Лучшее качество результатов за меньшее время

Лучшее качество результатов за меньшее время

В традиционном электрофорезе в агарозном геле приготовление геля и проведение анализа занимает не меньше часа. Новая гелевая система Reliant FastLane обеспечивает оптимальное разделение ДНК всего за 15 минут. Система состоит из камеры для электрофореза нового дизайна, готовых агарозных гелей и упакованного разбавленного буфера. Гелевая система Reliant FastLane прошла проверку качества, и качество подтверждено стандартным и множественным ПЦР, рестриктазным расщеплением, клонированием, восстановлением ДНК и Саузерн-блотом.

Хорошее разрешение и разделение фрагментов, постоянное от геля к гелю, очень важно для точного анализа данных. При использовании гелевой системы Reliant FastLane для множественного ПЦР-анализа разрешение и разделение ДНК выше, чем в стандартных системах для электрофореза. Чтобы показать возросшую способность к разделению в гелевой системе Reliant FastLane, мы амплифицировали первую нить кДНК K-562 с набором праймеров для генов человеческих цитокинов, генов человеческих воспалительных цитокинов и человеческих генов апоптоза и анализировали образцы в 2,5% геле Reliant FastLane и стандартном 2% готовом геле Reliant в нескольких различных условиях анализа. На рисунке 1 чётко показано повысившееся разрешение и разделение фрагментов в геле Reliant FastLane по сравнению со стандартным гелем Reliant в рекомендуемых условиях. Чтобы получить подобное качество разрешения в стандартном геле, время анализа необходимо увеличить на 50%, в то время как гелевая система Reliant FastLane облегчает получение данных без потери точности.

Гель Reliant Fastlane Готовый гель Reliant Готовый гель Reliant

225 вольт, 15 минут 150 вольт, 15 минут 150 вольт, 40 минут

Рисунок 1. Множественный ПЦР (мПЦР) образцов, выделенных с помощью гелевой системы Reliant FastLane и с помощью стандартной системы электрофореза.

Дорожка 1: ряд ДНК-лэддеров SimplyLoad,

Дорожка 2: ДНК-лэддеры QuantLadder SimplyLoad,

Дорожка 3: контрольная кДНК человеческого цитокина,

Дорожка 4: реакция ДНК цитокина K-562 в мПЦР,

Дорожка 5: контрольная кДНК человеческого воспалительного цитокина,

Дорожка 6: реакция ДНК K-562 воспалительного цитокина в мПЦР,

Дорожка 7: контрольная кДНК человеческого апоптоза,

Дорожка 8: реакция ДНК K-562 апоптоза в мПЦР.

Ключевой методикой для большинства молекулярно-биологических лабораторий является клонирование. Восстановление ДНК после расщепления рестриктазами или из ПЦР-фрагментов из агарозных гелей является рутинной стадией после электрофореза, требующей чёткого разделения фрагментов, качественной агарозы и тщательного приготовления геля. Обычно фрагменты ДНК вырезают из агарозных гелей при стандартной температуре плавления или при более низкой температуре, и ДНК очищают от агарозы с помощью одного из многочисленных имеющихся на рынке наборов. Гели Reliant FastLane изготовлены из высококачественной агарозы, свободны от контаминации, которая может создать препятствия для методик восстановления, а дизайн гелевой системы позволяет быстро проводить анализ в геле, повышая качество разделения ДНК и разрешение. На рисунке 2 показано восстановление фрагментов ДНК размером 500 н. п. и 1000 н. п. из стандартов ДНК Quant Standards (Gensura). Полосы, содержащие 200 нг, вырезали из 1% TBE геля Reliant FastLane, 1% TAE геля Reliant FastLane, 1% геля Reliant и 1% агарозного TBE геля ReadyAgarose (Bio-Rad). ДНК восстанавливали с помощью набора для экстракции гелей MinElute (Qiagen). Полученные образцы разбавляли затем до 20 мкл, и 2 мкл аликвоты разделяли в 1% TBE геле Reliant FastLane 15 минут при 225 В. Эти результаты показывают, что ДНК можно так же эффективно восстанавливать из гелей Reliant FastLane, как и из стандартных готовых агарозных гелей.

Рисунок 2. Восстановление ДНК из гелевой системы Reliant FastLane.

Дорожки 1, 6 и 11: ДНК-лэддеры QuantLadder SimplyLoad,

Дорожки 2-5: фрагменты размером 500 н. п., выделенные из: 1% TAE геля Reliant FastLane, 1% TBE геля Reliant FastLane, 1% геля TBE и 1% агарозного TBE геля ReadyAgarose,

Дорожки 7-10: фрагменты размером 1000 н. п., выделенные из: 1% TAE геля Reliant FastLane, 1% TBE геля Reliant FastLane, 1% геля TBE и 1% агарозного TBE геля ReadyAgarose,

Дорожка 12: ряд ДНК-лэддеров.

Для эффективного переноса в Саузерн-блоте из агарозных гелей чрезвычайно важны несколько факторов, например, сила геля и толщина геля. Агарозные гели Reliant FastLane обладают достаточной силой геля для протяжённых переносов и однородностью по всей толщине геля, улучшающей эффективность переноса из геля в гель. На рисунке 3 показано, что эффективность переноса из гелей Reliant FastLane соответствует эффективности переноса из готовых агарозных гелей Reliant. Образцы ДНК-лэддеров размером 500 н. п. и ДНК-маркёров размером 1-10 кб были помечены с помощью набора DIG-ChemLink (Roche) и нанесены на гель в условиях, рекомендованных Roche. Вслед за электрофорезом гели переносили в течение 4 часов с помощью системы TurboBlot (Schleicher и Schuell) на заряженную нейлоновую мембрану (BrightStar от Ambion).

