Система SPP: Уникальная система продукции одного белка

Система SPP: Уникальная система продукции одного белка

Введение

Takara Bio, совместно с доктором Masayori Inouye из Университета Медицины и Стоматологии Нью-Джерси разработала новую систему для наработки больших количеств высокоочищенных растворимых белков. В системе SPP (продукции одного белка) для достижения высокой степени чистоты (до 90% относительно вновь синтезированного белка) и стабильной изотопной метки нужных белков используется модифицированная версия существующих векторов экспрессии холодового шока Takara вместе с экспрессией эндорибонуклеазы MazF.

Принцип действия системы SPP

Белок MazF – эндорибонуклеаза со специфической последовательностью, которая специфично разрезает однонитевые РНК по последовательности ACA. Экспрессия mazF практически исключает экспрессию большинства клеточных мРНК, разрешая синтез белка-мишени до 72 часов после индукции.

Система SPP состоит из двух совместно экспрессируемых плазмид: вектора экспрессии pCold без ACA для экспрессии версии гена-мишени без ACA и вектора, несущего ген mazF для индуцируемой экспрессии MazF. Система подавляет экспрессию белков хозяина эффективнее, чем сама система pCold, и обеспечивает большую чистоту и эффективность метки для широкого спектра целевых белков. Это делает возможным структурный анализ белков с помощью ЯМР (ядерного магнитного резонанса) или других технологий.

Рисунок 1. Принцип действия системы SPP: Экспрессия белков хозяина подавляется в результате разрезания мРНК MazF по сайтам ACA.

				Отсутствие экспрессии белков хозяина
				Ç
Геном хозяина		РНК хозяина		MazF разрезает однонитевую РНК на 5’-конце последовательности ACA
	Æ	ACA (содержит последовательность ACA)		ACA #
Ген MazF	Æ	"	Ì Ê
вектор pMazF		MazF мРНК интерфераза		!
Ген-мишень		Ген-мишень мРНК
(версия без ACA)	Æ	(мРНК без ACA)		мРНК гена-мишени не разрезается, т. к. не содержит последовательности ACA
Вектор экспрессии для системы SPP				È
				Экспрессия гена-мишени

Материалы и методы

На правой панели векторной диаграммы проиллюстрирован протокол SPP (диаграмма 2). Вкратце, для каждого эксперимента экспрессировался вектор pCold (SP-4), содержащий ген-мишень, с плазмидой экспрессии mazF или без неё. Культивацию, индукцию экспрессии и импульсную метку проводили в среде M9 с глюкозой с помощью штамма хозяина E.coli BL21, как описано. Образец культурального супернатанта анализировали с помощью SDS-ПААГ.

Диаграмма 2. Схема векторов, использованных в системе SPP, и протокол метода.

cspA 3’ UTR множественный сайт клонирования сайт фактор Xa His-Tag TEE cspA 5’ UTR lac-оператор cspA промотор	cspA 3’ UTR множественный сайт клонирования His-Tag TEE cspA 5’ UTR lac-оператор cspA промотор	+
cspA 3’ UTR множественный сайт клонирования TEE cspA 5’ UTR lac-оператор cspA промотор	cspA 3’ UTR множественный сайт клонирования cspA 5’ UTR lac-оператор cspA промотор	Протокол метода для системы SPP Нужный ген без ACA вставляют в вектор экспрессии холодового шока системы SPP ¯ Клетку хозяина E.coli (например, BL21) трансформируют плазмидой экспрессии без ACA и плазмидой экспрессии mazF (выделенной ампициллином и хлорамфениколом) ¯ Трансформированную клетку помещают в среду, содержащую ампициллин и хлорамфеникол (для импульсной метки используйте среду M9 с глюкозой) и встряхивают культуру при 37°C ¯ При ОП600 = » 0,5 охлаждают культуральный раствор, понижая температуру до 15°C, и оставляют на 45 минут ¯ В культуральный раствор добавляют изопропилтиогалактозид, инкубируют и встряхивают 24 часа при 15°C (для импульсной метки при отборе добавляют аминокислоту с радиоизотопной меткой и оставляют на 15 минут при 15°C) ¯ Отбирают и гомогенизируют ¯ Анализируют нужный белок с помощью SDS-ПААГ или другой технологии

Результаты и обсуждение

Рисунок 1. Экспрессия белка envZB (окрашивание CBB и импульсная метка растворимой бактериальной фракции).

Рисунок 2. Экспрессия тиоредоксина (стрелки – экспрессируемый тиоредоксин).

окрашивание CCB импульсная метка

кДа

Рисунок 3. Экспрессия эотаксина (импульсная метка).

