сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)
сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный
в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного
рогатого скота 1:200 с оценкой 2 - 4 креста - "положительная" 200
МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 - 4 креста - "сомнительная"
100 МЕ).
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию
антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки
записывают в журнал серологических исследований.
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и
реакции длительного связывания комплемента (РДСК)
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при
диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков,
зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов),
собак и пушных зверей.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более
чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез
сывороток крови животных.
4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:
- испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);
- позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная
биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;
- негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из
опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или
полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки
инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК -
приС в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов -
, буйволов -, свиней -С); для РДСК -
сыворотки крови животных всех видов - приС в течение 30
мин.;
- антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем
титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п.
6);
- комплемент - сыворотка крови морской свинки, лиофильно
высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или
консервированная добавлением 2 - 4% борной кислоты).
Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим
раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество
ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения
всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон)
вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в
холодильник намин. Растворившийся комплемент осторожно
перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают
в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при С.
Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования
растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим
раствором 1:20, а остальной - хранят в холодильнике для постановки
главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят
непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;
- гемолитическая сыворотка (гемолизин) - сыворотка крови
кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, - для РСК и
РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при
использовании каждой новой серии и по истечении срока годности
(см. Прил. N 2, п. 5);
- эритроциты барана - 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов
барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2,
п. 3).
Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и
раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах
и при постановке РСК выдерживают в водяной бане приС в
течениемин. при периодическом перемешивании, а при
постановке РДСК - в холодильнике. При смешивании компонентов
раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;
- физиологический раствор - 0,85%-ный раствор химически
чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 - 7,2 или
физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см.
Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в
случае использования нативного комплемента (свежей или
консервированной сыворотки крови морской свинки).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят
перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на
антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
------T---
¦ Компоненты ¦ Проверка на: ¦
¦ реакции +T----+
¦ ¦антиком - ¦ гемотоксичность ¦
¦ ¦племен - +-------TTT+
¦ ¦тарность ¦компле-¦гемолизи-¦антигена¦физиологи-¦
¦ ¦ ¦мента ¦на ¦ ¦ческого ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦раствора ¦
+-----++-------++++
¦Комплемент в ¦0,2 ¦0,2 ¦- ¦- ¦- ¦
¦разведении 1:20 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----++-------++++
¦Гемолизин в ра - ¦0,2 ¦- ¦0,2 ¦- ¦- ¦
¦бочем разведении¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----++-------++++
¦Антиген в рабо - ¦0,4 ¦- ¦- ¦0,4 ¦- ¦
¦чем разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----++-------++++
¦Эритроциты ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦2,5%-ная взвесь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----++-------++++
¦Физиологический ¦- ¦0,6 ¦0,6 ¦0,4 ¦0,8 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----++-------++++
¦ водяная баня приС ¦
+-----TT----+
¦Результат ¦Гемолиз ¦Полная задержка гемолиза ¦
L-----++-----
В реакциях используют компоненты, не обладающие
антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента
Реакцию проводят в водяной бане приС в объеме 1 мл
(по 0,2 мл сыворотки, антигена, комплемента и 0,4 мл
гемолитической системы).
Перед каждой постановкой главного опыта проводят титрование
комплемента в бактериолитической системе на сыворотке из опыта,
т. е. того вида животных, которых исследуют (см. табл. 1), или в
гемолитической системе (см. Прил. 2, п. 4). Если в пробирках с
сывороткой и антигеном отмечают задержку гемолиза по сравнению с
той же сывороткой без антигена, это означает, что для титрования
была взята положительная сыворотка. В таком случае определение
титра комплемента проводят по ряду пробирок без антигена.
Сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл
сыворотки + 4 мл физиологического раствора), инактивируют, как
указано в подпункте 4.3.2, и вносят по 0,2 мл в два ряда по 10
пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент.