Панель A Панель B

Гель Reliant Гель Reliant FastLane

Рисунок 3. Эффективность переноса из геля Reliant FastLane с помощью Саузерн-блота. Панель A – Саузерн-блот в 1% TBE геле Reliant. Панель B – Саузерн-блот в 1% TBE геле FastLane. Образцы ДНК-лэддера размером 500 н. п. с меткой DIG и ДНК-маркёра размером 1-10 кб (5 нг, 10 нг и 20 нг) наносили на гель Reliant FastLane. Полученные электрофорезные гели переносили на заряженную нейлоновую мембрану в течение 4 часов и осуществляли хемилюминесцентную детекцию.

Гелевую систему Reliant Fastlane можно использовать для разделения фрагментов ДНК всего за 15 минут, что позволяет исследователям быстро получать точные результаты. Мы показали, что наша новая гелевая система – идеальный выбор для стандартной и множественной ПЦР, рестриктазного расщепления, восстановления ДНК и Саузерн-блота.

Информация для заказчиков
57009	Стартовый набор гелевой системы Reliant FastLane
57000	Камера FastLane
Гели и буфер Reliant FastLane, 10 гелей в упаковке
57010	12 лунок, 1% агароза SeaKem LE Plus, буфер TBE
57011	24 лунки, 1% агароза SeaKem LE Plus, буфер TBE
57012	12 лунок, 1% агароза SeaKem LE Plus, буфер TAE
57013	12 лунок, 2,5% агароза SeaKem SP Plus, буфер TBE
57014	24 лунки, 2,5% агароза SeaKem SP Plus, буфер TBE

Уже в продаже!

Клетки для исследований, связанных с ожирением

Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. анонсирует появление на рынке системы предшественников висцеральных жировых клеток человека Poietics для исследований, связанных с ожирением, инсулиновой устойчивостью, диабет II типа и некоторых сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний.

Преадипоциты – клетки-предшественники, из которых в ходе полной дифференциации развиваются адипоциты. Адипоциты выполняют важнейшие функции энергетического метаболизма и характеризуются накоплением внутриклеточных триглицеридов. Исследования показывают, что существуют значительные различия между подкожной и висцеральной жировой тканью и что висцеральные преадипоциты в большей степени мобилизуют свободные жирные кислоты, чем подкожный жир. Следовательно, висцеральная жировая ткань связана с заболеваниями, относящимися к ожирению.

До недавнего времени в продаже имелись только преадипоциты из подкожного жира. Теперь Вы можете значительно повысить интенсивность Ваших исследований, связанных с ожирением, используя преадипоциты из висцеральной жировой ткани. Система предшественников висцеральных жировых клеток человека Poietics состоит из человеческих преадипоцитов, выделенных из висцерального жира, окружающего внутренние органы, включая почки и яичники, и среды для их пролиферации и дифференциации в зрелые клетки, накапливающие жир. Более подробную информацию смотрите, пожалуйста, здесь: www. /visceralpre-adipocytes.

Информация для заказчиков
PT-5005	Предшественники висцеральных жировых клеток	1 млн. кл./амп.
PT-8000	Набор BulletKit для преадипоцитов	набор
PT-7009	Аналитический реактив AdipoRed	5 ´ 4 мл

Геномный анализ разнообразия эндотелиальных клеток

Эндотелиальные клетки (ЭК), покрывающие внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов, играют важную роль в развитии органов, коагуляции и развитии и поддержании сосудистой системы. Хотя принимается, что такие разные функции различных ЭК требуют высоко специализированной генной экспрессии, данные о дифференциации ЭК из различных анатомических источников ограничены.

Эндотелиальные клетки, окрашенные эндотелиальным клеточным маркёром

Чтобы исследовать молекулярное разнообразие ЭК, мы использовали микрочипы кДНК, кодирующие 43,200 признаков, чтобы выделить профили экспрессии 53 ЭК, выделенных из четырнадцати анатомически раздельных источников: пяти разных артерий (аорты, коронарной, лёгочной, подвздошной, пуповинной), двух различных вен (пуповинной и большой подкожной вены ноги) и семи различных тканей (кожи, лёгкого, кишечника, мышечной оболочки матки, носовых полипов, яичника и миокарда). Образцы получали в основном от Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., а также от других учёных Университетов Осло и Стэнфорда. Все исследуемые образцы не были заражены клетками других типов, как показали многочисленные тесты.

Первым значимым результатом для культивируемых образцов ЭК был строгий порядок и последовательность экспрессии, отражающий структуру исходных участков. Неконтролируемое иерархическое выстраивание генных участков из всех 53 образцов ЭК образовывало постоянную клеточную структуру в соответствии с исходными участками, независимо от донора или источника клеток (рисунок 1A). Эти данные позволяют предположить, что ЭК из различных анатомических источников имеют различные и характерные участки экспрессии, которые сохраняются в культуре in vitro.