окрашивание CCB импульсная метка

кДа

На рисунке 1 показаны результаты эксперимента, в котором вектор pCold (SP-4), содержащий ДНК envZB, индуцировали совместно с плазмидой экспрессии mazF или без неё.

Были показаны одинаковые уровни экспрессии envZB и в тех, и в других условиях как с помощью окрашивания Кумасси ярко-голубым (CBB), так и с помощью импульсной метки. Тем не менее, уровень экспрессии меченых белков, отличных от envZB, значительно снижался в присутствии MazF (см. особо результаты импульсной метки), показывая, что новая экспрессия белков хозяина подавляется экспрессией MazF.

На рисунке 2 показаны результаты эксперимента, в котором ген тиоредоксина, вставленный в SPP векторы от pCold I (SP-4) до pCold IV (SP-4), индуцировали в присутствии и в отсутствие экспрессии mazF. Уровень экспрессии тиоредоксина с mazF или без него был одинаковым для четырёх SPP векторов pCold.

Тем не менее, уровень экспрессии других клеточных белков значительно снижался в присутствии mazF (см. особо данные импульсной метки).

На рисунке 3 отслеживаются изменения уровня индуцируемой экспрессии эотаксина, клонированного в ДНК pCold I (SP-4) по прошествии различных периодов инкубации путём импульсной метки. В присутствии mazF понижение экспрессии отличных от эотаксина белков явно наблюдалось в пределах 3 часов. После длительной инкубации (до 72 часов после индукции) сохранялся высокий уровень экспрессии эотаксина, в то время как уровень других клеточных белков существенно понижался.

Выводы

Эти эксперименты показывают, что система SPP обеспечивает надёжную белковую экспрессию с исключительной чистотой для различных белков-мишеней. Вкратце, система продукции одного белка обладает следующими свойствами:

■  Превосходное отношение сигнал/шум: разрушение клеточной мРНК ведёт к практически полному отсутствию фонового синтеза белка.

■  Экспрессия сложных белков: можно успешно экспрессировать легко слипающиеся белки.

■  Повышенная стабильность и растворимость белка: экспрессия при низкой температуре подавляет активность протеаз и повышает растворимость белка.

■  Отлично подходит для методов мечения (например, ЯМР): высокий (до 90%) уровень экспрессии гена-мишени упрощает структурный анализ белка.

Услуги по созданию векторов для системы SPP

Применение системы SPP требует удаления (замены) последовательностей ACA в экспрессируемом гене. Takara Bio предлагает услуги по приготовлению необходимых генов без ACA и клонированию их в вектор pCold (SP-4), для этого требуется только информация о последовательности гена.

Информация для заказчиков
3367	Система SPP I	1 набор
3368	Система SPP II	1 набор
3369	Система SPP III	1 набор
3370	Система SPP IV	1 набор
3366	Система SPP I-IV	1 набор

SpeedSTAR Takara: ПЦР со скоростью света!

Новая высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR Takara – это удобная и эффективная ферментативная и буферная система, приспособленная к высокой скорости ПЦР. Эта система позволяет сократить время инкубации на каждой стадии ПЦР-реакции. Протокол SpeedSTAR уменьшает время денатурации до 5 сек., а время отжига до 10-15 сек. Возможна достройка всего за 10 сек./кб. (сравните с 60 сек./кб. для обычной Taq-полимеразы). Эти изменения приводят к сокращению общей длительности реакции на две трети. Этот фермент удобен для оптимизации благодаря высокой чувствительности, отличному выходу и надёжной системе из двух буферов, облегчающей эффективную амплификацию фрагментов различного размера (до 20 кб) с меньшими требованиями к оптимизации, чем у других полимераз. Кроме того, формула «горячего запуска» повышает специфичность и уменьшает фон, и такие результаты можно получить на стандартных термоциклерах – никакого специального оборудования не требуется.

Высокоэффективная система SpeedSTAR предлагает следующие преимущества:

■  Высокая скорость амплификации: амплифицируйте 2 кб. фрагмент всего за 30 минут.

■  Превосходная эффективность: надёжное качество, сравнимое с высокоэффективными полимеразами.

■  Длинные фрагменты: оптимизированная двухбуферная система позволяет амплифицировать фрагменты до 20 кб. с меньшими требованиями к оптимизации.

■  Превосходная специфичность: опосредованный антителами «горячий запуск» обеспечивает повышение специфичности и уменьшение фона.

