть индекса заключается в суммации баллов, определяющих по коэффициентам регрессии удельный вес ряда факторов в прогнозе, что служит основой построения групп риска.

Статистический анализ. Проводился корреляционный анализ по методу Спирмена во всей группе ПРЩЖ, а также – в ПВ и ФВ как наиболее многочисленных гистологических вариантах, определялся коэффициент отклонения средней с использованием программы Statistica for Microsoft Windows, version 5.0, StatSoft Inc., США. Построение гистограмм и графиков осуществлялось с помощью компьютерной программы Microsoft Excel, 2002.

Результаты исследования и их обсуждение.

1. Морфологическая характеристика, оценка злокачественного потенциала, прогноз с учетом гистологического варианта ПРЩЖ и стадии заболевания.

Были выделены основные гистологические варианты ПРЩЖ, имевшие разное гистоархитектурное и цитологическое строение: ПВ (29 случаев), ФВ (22 случая) и ОКФВ (8 случаев). Данные гистологические варианты имели общий критерий диагностики – наличие в опухолевых клетках патогномоничных ядер: крупных, овальной или овально-округлой формы, оптически прозрачных, накладывающихся друг на друга, с бороздками и эозинофильными внутриядерными включениями, с неровными зазубренными контурами и редко встречающимися мелкими ядрышками. Исключение в диагностике составил ОКФВ, для которого были характерны полиморфные, гиперхромные ядра с неровными контурами и хорошо выраженным ядрышком. Однако, этот вариант характеризовался исключительно сосочковым типом роста. Средний возраст больных – 54,2 года.

У всех больных с опухолью рТ3 и рТ4 были обнаружены рецидивы. Летальность больных с опухолью рТ4 в 1,5 раза выше, чем при остальных. Влияние гистологического строения ПРЩЖ проявляеся при длительном сроке наблюдения за больными, более 5 лет. В сроки от 6 до 8 лет после операции рецидивы чаще развивались у больных ПВ ПРЩЖ по сравнению с больными ФВ ПРЩЖ, также выживаемость больных в эти сроки была ниже при папиллярных формах опухолей. В случаях при незначительном сроке наблюдения за больными (до 5 лет) незаменимыми оказываются такие вспомогательные методы, как иммуногистохимические и молекулярно-биологические.

2. Иммуногистохимическая характеристика разных гистологических вариантов ПРЩЖ с учетом стадии опухолевой прогрессии.

Маркеры пролиферации и апоптоза в ПРЩЖ.

Экспрессия Ki-67/MIB-1 в ПРЩЖ. Ki-67 экспрессировался во всех вариантах ПРЩЖ, кроме нормальной тиреоидной ткани, очагов тиреоидизации и метастазов. Экспрессия Ki-67 во всех наблюдениях ПРЩЖ была достаточно низкой, что совпадает с данными других авторов. Наибольший уровень экспрессии был выявлен в ФВ и составил 3,7 %, наименьший – в ПВ – 3 % (рис.1а). Ki-67 – маркер пролиферации и активируется только в опухолевых клетках; отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ. Достоверных различий в уровне экспрессии Ki-67 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ не было найдено (3,1 и 3,3 % соответственно; р=0,98).

Экспрессия с-kit в ПРЩЖ. Самый высокий уровень с-kit был обнаружен в ПВ и составил 4,9 (рис.1б). Примерно одинаковый уровень экспрессии с-kit обнаружен в остальных вариантах и нормальной тиреоидной ткани, а также очагах тиреоидизации. Найдено, что у пациентов ФВ с

1г

1в

1а

1д

1е

1б

1з

1ж

1и

Рисунок 1. Гистограммы. Экспрессия онкомаркеров в разных гистологических вариантах ПРЩЖ. 1а – Ki-67; 1б – c-kit; 1в – с-еrb B2; 1г – c-Met; 1д – caveolin-1; 1е – СD10; 1ж – HBME-1; 1з – EGFR; 1и – р53.

отдаленными метастазами уровень экспрессии c-kit ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (0 и 4,3 балла соответственно; р=<0,01). Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии с-kit в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ. Полученное нами резкое снижение содержания с-kit в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, с-kit индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток. Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в ПРЩЖ. Следовательно, можно высказать предположение, что c-kit рецептор вовлечен в контроль роста эпителия ЩЖ только на ранних стадиях опухолевой прогрессии. На более поздних стадиях роста ПРЩЖ главенствующее значение имеют другие МЦ. В то же время, вероятно и низкий уровень пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ в целом также обусловлен потерей экспрессии с-kit.