Для более точной дозировки вначале готовят необходимые
разведения комплемента в десятикратных объемах в отдельных
пробирках дополнительного ряда. В пробирки вносят комплемент,
разведенный 1:20 (1,0 + 19,0 физраствора), в дозах 0,2; 0,4; 0,6
мл и т. д. до 2 мл и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2
мл количество физиологического раствора, т. е. соответственно 1,8;
1,6; 1,4 мл и т. д. по следующей схеме:
------T----T----T----T----T---T----T----T----T----T---
¦Доза комплемента¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,1¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,2¦
+-----+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Комплемент 1:20 ¦0,2 ¦0,4 ¦0,6 ¦0,8 ¦1,0¦1,2 ¦1,4 ¦1,6 ¦1,8 ¦2,0¦
+-----+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Физиологический ¦1,8 ¦1,6 ¦1,4 ¦1,2 ¦1,0¦0,8 ¦0,6 ¦0,4 ¦0,2 ¦- ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-----+----+----+----+----+---+----+----+----+----+----
Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,2 мл жидкости в
первые пробирки с сывороткой, взятой для титрования, из второй
пробирки - соответственно во вторые пробирки с сывороткой и т. д.
Работу можно выполнять аппаратом Флоринского.
Титрование можно проводить путем внесения микропипеткой в
пробирки каждого ряда с сывороткой комплемента, разведенного 1:20
(0,1 + 1,9 физраствора), в возрастающих дозах от 0,02 до 0,2 мл с
интервалом 0,02 мл и добавления недостающего до 0,2 мл (в каждой
пробирке) количества физиологического раствора.
После внесения комплемента в первый ряд пробирок с сывороткой
вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд -
по 0,2 мл физиологического раствора, смешивают путем встряхивания
штатива и ставят в водяную баню приС на 20 мин. Затем во
все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, смешивают
путем встряхивания и вновь помещают в водяную баню на 20 мин.,
после чего учитывают результат.
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе
представлена в таблице 1.
Таблица 1
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА В БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ
-------T------T---
¦ Компоненты ¦Ряд ¦ Номера пробирок ¦
¦ реакции ¦проби-+----T----T----T----T---T----T----T----T----T---+
¦ ¦рок ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Сыворотка из ¦первый¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦
¦опыта 1:5 ¦второй¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦ водяная баня 30 мин. приС ¦
+------T------T----T----T----T----T---T----T----T----T----T---+
¦Антиген в рабочем¦первый¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦
¦разведении ¦второй¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Физиологический ¦первый¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦
¦раствор ¦второй¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Доза комплемента ¦первый¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,1¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,2¦
¦в разведении 1:20¦второй¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,1¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,2¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦Физиологический ¦первый¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,1¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦- ¦
¦раствор ¦второй¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,1¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦- ¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
+------T------T----T----T----T----T---T----T----T----T----T---+
¦Гемолитическая ¦первый¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4¦
¦система ¦второй¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4¦
+------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+---+
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
+------T------T----T----T----T----T---T----T----T----T----T---+
¦Примерный ¦первый¦ЗГ ¦ЗГ ¦ЗГ ¦ЧГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦
¦результат ¦второй¦ЗГ ¦ЗГ ¦ЧГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦
L------+------+----+----+----+----+---+----+----+----+----+----
Титром комплемента в бактериолитической системе считают его
минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в
пробирках с негативной сывороткой или позитивной сывороткой без
антигена в течение 20 мин. в водяной бане приС.
Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки
штатива из бани.
В примере, приведенном в таблице 1, титр комплемента в
баксистеме равен 0,1. Рабочий титр комплемента для главного опыта
на 0,02 больше, т. е. 0,12.
Схема титрования комплемента в гемолитической системе
приведена в таблице 1 Приложения N 2.
Титром комплемента в гемолитической системе считают его
минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в
течение 10 мин. в водяной бане приС.
В приведенном примере титр комплемента в гемолитической
системе равен 0,08. Рабочий титр комплемента для главного опыта на
0,04 больше, т. е. 0,12.
Количество комплемента, необходимого для проведения главного
опыта, рассчитывают по формуле:
А х В
Х = -----,
20
где:
Х - количество комплемента;
А - рабочий титр комплемента;
В - количество пробирок в опыте;
20 - исходное разведение комплемента (1:20).
0,12 х 100
Пример: Х = = 0,6.
20
Так как количество комплемента в рабочем разведении,
требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 мл (0,2 х
100), то к 0,6 мл нативного комплемента следует добавить 19,4 мл
физиологического раствора.