Что касается группировки ЭК по анатомическому происхождению, экспрессия участков в образцах также имела поразительную корреляцию с размером сосудов (рисунки 1A и B). Образцы разделились на две основные группы: крупные сосуды (включая артерии и вены) и микрокапилляры, которые кодируются двумя крупными группами генов, которые мы обозначили как группа «крупных сосудов» и группа «микрокапилляров» соответственно (рисунок 1B). Некоторые из этих различий отражают разницу в механических и структурных характеристиках, которая сопровождает разницу размеров сосудов и физиологических ролей в коагуляции и гемодинамике. Далее, мы видим, что программы экспрессии ЭК из артерий и вен, судя по всему, значительно различаются, что молекулярные отличия артериальных и венозных ЭК постоянны в культуре с нарастающей очевидностью того, что их признаки закладываются до чёткого формирования сосудов и независимо от колебаний внешней среды. Интересно отметить, что некоторые специфические артериальные гены являются эволюционно консервативными, например, каскад реакций Notch Hey-2. Мы также выяснили, что ЭК из различных органов и тканей обладают специфичными для своего происхождения характеристиками генной экспрессии. Экспрессия этих специфичных генов позволяет предположить, что ЭК в этих органах или тканях играют активную роль в местной физиологии.

Наши исследования дают глубокую уверенность в том, что ЭК являются частью основы различных программ генной экспрессии, которые сохраняются на протяжении многих поколений в культуре клеток различных типов. Это многообразие дифференцированных типов клеток и сохранение различных программ дифференцированной экспрессии генов в гомогенной культуре клеток применяется в исследовательских разработках с выделенными ЭК. Различия в программах экспрессии генов позволяют с высокой достоверностью предположить, что ЭК из различных анатомических областей имеют соответствующие различия в потенциале своего развития, реакции на экспериментальные действия и взаимодействии с другими клетками. Поэтому точный вид ЭК следует внимательно учитывать в будущих исследованиях и терапевтических применениях, включая манипуляции с ЭК или сосудистыми структурами. Например, ЭК, выделенные из коронарной артерии, могут больше подходить для изучения заболеваний, связанных с коронарной артерией. Детали нашего исследования были опубликованы. Для более подробной информации и поиска данных по уровням экспрессии конкретных генов любых из специфичных образцов ЭК посетите, пожалуйста, наш сайт http://microarraypubs. stanford. edu/endothelial

артерия ткань (II) вена ткань (I)

коронарная артерия 2a коронарная артерия 2b лёгочная артерия 1 лёгочная артерия 2 коронарная артерия 1 коронарная артерия 3 коронарная артерия 4 аорта №3 аорта №1 аорта №2 пуповинная артерия №4 пуповинная артерия №3 пуповинная артерия №5 пуповинная артерия №2 пуповинная артерия №7 подвздошная артерия №3 подвздошная артерия №2 подвздошная артерия №5 подвздошная артерия №6 подвздошная артерия №1 нос, микро №2 нос, микро №1 нос, микро №3 яичник, микро №1 яичник, микро №2 миокард №1 миокард №2 пуповинная вена №1 пуповинная вена №5 пуповинная вена №2 пуповинная вена №6 пуповинная вена №3 пуповинная вена №4 подкожная вена ноги №2 подкожная вена ноги №1 Матка, микро №2 матка, микро №3 матка, микро №1 кожа, микро №2 (живот) кожа, микро №3 (грудь) кожа, микро №8 (живот) кишечник, микро №1 кишечник, микро №2 кожа, микро №5 (живот) кожа, микро №6 (живот) лёгкое, микро №4 кожа, микро №3 (живот) кожа, микро №1 (грудь) кожа, микро №7 (живот) кожа, крайняя плоть новорожденного лёгкое, микро №3 лёгкое, микро №2 лёгкое, микро №1

Рисунок 1. Разнообразие эндотелиальных клеток, выявленное при изучении профилей экспрессии.

Информация для заказчиков
Среды
CC-3162	Набор BulletKit EGM-2	500 мл
CC-3202	Набор BulletKit EGM-2 MV	500 мл
Первичные модифицированные человеческие клетки
CC-2535	Клетки эндотелия аорты	>500,000 кл./амп.
CC-2585	Клетки эндотелия коронарной артерии	>500,000 кл./амп.
CC-2530	Клетки эндотелия лёгочной артерии	>500,000 кл./амп.
CC-2517	Клетки эндотелия пуповинной вены	>500,000 кл./амп.
CC-2543	Клетки эндотелия микрокапилляров кожи	>500,000 кл./амп.
CC-2527	Клетки эндотелия микрокапилляров лёгкого	>500,000 кл./амп.
CC-2564	Клетки эндотелия микрокапилляров матки	>500,000 кл./амп.

Пуповинная кровь: Почему она нас интересует?

Кроветворные предшественники/стволовые клетки (HPC) могут превращаться в зрелые клетки любого типа из имеющихся в крови. Первичным местом нахождения HPC является костный мозг, и в течение многих десятилетий их успешно использовали в методиках кроветворной трансплантации. В зависимости от обстоятельств, HPC могут также обнаруживаться в других местах, например, в периферической крови. В действительности обычный термин «трансплантация костного мозга» является ошибочным. В настоящее время многие пациенты получают стволовые клетки периферической крови, «мобилизованные» из костного мозга с помощью препаратов для спасительной трансплантации.