Экспрессия c-еrb B2 в ПРЩЖ. Самый высокий уровень экспрессии c-еrb B2 в ПВ и составил 7,2, самый низкий – в ФВ (5 баллов; рис.1в). Следует отметить, что уровень экспрессии c-еrb B2 в нормальной окружающей ткани ЩЖ достаточно высок (4,8 баллов). Полученные результаты показывают, что МЦ с c-еrb B2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ. При этом наибольшая активность МЦ с c-еrb B2 наблюдается в ПВ и в ОКФВ, также принимает участие в ФВ, но на более низком уровне активности. Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии c-еrb B2 ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (2 и 6,2 балла соответственно; р<0,01). Полученные данные показывают, что c-еrb B2 не имеет решающего значения на поздних стадиях роста ПРЩЖ.

Экспрессия с-Met в ПРЩЖ. Самый высокий уровень экспрессии c-Met был в ОКФВ и составил 6,3; самый низкий - в ФВ (5,2 балла; рис.1г). Была также выявлена экспрессия с-Met в нормальной тиреоидной ткани и тиреоидите, но намного ниже, чем в ПРЩЖ (4,2 балла). Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии c-Met достоверно ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (4 и 5,1 балла соответственно; р=0,049). Это объясняется ролью, которую играет Met/HGF-R в патогенезе этой формы рака, поскольку он способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности. Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии с-Мet в ФВ является плохим прогностическим признаком.

Экспрессия сaveolin-1 в ПРЩЖ. Сaveolin-1, выявленный в нашем исследовании, является туморогенным и отличается от нормально функционирующего тем, что активирует множество различных МЦ. Самый высокий уровень экспрессии сaveolin-1 зарегистрирован в ОКФВ (7,3 балла), самый низкий - в ФВ (5,9 баллов; рис.1д). Уровень экспрессии caveolin-1 в ПВ занимает промежуточное значение (6,8 балла). Уровень экспрессии в метастазах значительно ниже (5 баллов) по сравнению с первичной опухолью (8 баллов). Самое низкое содержание caveolin-1 выявлено в нормальной окружающей ткани ЩЖ (3,8 балла). Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии caveolin-1 выше по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (8 и 6,7 балла соответственно; р=0,037). Прогностическое значение сaveolin-1 объясняется его биологическими функциями в клетках. Через сaveolin-1 передаются митогенетические сигналы многих цепочек (EGFR, Raf, MEK-1 и ERK), на которые он оказывает ингибирующее действие в норме. Широко распространенная ассоциация caveolin-1 с кавеолами с многочисленными путями трансдукции сигнала предполагает, что преобразование нормально функционирующего caveolin-1 в туморогенный служит общей точкой, которая функционально регулирует множество сигнальных путей. Кроме того, показано, что эндотелиальные клетки сосудов с избытком caveolin-1 принимают участие в усилении ангиогенеза в опухолях, что стимулирует рост опухоли.

Экспрессия EGFR в ПРЩЖ. Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 36 % и 30 % EGFR-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 50 % в ОКФВ, что говорит о более злокачественном потенциале ОКФВ ПРЩЖ, более неблагоприятном прогностическом значении и о более высоком риске рецидива (рис.1з).

Экспрессия р53 в ПРЩЖ. Мутантный р53 экспрессируется в ПРЩЖ. Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 27,1 % и 34,8 % р53-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 37 % в ОКФВ (рис.1и). Более высокий уровень экспрессии р53 в инкапсулированных формах ПРЩЖ по сравнению с неинкапсулированными можно интерпретировать тем, что в инкапсулированных формах за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже в неинкапсулированных – мутантный р53. Но более высокая экспрессия р53 при ФВ ПРЩЖ 34,8 %, чем при ПВ ПРЩЖ 27,1 % противоречит данным других авторов и может быть интерпретирована неоднозначно. Один из вариантов: при ФВ ПРЩЖ нормальный р53 еще функционирует, при ПВ ПРЩЖ мы опеределили мутантный р53. Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором.

Маркеры степени злокачественности ПРЩЖ.