Условия ПЦР для высокоэффективной ДНК-полимеразы SpeedSTAR

(A)  Для 2-стадийной ПЦР Реакции можно проводить более эффективно, устанавливая температуру для каждой стадии следующим образом, в зависимости от размера амплифицируемых фрагментов. ■  Длина амплифицируемой цепи до 4 или 6 кб. (быстрые буферы I и II соответственно) 95°C 5 секунд ■ 30 циклов 65°C 10 (до 20) секунд/кб. ■ ■  Длина амплифицируемой цепи 4 или 6 кб. или более (быстрые буферы I и II соответственно) 98°C 5 секунд ■ 30 циклов 68°C 10 (до 20) секунд/кб. ■ (B)  Для 3-стадийной ПЦР 98°C 5 секунд ■ 55°C от 10 до 15 секунд 30 циклов 72°C от 5 до 10 секунд/кб. ■

Пример амплификации I: Сравнение реакционной способности и времени реакции

Мишени различного размера амплифицировали с помощью ДНК генома E.coli в качестве матрицы в 2-стадийной ПЦР с помощью высокоэффективной ДНК-полимеразы SpeedSTAR и высокоэффективной полимеразы «горячего запуска». Условия ПЦР и длительность каждой реакции показаны на рисунке 1.

Рисунок 1. Дорожка M: λ-Hind III; дорожка 1: 1 кб; дорожка 2: 2 кб; дорожка 3: 4 кб; дорожка 4: 6 кб; дорожка 5: 8 кб; дорожка 6: 10 кб; дорожка 7: 18 кб; дорожка 8: 20 кб.

Высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR Высокоэффективная ДНК-полимераза

С обоими ферментами наблюдалась хорошая амплификация до 20 кб. Выход амплификации с высокоэффективной полимеразой «горячего запуска» был прекрасным, но высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR позволяет сократить время реакции до 1/4 – 1/3 по сравнению с другими полимеразами (таблица 1).

Таблица 1. Сравнение длительности реакции фрагментов различных размеров для SpeedSTAR и стандартного фермента ПЦР.

Рисунок	Размер фрагмента	Геном-мишень	Стандартная ПЦР	Высокоэффективная полимераза SpeedSTAR
Рис. 1 дорожки 1 и 2	1-2 кб	E.coli	96 мин (2 стадии)	33 мин
Рис. 1 дорожки 3 и 4	4-6 кб	E.coli	226 мин (2 стадии)	53 мин
Рис. 1 дорожки 5 и 6	8-10 кб	E.coli	346 мин (2 стадии)	83 мин
Рис. 1 дорожки 7 и 8	18-20 кб	E.coli	8 ч 16 мин (2 стадии)	3 ч 29 мин
Рисунок 3	геномный 8,5 кб	человек	4 ч 59 мин (2 стадии)	1 ч 40 мин
Рисунок 2	геномный 300 н. п.	человек	39 мин (3 стадии)	67 мин (3 стадии)

Пример амплификации 2: Сравнение пределов детекции.

Предел детекции высокоэффективной ДНК-полимеразы SpeedSTAR сравнивали с высокоэффективной полимеразой «горячего запуска» в оптимальных условиях для каждого из ферментов, используя ПЦР с ДНК человеческого генома в качестве матрицы.

Рисунок 2. Дорожка M: 100 н. п. ДНК-лэддер; дорожки 1 и 5: 100 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 2 и 6: 10 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 3 и 7: 1 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 4 и 8: 0,1 нг геномная ДНК – матрица.

Высокоэффективная ДНК-полимераза Высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR

Рисунок 3. Дорожка M: λ-Hind III; дорожки 1 и 5: 100 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 2 и 6: 10 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 3 и 7: 1 нг геномная ДНК – матрица; дорожки 4 и 8: 0,1 нг геномная ДНК – матрица

Высокоэффективная ДНК-полимераза Высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR

Рисунок 4.

Дорожка M: λ-Hind III;

Дорожка 1: 150 н. п.;

Дорожка 2: 472 н. п.;

Дорожка 3: 2484 н. п.;

Дорожка 4: 1019 н. п.;

Дорожка 5: 4337 н. п.;

Дорожка 6: 1458 н. п.;

Дорожка 7: 542 н. п.;

Дорожка 8: 2116 н. п.;

Дорожка 9: 249 н. п.;

Дорожка 10: 911 н. п.

быстрый буфер I быстрый буфер II

Пример применения 3: Подтверждение вставки

Мы подтверждали вставки различных размеров (до 4,4 кб) в плазмиды путём ПЦР с помощью высокоэффективной ДНК-полимеразы SpeedSTAR (с быстрым буфером I и быстрым буфером II). Вставки разных размеров амплифицировали и подтверждали с помощью быстрых буферов как I, так и II, в тех же условиях (рисунок 4).

Условия ПЦР: 98°C 5 секунд ■ 55°C 10 секунд 30 циклов 72°C 20 секунд ■

Информация для заказчиков
RR070A	Высокоэффективная ДНК-полимераза SpeedSTAR	250 ед.