Другой важный источник HPC – пуповинная кровь. Это кровь новорожденного, вытекающая из плаценты и пуповины при рождении. Периферическая кровь новорожденного содержит больший процент HPC, чем взрослая кровь, возможно, потому, что основное место кроветворения перемещается при рождении из зародышевой печени в костный мозг. Тем не менее, процент HPC в пуповинной крови ниже, чем в костном мозге, и объём каждого препарата пуповинной крови ограничен (обычно 50-100 мл).

Приоритетом становится исследование пуповинной крови… Законодатели в Сенате и Палате представителей признали важность исследований стволовых клеток пуповинной крови, представив законопроект «Акт о стволовых клетках пуповинной крови 2003 г.». Этот законопроект поможет продвинуть альтернативу исследованиям на эмбриональных стволовых клетках и организовать сеть квалифицированных банков пуповинной крови для клинической трансплантации, стимулируя таким образом научные усилия в этой области.

HPC пуповинной крови представляют огромный научный и терапевтический интерес. Пуповинную кровь успешно использовали для детской трансплантации, отлично приживается и имеет более низкие пороги гистосовместимости. Главное ограничение для трансплантантов HPC – доступность гистосовместимых доноров. Трансплантанты из пуповинной крови могут удовлетворять этому условию двумя способами. Во-первых, пуповинную кровь можно использовать для трансплантантов с более низким уровнем реакции «трансплантант против хозяина» (GVHD), даже если донор не полностью соответствует реципиенту. Во-вторых, этническое многообразие банков пуповинной крови более представительно по отношению к населению, чем донорские программы костного мозга, что увеличивает возможности. Тем не менее, количественные параметры каждой коллекции пуповинной крови ограничивают её применение для взрослой трансплантации. В пуповинной крови редко содержится достаточно клеток для трансплантации реципиентам весом более 50 кг.

Хотя использование пуповинной крови в трансплантации HPC было успешным в течение столь длительного времени, многое ещё неизвестно о специальных характеристиках пуповинной крови. Область активных исследований – пролиферация стволовых клеток пуповинной крови in vivo.

Если есть возможность культивирования в условиях, которые допускают пролиферацию стволовых клеток сразу, как только они становятся способны приживаться, без потери этой способности, это может значительно расширить использование трансплантантов пуповинной крови в сторону взрослых реципиентов. Также необходимы дополнительные исследования вопроса о том, почему уровень GVHD ниже при трансплантации чужой пуповинной крови. Причиной этого может быть незрелость иммунных клеток новорожденного и меньшая способность отвечать на реакцию хозяина, и это может помочь обнаружить триггеры, участвующие в GVHD. У HPC пуповинной крови также есть свои уникальные характеристики. Считается, что в пуповинной крови более высокий процент ранних предшественников и стволовых клеток по сравнению с HPC из костного мозга. Эти клетки необходимы для успешного приживления и длительного восстановления кровеносной системы. Тем не менее, трансплантанты из пуповинной крови часто задерживают кроветворное восстановление по сравнению с трансплантантами из костного мозга. Это может быть следствием соотношения ранних и поздних предшественников в пуповинной крови или общего количества предшественников, которое часто ограничено. Кроме того, HPC пуповинной крови могут иметь другие характеристики стремления к микроокружению по сравнению с костным мозгом. Эти и многие другие вопросы изучаются в исследовательских лабораториях с использованием методов культуры и характеристики клеток и животных моделей.

Больше не нужно ждать продуктов пуповинной крови… В феврале 2004 г. Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. запустил дополнительную коллекцию пуповинной крови, значительно увеличив количество доступных образцов пуповинной крови. В результате мы можем предложить большее количество исследовательских продуктов если не сразу, то с минимальным периодом ожидания. Мы предлагаем различные клетки для исследовательских работ, выделенные из пуповинной крови, в том числе мононуклеары, CD34+ клетки и лимфоциты.

Информация для заказчиков
2C-101	Клетки пуповинной крови CD34+
2C-102	Клетки пуповинной крови CD133+
2C-150	Мононуклеары пуповинной крови
2C-200	CD4+ T-лимфоциты пуповинной крови
2C-300	CD19+ B-лимфоциты пуповинной крови
По вопросам размеров упаковок и наличия продуктов обращайтесь в службу заказов Cambrex

Три способа диагностики состояния клеток.

Жизнь клетки в культуре состоит из нескольких фаз. Например, клетка может активно пролиферировать, или испытывать действие токсичных веществ или недостаток необходимых питательных компонентов, или запускать процесс программируемой клеточной гибели (апоптоза). Теперь разработана единая биолюминесцентная аналитическая панель для определения жизнеспособности, токсичности и апоптоза – наиболее важных параметров для большинства научных, прикладных (разработка лекарств) и токсикологических задач.

В основе анализа лежит измерение АТФ, необходимого компонента для поддержания жизнеспособности клеток. Её уровень строго регулируется в здоровых клетках и резко уменьшается, когда клетки погибают. Измерять АТФ можно с помощью фермента люциферазы, который получают из североамериканских светлячков Photinus pyralis. Люцифераза катализирует реакцию АТФ с субстратом люциферином с выделением света (рисунок 1). Когда люциферин и люцифераза присутствуют в избытке, количество излучаемого света прямо пропорционально количеству АТФ.