Экспрессия CD10 в ПРЩЖ. Изменение экспрессии CD10 в зависимости от гистологического строения ПРЩЖ: самый высокий уровень экспрессии в ПВ (2,4 балла), и одинаково низкие уровни в ФВ и ОКФВ (2 балла; рис.1е). В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия CD10 не обнаружена. Достоверных различий в уровне экспрессии CD10 с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ (2,1 и 2,3 балла соответственно) не выявлено (р=0,98). CD10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован как прогностический маркер (1,2 и 0,5 балла соответственно; р=0,032). Не следует забывать о том, что экспрессия CD10 коррелирует с гистопатологическими критериями плохого прогноза, учитывая его роль в туморогенезе и прогностическом анализе.

Экспрессия HBME-1 в ПРЩЖ. Изменение экспрессии HBME-1 в зависимости от гистологического строения: самый высокий уровень экспрессии в ПВ и в ОКФВ, самый низкий – в ФВ (рис.1ж). Достоверных различий в уровне экспрессии HBME-1 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ (2,9 и 3,2 балла соответственно; р=0,96) не выявлено. Полученные данные говорят о диагностической ценности HBME-1 как положительного маркера злокачественности для дифференцированных карцином щитовидной железы, таких как папиллярный РЩЖ. В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия HBME-1 не обнаружена.

Резюмируя полученные данные, следует отметить, что в пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-еrb B2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb B2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-еrb B2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности. CD10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован как прогностический маркер (р=0,032). Определение уровня экспрессии HBME–1, c-Met, c-еrb B2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki-67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования.

3. RAS мутации при ПРЩЖ.

Проведенное исследование показывает, что полиморфизм и мутации RAS были идентифицированы в 4 из 59 опухолей (6,8 %). HRAS полиморфизм был обнаружен в 3 из 59 опухолей (5,1 %). За 8 лет послеоперационного наблюдения умер от заболевания только один пациент с мутацией NRAS (1,7 %), в то время как не было обнаружено ни одной мутации HRAS. Одиночные формирующие RAS мутации были маркером плохой выживаемости в нашей группе, тогда как наличие полиморфизма не влияло на выживаемость. Результаты нашего исследования демонстрируют явную связь между NRAS мутациями, а также HRAS полиморфизмом и неблагоприятным прогнозом. Хотя необходимы дополнительные и особенно проспективные исследования, чтобы объяснить далее отношения между активацией RAS онкогена и неоплазией ЩЖ, наши результаты указывают, что генотипирование RAS может иметь существенную ценность как прогностический индикатор и может обеспечить обоснование новым методам лечения.

4. BRAF мутации при ПРЩЖ.

Обнаружена мутация BRAFV599E в 37,9 % ПВ ПРЩЖ. Этот процент лежит в нижнем участке диапазона предыдущих сообщений о ПРЩЖ (36-69 %), но по существу имеет ограниченную ценность, так как мы демонстрировали также, что распространенность мутации существенно изменяется от одного гистологического типа до другого. Мутация BRAFV599E присутствовала в 36,4 % случаев ФВ ПРЩЖ (8/22), что не совпадает с данными литературы. Мутация BRAFV599E присутствовала в 50 % случаев ОКФВ ПРЩЖ (4/8), что говорит о более плохом прогнозе данного варианта ПРЩЖ среди изученных нами. В полученных нами результатах наличие мутаций BRAF не коррелирует с клинической стадией развития онкопатологии (р = 0,3), что противоречит данным литературы. Найденная нами в одном из 22 случаев ФВ ПРЩЖ (4,5 %) необычная мутация в гене BRAF (кодон S604I), не описанная ранее в литературе, требует дальнейшего изучения. Функциональное значение мутаций BRAFV599E и BRAFS604I в канцерогенезе ПРЩЖ все еще остается неизвестным, хотя обычно им приписывают роль активации пути MAPK. Низкая пролиферация и низкая апоптотическая активность ПРЩЖ, а так же антиапоптотическая роль BRAF, говорят в пользу более благоприятного прогноза течения заболевания, по сравнению с опухолями, несущими мутированный ген BRAF. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при ПРЩЖ.

5. Прогноз послеоперационной выживаемости при разных гистологических вариантах ПРЩЖ с учетом пола, возраста и молекулярно-биологических особенностей опухолей.