Поскольку внутриклеточный уровень АТФ в жизнеспособных клетках является постоянным, уровень АТФ в культуре напрямую зависит от числа жизнеспособных клеток. Таким образом, количество АТФ – превосходный критерий клеточной пролиферации. С помощью анализа АТФ можно точно измерить влияние любой стимуляции или ингибирования на пролиферацию клеток в культуре (рисунок 2). Наш набор для анализа клеточной пролиферации и цитотоксичности ViaLight Plus основан на уникальной двухстадийной гомогенной реакции, в которой АТФ эффективно высвобождается из клеток млекопитающих, ингибируются эндогенные ферменты и одновременно становится возможным измерение АТФ, которое даёт результаты менее чем за 15 минут.

Когда клетка подвергается воздействию, например, токсичных веществ, клеточная мембрана может истончаться и рваться. Эти разрывы приводят к проникновению внутриклеточных ферментов наружу. Два примера таких ферментов – лактат-дегидрогеназа (ЛДГ) и аденилат-киназа (АК). АК – довольно сильный фермент и фосфорилирует АДФ с образованием АТФ – отличного вещества для измерения с помощью набора для неразрушающего анализа цитотоксичности ToxiLight. Отбирают небольшую пробу культуральной среды и добавляют её к смеси, содержащей АДФ, люциферин и люциферазу. АК катализирует превращение АДФ в АТФ, а люцифераза катализирует реакцию люциферина и АТФ с выделением света. Излучаемый свет пропорционален количеству АК в культуральной среде. Набор ToxiLight разработан для неразрушающего анализа, который позволяет отбирать пробы по прошествии времени или выполнять повторные анализы одного образца. Таким образом, анализируя образцы супернатанта, можно определить кинетику клеточной гибели, продолжая использовать живые клетки в качестве другого экспериментального параметра анализа (рисунки 2 и 3).

Гибель клетки может протекать по обычному механизму, известному как апоптоз. При запуске апоптоза прекращается жёсткая регуляция внутриклеточных уровней АДФ и АТФ, и уровень АДФ повышается. За этим следует продолжительный рост уровня АДФ одновременно с падением уровня АТФ. В результате отношение АДФ к АТФ повышается по мере ухудшения состояния клеток. Набор для быстрого определения апоптоза ApoGlow позволяет определять отношение АДФ к АТФ в клетках с помощью последовательных измерений биолюминесценции в 96-луночном формате. Набор ApoGlow – эффективный исследовательский инструмент, позволяющий различать апоптоз, некроз и пролиферацию клеток. Результаты получаются меньше чем за 20 минут при чувствительности до 100 клеток/лунке.

Рисунок 1. Излучение света с участием фермента люциферазы.

АТФ + люциферин + O2 ――――――→

Люцифераза

оксилюциферин + АМФ + PPi + CO2 + свет

Рисунок 2. Влияние повышения концентрации ингибитора топоизомеразы камптотецина на клетки миеломы A226. Жизнеспособность клеток определяли с помощью набора для детекции АТФ ViaLight Plus и набора для детекции снижения проницаемости мембраны (цитолиза) ToxiLight. Результаты – среднее n = 3 ± SD.

[камптотецин], нМ

ViaLight Plus RLU

ToxiLight RLU

Набор ViaLight Plus

Набор ToxiLight

Рисунок 3. Эффект трансфекции клеток HUVEC с повышением концентрации ДНК. Набор ToxiLight использовали для того же образца, что и анализ репортерного гена, для определения клеточной жизнеспособности в результате трансфекции.

[ДНК], мкг

Люциферазные RLU

ToxiLight RLU

Люциферазный репортерный анализ

Набор ToxiLight

Измерение АТФ с помощью биолюминесценции – простая методика, которую можно эффективно использовать для многих задач. Каждый из этих методов быстрый и чувствительный, с широким диапазоном возможностей и высокой воспроизводимостью, что делает их привлекательными для исследователей. Аналитические наборы позволяют измерять пролиферацию клеток в культуре в простом формате, определяя число жизнеспособных клеток по уровню АТФ. Это единственный метод, позволяющий различать пролиферацию, цитолиз и задержку роста. Аналитические наборы ToxiLight предназначены для неразрушающего анализа цитолиза, позволяющего включить анализ цитотоксичности в любую клеточную методику. Наконец, набор для скрининга ApoGlow позволяет определять апоптоз на потоке в 96-луночном формате.

Информация для заказчиков
Аналитический набор на пролиферацию клеток и цитотоксичность ViaLight
LT07-221	500 тестов
LT07-121	1000 тестов
LT07-321	10000 тестов
LT17-221	500 тестов, с планшетами
Аналитический набор на цитотоксичность без разрушения клеток ToxiLight
LT07-217	500 тестов
LT07-117	1000 тестов
LT07-317	10000 тестов
LT17-217	500 тестов, с планшетами
Набор для быстрого скрининга на апоптоз ApoGlow
LT07-115	200 тестов

Набор для определения микоплазм MycoAlert.

Новый набор для контрольного анализа поступил в продажу.

Набор для определения микоплазм MycoAlert разработан для быстрого, лёгкого и эффективного выявления контаминации клеточных культур микоплазмами, даже в очень небольших концентрациях. Скорость удобство и надёжность делают теперь анализ на микоплазмы настолько простым, что его можно выполнять при каждом пересеве клеток, чтобы удостовериться, что культура не заражена микоплазмами и полученным результатам можно доверять.

Рисунок 1. Наборы MycoAlert превосходят другие методики по быстроте и надёжности обнаружения микоплазм.

Достоинства методики определения микоплазм MycoAlert:

·  Скорость – результаты получаются менее чем за 20 минут, что позволяет быстро оценить состояние культур. Получение результата другими методами занимает от нескольких часов до нескольких недель.

·  Универсальность – метод позволяет определять все микоплазменные и ахолеплазменные инфекции, которые обычно заражают культуры клеток.

·  Чувствительность – метод позволяет определять микоплазмы в концентрации менее 50 cfu/мл и избежать ложноотрицательных результатов, часто имеющих место в ПЦР и флуоресцентном окрашивании.

·  Удобство – просто смешайте два реагента со 100 мкл Вашего культурального супернатанта и проведите два измерения с помощью люминометра.

·  Полный комплект – каждый набор содержит все необходимые реактивы для постановки анализа, в отличие от коммерческих наборов для ПЦР, для которых дополнительно требуются Taq-ДНК-полимераза, нуклеотиды, ферменты для рестрикции и реактивы для электрофореза в агарозном геле.

Информация для заказчиков
Набор для детекции микоплазм MycoAlert
LT07-118	10 тестов
LT07-218	25 тестов
LT07-318	100 тестов
	Контрольный набор для анализа MycoAlert
LT07-518	10 тестов

Изоэлектрическое фокусирование белков в агарозном геле

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) – мощная методика разделения белков в сложных смесях. ИЭФ позволяет разделять белки по принципу разницы из зарядов (изоэлектрической точки, или pI) в присутствии градиента pH. В стандартных протоколах ИЭФ используются полиакриламидные гели сложного состава, имеющие ограничения по ряду параметров. В качестве альтернативной гелевой матрицы можно использовать агарозу, которая для целей изоэлектрического фокусирования обладает несколькими значительными преимуществами перед полиакриламидом.

Агарозная гелевая матрица налагает меньше ограничений, чем полиакриламид, она позволяет разделять, анализировать и иммунологически проявлять белки с очень высоким молекулярным весом (> 2,000 кДа). ИЭФ в агарозном геле – наиболее эффективный способ разделения нативных высокомолекулярных белков, например, моноклональных антител IgM и IgG. Агарозные гели позволяют разделять высокомолекулярные белки нормальной человеческой плазмы и тканей, а также злокачественных человеческих асцитов и опухолей, что невозможно в полиакриламидных гелях.

Помимо высокого разрешения при разделении крупных и сложных белков, использование агарозы значительно облегчает процесс ИЭФ и обеспечивает большую вариабельность сопутствующих методик. Агарозные гели не содержат остаточных токсинов или побочных продуктов полимеризации, их проще готовить, чем полиакриламидные гели. Поскольку агароза обладает меньшей просеивающей способностью, чем полиакриламид, полное фокусирование может происходить уже за 30 минут без использования очень высоких напряжений. Агарозный матрикс с крупными порами позволяет разделённым образцам быстро и легко проступать на мембранах. Более того, разделённые белки возможно «легко вырезать и быстро элюировать из геля». Агарозные гели фиксируются, обезвоживаются и окрашиваются намного быстрее полиакриламидных. Оптически прозрачные высушенные агарозные гели можно легко сканировать с помощью денситометра или хранить в тетради.

Мы разработали первую агарозу, предназначенную специально для изоэлектрического фокусирования, исключив характерный для агарозы Электроэндоосмос (ЭОО). Для ИЭФ можно использовать только агарозу без ЭОО. Электроэндоосмос происходит во время электрофореза и относится за счёт анионных остатков, сульфатов эфиров и пирувата, присутствующих в агарозе. «С анионными группами в геле связываются их гидратированные противоионы, которые движутся к катоду. Таким образом, вода вытягивается вдоль этих ионов и нейтральные молекулы, которые иначе не могли бы двигаться в электрическом поле, движутся в этой жидкости к катоду». Агароза IsoGel разработана специально, чтобы классическими методами не регистрировался заметный ЭОО. Агароза IsoGel содержит нейтральный, не образующий геля полисахарид, который имеет большое значение ограничения связанной с матриксом катионной подвижности – главной причины катодного ЭОО.

Рисунок 1. Разделение белков в агарозном планшете для ИЭФ IsoGel, pH 3-10. Дорожки 1 и 4: маркёр pI FMC (недоступен). Дорожки 2 и 3: широкий спектр маркёров pI 4,45-9,6 (Bio-Rad). Дорожка 5: гемоглобин, HB тип AFSC (PE Wallac). 2,5 мкл каждого образца наносили на гель и предварительно фокусировали 10 минут при 1 Вт, затем фокусировали 60 минут при 2,000 вольт (максимум), 25 мА (максимум) в камере Pharmacia MultiPhor при 10°C. Гель окрашивали красителем Крауля.

Белки

Чечевичный лектин

Лошадиный миоглобин

Бычья карбоангидраза

Овальбумин

Амилоглюкозидаза

pI относительно расстояния от катода

Цитохром C

Лектин, чечевица, L1

Лектин, чечевица, L2

Лектин, чечевица, L3

Миоглобин, лошадиный, большая полоса

Миоглобин, лошадиный, малая полоса

Бычья карбоангидраза

b-лактоглобулин B

b-лактоглобулин A

Овальбумин

Оксидаза глюкозы

Амилоглюкозидаза

расстояние от катода (см)

Чтобы предложить исследователям ещё большие преимущества, мы создали готовые планшеты с агарозой для ИЭФ IsoGel, готовые гели для использования в ИЭФ. Толщина геля планшета IsoGel – 0,6 мм, что позволяет одновременно максимально увеличить разрешение, улучшить эффективность охлаждения, добиться долгосрочной стабильности геля и предотвратить выжигание геля. Планшеты специально готовят из агарозы IsoGel и амфолитов, они сконструированы для быстрого разделения с высоким разрешением и отличной воспроизводимости. Фокусирование завершается за 60-90 минут. Высушивание, окрашивание и удаление красителя проходят менее чем за час. Планшеты IsoGel готовят на плёнке GelBond, так что они обладают сильной адгезией и пространственной стабильностью в ходе работы. Фон при окрашивании минимален, так что даже слабые полосы можно проявлять без труда.