Прогностический индекс (ПИ). Был изучен также ПИ, в который заложен многофакторный анализ, отражающий разные аспекты проявления ПРЩЖ, что позволяет более четко прогнозировать исход заболевания. Из 25 больных с известными отдаленными результатами лечения, которые наблюдались от 6 до 8 лет после первичной операции, заболевание рецидивировало у 9 пациентов (36 %). Рецидив явился причиной смерти 1 больной, которая погибла от местного распространения и генерализации опухолевого процесса. Всего выжило в сроки от 6 до 8 лет 23 больных (92 %) (1 больная умерла от инфаркта миокарда через 4 года после перенесенной операции без признаков рецидива и метастазов в течение всего периода наблюдения). Суммарная летальность составила 8 %. Группа риска значительно влияла на возникновение рецидивов и выживаемость больных в сроки от 6 до 8 лет после операции: с возрастанием группы риска увеличивался процент рецидивов, снижалась выживаемость больных.

Факторы, влияющие на послеоперационное течение болезни.

Пол больного. В сроки от 1 года до 8 лет после первичной операции под наблюдением находились 2 мужчин и 23 женщины. В процентном отношении рецидив у женщин развивался в несколько раз чаще, чем у мужчин, также и летальность среди женщин значительно превышала таковую среди мужчин. Однако после статистической обработки этих данных можно заключить, что в настоящих исследованиях пол больных не влиял на частоту развития рецидивов (р = 0,226) и 8-летнюю выживаемость (c2 = 0,91).

Возраст больных. Для исследования влияния возраста на прогноз все 25 находившихся под наблюдением больных в сроки от 6 до 8 лет после первичной операции были разделены на две возрастные группы. Первую группу, к которой принадлежали больные моложе 45 лет, составили 10 человек, и вторую группу, к которой принавдлежали больные в возрасте 45 лет и старше, составили 15 человек. В сроки от 6 до 8 лет после операции выживаемость больных, чей возраст был менее 45 лет, составила 100 %, в то же время выживаемость больных из группы 45 лет и старше в эти же сроки наблюдения равнялась 86,7 %. Процент рецидивов в группе больных 45 лет и старше в 9 раз превышал таковой из группы больных моложе 45 лет. После статистической обработки данных можно сказать, что выживаемость больных моложе 45 лет в сроки от 6 до 8 лет после операции превышала выживаемость больных, возраст которых равнялся 45 годам или превышал эту границу (c2 = 4,23, уровень значимости a = 5 %).

Особенности экспрессии онкомаркеров у 9 больных с рецидивом ПРЩЖ. Достоверных различий в уровне экспрессии Ki-67 у пациентов с и без рецидива не выявлено (3,3 и 3,4 % соответственно; р=1,0).

Средний уровень экспрессии c-kit составил 4,3 в группе больных без рецидива и 1,6 у больных с рецидивом (р=0,026). Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии с-kit в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, которую наблюдали многие авторы. Полученное нами резкое снижение содержания с-kit в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, с-kit индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток. Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в карциномах ЩЖ. Следовательно, можно высказать предположение, что c-kit рецептор вовлечен в контроль роста эпителия щитовидной железы только на ранних стадиях опухолевой прогрессии.

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии c-еrb B2 в первичной опухоли значительно ниже, чем без рецидива (1,25 и 6,3 балла соответственно; р<0,01). Полученные результаты показывают, что МЦ с c-еrb B2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ.

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии c-Met был ниже, чем без рецидива (4,7 и 5,9 балла соответственно; р=0,048). Это объясняется ролью, которую играет Met/HGF-R в патогенезе этой формы рака, поскольку Met/HGF-R способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности. Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии с-Мet в ФВ является плохим прогностическим признаком.

Достоверных различий в уровне экспрессии caveolin-1 у пациентов с и без рецидива ПРЩЖ не выявлено (5,9 и 6,8 балла соответственно; р=0,67).

Средний уровень экспрессии EGFR составил 2,78 в группе больных без рецидива и 3,3 у больных с рецидивом, что позволяет утверждать, что высокий уровень экспрессии EGFR имеет неблагоприятное прогностическое значение и ассоциирован с высоким риском рецидива.