Планшеты для ИЭФ с агарозой IsoGel предоставляют исследователям больший выбор методик детекции белком. Окрашивание бриллиантовым синим красителем Кумасси придаёт окрашенному гелю отличную чувствительность и прозрачный, бесцветный фон. Окрашивание двойным красителем Крауля даёт чёткие, ярко выраженные полосы. Протоколы серебряного окрашивания и получения отпечатков путём плотного контакта предоставляются технической службой.

Информация для заказчиков
50202	Агароза IsoGel	25 г
Планшеты для ИЭФ с агарозой IsoGel
56015	диапазон pH 3-10	6 планшетов
56018	диапазон pH 6-10,5	6 планшетов
56024	диапазон pH 7-11	6 планшетов
Наборы принадлежностей IsoGel
56014	Рамки, 125 мм тампоны и бумага для блота	6 планшетов
56010	125 мм тампоны и бумага для блота	100/уп.

Мономер Duramide: Новый мономер для электрофореза.

Мы разработали мономер Duramide (N-гидроксиэтилакриламид), новый гидрофильный мономер для разделения биомолекул. Мономер Duramide – замещённый акриламид, более стабильный, чем сам акриламид, в условиях высоких значений pH, стандартных для электрофореза белков и нуклеиновых кислот.

В электрофорезе белков стандартный буфер Лэммли (pH 8,8) значительно сокращает время жизни полиакриламидных гелей. Гидролиз нейтральных, гидрофильных концов цепей в геле изменяет их мобильность и потере чёткости изображения, наблюдаемой в более старых гелях ПААГ. Отказ от системы Лэммли в пользу буферов с меньшим pH может увеличить срок хранения, но не избавляет от недостатков альтернативных схем разделения и специализированных буферов. Мономер Duramide позволяет использовать буфер Лэммли с готовым белковым гелем с длительным сроком хранения (Resource Notes, т. 1, вып. 1).

В сотрудничестве с профессором Аннелизе Баррон мы показали, что линейные полимеры мономера Duramide служат эффективными матрицами для сиквенса ДНК в приборах для капиллярного электрофореза. Поли-Duramide также является оптимальным капиллярным покрытием для анализа полиморфизма/ гетеродуплексов в спаренной однонитевой конформации.

Сейчас мы предлагаем мономер Duramide высокой чистоты для целей электрофореза, по мере того, как анализ белков становится действительно важным, возрастает интерес к нашему мономеру Duramide.

Информация для заказчиков
Мономер Duramide
50928	100 мл
50918	750 мл

Быстрая оптимизация среды для клеток CHO для максимальной эффективности

Клетки яичника китайского хомячка (CHO) широко используются для экспрессии рекомбинантных белков, поскольку при экспрессии CHO происходят посттрансляционные модификации, приводящие к образованию биологически активных белков в клетках млекопитающих. Каждый трансфецированный клон CHO имеет уникальные потребности в питательных веществах, и правильный подбор среды может быть долгим и дорогостоящим процессом для биоинженеров, заинтересованных в наилучшем результате.

Набор ProMEDIA SELECT (18-001U)

Будучи лидером на рынке биоинженерной продукции, мы потратили годы научной работы, чтобы предложить быстрый и недорогой вариант. Набор ProMEDIA SELECT разработан для приготовления безбелковой и бессывороточной среды, не содержащей компонентов животного происхождения, которая:

·  Улучшает рост клеток и их жизнеспособность.

·  Поддерживает высокую плотность клеток, сохраняя высокую жизнеспособность.

·  Повышает продукцию белка.

·  Облегчает поточную очистку.

·  Снимает необходимость собственных расходов и усилий на разработку среды.

·  Позволяет делать количественный расчёт продукта.

Набор содержит 16 точных прописей без компонентов животного происхождения, 100 мл каждой, в удобном формате коробки. Эти индивидуальные уникальные прописи удовлетворяют широкому диапазону требований к питательным веществам и нуждаются только в добавлении 4 мМ L-глутамина.

Набор предназначен для использования с клонами CHO, адаптированным к суспензионной культуре и бессывороточным условиям. Если Ваша культура клеток растёт в прикреплённом состоянии и/или на сыворотке, рекомендуется перевести клетки на среду ProCHO-4 (12-029Q) до использования набора. В большинстве случаев клетки CHO можно одновременно переводить с адгезионных культур с сывороткой на бессывороточные адгезионные культуры в среде ProCHO-4.

На рисунке 1 на предыдущей странице показано:

·  Среда ProCHO-4 обеспечивает непосредственный и одновременный перевод клеток CHO в суспензионную культуру и на бессывороточный рост.

·  Среды Коммерческого производителя 1 и Коммерческого производиоценка производилась без дополнительного рекомбинантного инсулина) оказались неспособны обеспечить одновременный перевод клеток в суспензионную культуру и на бессывороточный рост.

Процесс оценки этих сред является и быстрым, и эффективным. К каждому набору прилагаются избирательные протоколы, включающие трёхнедельную одновременную проверку 16 прописей сред на многолуночных планшетах. Сначала клон CHO наблюдают в каждой прописи среды, чтобы изучить ростовые характеристики, и затем повторно, чтобы оценить максимальную продукцию белка. Этот двухстадийный подход необходим, т. к. специфические питательные требования для поддержания максимальной пролиферации могут отличаться от требований для максимальной продукции белка.

После того, как из 16 возможных вариантов среды выбрано несколько прописей, поставляется до пяти литров среды без дополнительной оплаты для дальнейшего обучения и отработки анализа. Более того, по Вашему желанию может быть организована бесплатная техническая консультация для ответов на любые вопросы или предоставления любой необходимой помощи для завершения Вашего исследования.

Выбор правильной прописи среды для максимального роста и экспрессии – всегда непростая задача; поиск бессывороточной среды может усложнить её ещё больше. В случае набора ProMEDIA SELECT основная работа уже сделана, что экономит Ваше время и деньги.

Рисунок 1. Сравнительный анализ бессывороточных сред для CHO. Отобранные клетки CHO росли прикреплёнными в t-флаконах в DMEM:F12 + 10% ЭБС. 500 мл центрифужные флаконы заполняли 200 мл специальной среды, добавляют 2´105 клеток/мл и инкубируют в 5% CO2 при 37°C.

Пассажи

–¨– ProCHO-4 CDM

–·– Коммерческий производитель 2

–¦– Коммерческий производитель 2+1

–n– Коммерческий производитель 1

–r– Коммерческий производитель 1+1

Информация для заказчиков
18-001U	Набор для подбора бессывороточных сред без компонентов животного происхождения ProMEDIA SELECT	16 флаконов по 100 мл

Набор ProMEDIA SELECT

Часто задаваемые вопросы

1)  Все ли шестнадцать прописей в наборе содержат и инсулин, и Pluronic F68? Да. Каждая среда содержит рекомбинантный человеческий инсулин. Pluronic F68 – неионное поверхностно активное вещество, которое помогает стабилизировать клеточную мембрану при механических повреждениях.

2)  Что рекомендуется для бессывороточной заморозки клонов CHO? Мы предлагаем новый продукт, среду для заморозки 2´ без компонентов животного происхождения ProFreeze, специально разработанную для заморозки клеток, которые велись в бессывороточной среде. Эта безбелковая среда, не содержащая животных компонентов, обеспечивает высокую жизнеспособность клеток при разморозке после хранения. Перед использованием к среде ProFreeze следует добавлять 15% диметилсульфоксида (DMSO) степени чистоты для спектрофотометрического анализа.

3)  Сколько времени требуется, чтобы оценить прописи сред? При использовании эффективного протокола, который прилагается к набору, оценка 16 вариантов ростовых сред обычно занимает 10 дней. Время, необходимое для оценки продукции белка, может различаться. Обычно можно отбирать кондиционированную среду через 7 дней или меньше, но время анализа белка зависит от конкретной используемой методики.

4)  Нужно ли держать клетки в бессывороточной среде перед оценкой прописей сред? Для достижения наилучшего результата перед тестированием клетки следует культивировать в среде ProCHO-4. На среду ProCHO-4 легко переводить широкий диапазон клеток, но удовлетворительные результаты можно получить и после одностадийного перевода из культуры с сывороткой непосредственно на среду из набора.

5)  Можно ли использовать набор ProMEDIA SELECT для адгезионных клеток CHO? ProMEDIA SELECT разработана для суспензионных культур и не поддерживает прикрепление. Тем не менее, адгезионные клетки CHO можно легко перевести в суспензионную культуру с помощью среды ProCHO-4 (12-029Q).

Что нового?

Делайте новые открытия!

Экономьте время и силы на выделении клеток без потери качества!

Раскройте новые роли, которые играют астроциты в управлении химией мозга, с помощью наших новых нормальных человеческих астроцитов Clonetics. С помощью нашей уникальной целостной системы из клеток и сред экономьте время и силы на выделении клеток без потери качества! Теперь доступны эти нетрансформированные, не бессмертные клетки. Система поставляется в комплексе, клетки, ростовые среды и ростовые факторы. Всё, что Вам необходимо, чтобы начать работать уже сегодня!

Система астроцитов:

·  Замороженные астроциты, 1,000,000 клеток в ампуле.

·  Набор BulletKit для роста астроцитов, включающий бессывороточную основную среду и ростовые факторы SingleQuots.

·  Гарантируется 10-кратное удвоение популяции клеток.

·  После разморозки кислым фибриллярным глиапротеином окрашивается > 80% клеток.

·  Уже доступны.

Нашу систему нормальных человеческих астроцитов можно использовать для исследований в актуальных областях медицины, таких как болезнь Альцгеймера, инсульт, болезнь Паркинсона или нарушения развития нервной ткани, для разработок в области дисфункций мозга, функций памяти и современной биохимии нейронов. Более подробную информацию о нормальных человеческих астроцитах Clonetics см.: www. /promotion/AGM_intro.

Информация для заказчиков
CC-2565	Нормальные человеческие астроциты	1 млн. кл./амп.
CC-3187	Набор BulletKit для роста астроцитов, включающий ростовые факторы	основная среда и добавки SingleQuots