Средний уровень экспрессии р53 составил 3,56 в группе больных без рецидива и 2,66 у больных с рецидивом. Более высокий уровень экспрессии р53 в первой группе больных по сранению со второй можно интерпретировать тем, что в группе больных без рецидива за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже у больных с рецидивом – мутантный р53. Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором.

Средний уровень экспрессии тиреоглобулина составил 4,24 в группе больных без рецидива и 3,4 у больных с рецидивом. Полученные данные позволяют утверждать, что чем меньше уровень экспрессии тиреоглобулина (тем менее дифференцирован ПРЩЖ), тем больше вероятность развития рецидивов.

RET-онкоген экспрессировался только в одном случае (больной с ОКФВ ПРЩЖ) и уровень экспрессии составил 2,0, а частота экспрессии –

20 %. В группе больных без рецидива RET-онкоген был обнаружен в 4 случаях, а частота его экспрессии была равна 8,2 %, средний уровень экспрессии составил 1,13. При увеличении частоты экспрессии RET-онкогена имеется тенденция к увеличению риска рецидивирования ПРЩЖ.

Достоверных различий в уровне экспрессии CD10 и HBME-1 у пациентов с и без рецидива не выявлено (2,0 и 2,1 балла; р=0,99; 3,0 и 3,3 балла; р=0,96 соответственно).

После статистической обработки можно сказать, что уровень экспрессии тиреоглобулина, EGFR, c-erb B2, c-Met и c-kit значительно влиял на возникновение рецидивов после операции (c2 = 5,11 и c2 = 12,11 соответственно). Однако малое число случаев не позволяет рассчитывать на достоверность полученных результатов в подгруппах, соответствующих гистологическим вариантам.

Пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типах ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли. В ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли общий уровень пролиферации раковых клеток не меняется, при этом вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как c-kit, c-Erb B2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами.

В заключение следует сказать, что ПИ, как и любая другая схема, в том числе и построенная на основе многофакторного анализа, не лишен некоторых условностей. Тем не менее он может использоваться для изучения результатов хирургического лечения больных ПРЩЖ, что и было сделано в настоящей работе.

Выводы:

1.  В пролиферации опухолевых клеток папиллярного рака щитовидной железы активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb B2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb B2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb B2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности.

2.  Наивысшим злокачественным потенциалом, судя по выраженности морфологических проявлений и экспрессии биомолекулярных маркеров, обладает оксифильный вариант ПРЩЖ, наименьшим – фолликулярный вариант ПРЩЖ, папиллярный вариант занимает промежуточное место. Факторами повышенного риска у больных папиллярным раком щитовидной железы являются возраст старше 45 лет и прорастание опухолью капсулы щитовидной железы.

3.  Риск рецидива папиллярного рака щитовидной железы возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb B2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR.

4.  Количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором, поскольку в ходе опухолевой прогрессии возможны потеря обеих аллелей гена или развитие глубоких мутаций, приводящих к отсутствию синтеза данного белка, что в свою очередь может потенциировать опухолевый рост.

5.  Определение уровня экспрессии HBME–1, c-Met, c-erb B2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki-67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования.

6.  RAS мутации являются маркером агрессивного поведения папиллярного рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза.

7.  Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при папиллярном раке щитовидной железы.

8.  Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с морфологическим баллом злокачественности. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.  «Экспрессия p53 и EGFR в папиллярном раке щитовидной железы». Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, III Конференция молодых ученых России с международным участием. с. 232-233, Москва, 2004 г.

2.  «Рак щитовидной железы: прогнозирование выживаемости и рецидивирования с помощью определения онкомаркеров и прогностического индекса». Тезисы работ участников открытого российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2004 года по разделу «медицинские науки», с. 8-9, Москва, 2005 г.

3.  , , Sobrinho-Simoes M., Soares P., Пальцев в дифференциальной диагностике и прогнозе при папиллярном раке щитовидной железы. II Всероссийский Съезд Патологоанатомов– т. II - с. 355-357.

4.  , , Пальцев значение экспрессии тиреоглобулина и онкомаркеров (р53, EGFR, ret-онкогена) в различных вариантах папиллярного рака щитовидной железы. Клинико-морфологическое и иммуногистохимическое исследование.// Арх. пат– т. 68, вып. 4 - с. 8-11.

5.  , , Пальцев гена RAS в папиллярном раке щитовидной железы. // Молекулярная медицина. – 2007 - № 1 – с. 37-41.