4.3.4. Проведение главного опыта
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с
антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность
сывороток), при массовом исследовании реакцию проводят в одной
пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. таблицу 2).
Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:
- при исследовании в одной пробирке к 0,05 мл испытуемой
сыворотки добавляют 0,2 мл физиологического раствора (разведение
1:5);
- при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1
мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,4 мл физиологического
раствора (разведение 1:5) и смешивают. Из первой пробирки берут
0,3 мл, переносят 0,2 мл во вторую пробирку и 0,1 мл - в третью, в
которую затем добавляют 0,1 мл физиологического раствора
(разведение 1:10).
Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке,
указанном в подпункте 4.3.2.
Сыворотку, физиологический раствор и другие компоненты реакции
вносят при помощи индивидуальных пипеток (дозаторов) или аппарата
Флоренского и др.
Реакцию проводят по схеме главного опыта (см. таблицу 2).
Таблица 2
СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РСК
T----T-------
¦ Компоненты ¦ При массовом ¦ При повторном исследовании ¦
¦ реакции ¦ исследовании ¦(разведение в трех пробирках)¦
¦ ¦ (разведение в ¦ ¦
¦ ¦одной пробирке)¦ ¦
¦ +----+TT+
¦ ¦ 1 (1:5) ¦ 1 (1:5) ¦ 2 (1:5) ¦3 (1:10)¦
+-------+----++++
¦Испытуемая ¦ ¦ ----+----T-----+---> ¦
¦сыворотка ¦ ¦ /\ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ \/ ¦ ¦
¦ ¦0,05 ¦0,1 ¦0,2 ¦0,1 ¦
+-------+----+--- 0,5 -+++
¦Физиологический ¦0,2 ¦0,4 ¦- ¦0,1 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ водяная баня 30 мин. приС ¦
+-------T----TTT+
¦Физиологический ¦- ¦0,2 ¦- ¦- ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦Антиген в рабочем ¦0,2 ¦- ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦Комплемент в ра - ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦бочем разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
+-------T----TTT+
¦Гемолитическая ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦
¦система ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
L
Примечание. Допускается смешивание равных объемов рабочих
разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением
в пробирки.
Главный опыт сопровождается следующими контролями:
- негативной и позитивной бруцеллезной сывороток в разведении
1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного
опыта);
- гемолитической системы (0,4 мл гемолитической системы и 0,6
мл физиологического раствора);
- комплемента (0,2 мл комплемента в рабочем разведении; 0,4 мл
физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы);
- антигена (0,2 мл антигена в рабочем разведении; 0,4 мл
физраствора и 0,4 мл гемолитической системы).
4.3.5. Постановка реакции длительного связывания комплемента
(РДСК)
Реакцию длительного связывания комплемента на холоде проводят
в серологических пробирках. Сыворотку, антиген и комплемент вносят
по 0,2 мл, гемолитическую систему - в оттитрованной рабочей дозе.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПОСТАНОВКИ РДСК
-------T--
¦Первый¦Розлив испытуемых и контрольных сывороток для главного ¦
¦день ¦опыта и для титрования гемолитической системы. ¦
¦ ¦Инактивирование сывороток. ¦
¦ ¦Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и ¦
¦ ¦гемотоксичность (по схеме 4.3.2). ¦
¦ ¦Розлив антигена и комплемента. ¦
¦ ¦Приготовление гемолитической системы. ¦
¦ ¦Выдерживание пробирок главного опыта, титрации ¦
¦ ¦гемсистемы и гемсистемы в холодильнике ¦
+------+--+
¦Второй¦Выдерживание пробирок главного опыта, титрации гемсистемы¦
¦день ¦и гемолитической системы при комнатной температуре 20 ¦
¦ ¦минут. ¦
¦ ¦Титрование гемолитической системы. ¦
¦ ¦Главный опыт. Розлив гемолитической системы в пробирки с ¦
¦ ¦исследуемыми сыворотками. Водяная баня. ¦
¦ ¦Учет и оценка результатов реакции ¦
L------+---
Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с
антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность
сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной
пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. табл. 6).
Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической
системы. Разведения сывороток готовят, как указано в подпункте
4.3.3. Инактивирование разведенных сывороток крови проводят, как
указано в подпункте 4.3.2, гемсистему готовят по п. 4.3.2.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при
титре 0,06 - 0,1 или 1:20 - 1:15 при титре 0,1 - 0,14, указанном
на этикетке коробки с препаратом, изготовленным биопредприятием.
Если титр комплемента неизвестен или используется сыворотка крови
морской свинки, то титр определяют в гемсистеме и разводят, как
указано выше.
Перед внесением гемолитической системы в пробирки с
исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической
системы на сыворотке из опыта (свежей или консервированной) по
схеме, приведенной в таблице 3.
Таблица 3
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
---TT------
¦ Компоненты ¦ Ряд ¦ Номера пробирок ¦
¦ реакции ¦ пробирок +---T---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦ ¦ в штативе¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Сыворотка ¦первый ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦из опыта в ¦второй ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦1:5 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦ водяная баня 30 мин. приС ¦
+--TT---T---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦Физиологи - ¦первый ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦
¦ческий рас - ¦второй ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦твор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Антиген в ¦первый ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦рабочем раз - ¦второй ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦- ¦
¦ведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Комплемент в ¦первый ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦рабочем раз - ¦второй ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
¦ведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦ холодильникч при С ¦
+--TT---T---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦Гемолитичес - ¦первый ¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦1,0¦
¦кая система ¦второй ¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦1,0¦
+--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
+--TT---T---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦Примерный ¦первый ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ЗГ ¦НГ ¦НГ ¦
¦результат ¦второй ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ПГ ¦ЗГ ¦ЗГ ¦НГ ¦
L--++---+---+---+---+---+---+---+---+---+----
Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки
штатива из бани.
Титром гемолитической системы считают наибольшее ее
количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах
пробирок с негативной сывороткой или в безантигенном ряду, если
исследуемая сыворотка оказалась позитивной. Рабочая доза на один
интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0,7 мл
рабочая доза - 0,6 мл).
Внесение компонентов и последовательность постановки реакции
проводят по схеме, указанной в таблице 4.
Таблица 4
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РДСК
T----T-------
¦ Компоненты ¦ При массовом ¦ При повторном исследовании ¦
¦ реакции ¦ исследовании ¦(разведение в трех пробирках)¦
¦ ¦ (разведение в ¦ ¦
¦ ¦одной пробирке)¦ ¦
¦ +----+TT+
¦ ¦ 1 (1:5) ¦ 1 (1:5) ¦ 2 (1:5) ¦3 (1:10)¦
+-------+----++++
¦Испытуемая ¦ ¦ ----+----T-----+---> ¦
¦сыворотка ¦ ¦ /\ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ \/ ¦ ¦
¦ ¦0,05 ¦0,1 ¦0,2 ¦0,1 ¦
+-------+----+--- 0,5 -+++
¦Физиологический ¦0,2 ¦0,4 ¦- ¦0,1 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ водяная баня 30 мин. приС ¦
+-------T----TTT+
¦Физиологический ¦- ¦0,2 ¦- ¦- ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦Антиген в рабочем ¦0,2 ¦- ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦Комплемент в ра - ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦бочем разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ холодильник Сч и 20 мин. ¦
¦ при комнатной температуре ¦
+-------T----TTT+
¦Гемолитическая ¦0,6 ¦0,6 ¦0,6 ¦0,6 ¦
¦система в рабочей ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦дозе ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------+----++++
¦ водяная баня 20 мин. приС ¦
L
Контроли реакции:
- негативная и позитивная бруцеллезная сыворотки в разведении
1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного
опыта);
- гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки,
антигена и комплемента (0,6 мл гемсистемы и 0,6 мл физраствора);
- антиген без сыворотки и комплемента (0,2 мл антигена в
рабочем разведении; 0,4 мл физраствора и 0,6 мл гемсистемы).
4.3.6. Учет результатов в РСК и РДСК
Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного
связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции
в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один
раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При
исследовании в трех пробирках - через 3 - 4 ч, когда в контрольных
пробах с позитивной бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на
дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с
пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).
Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость
прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;
+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75%
эритроцитов;
++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50%
эритроцитов;
+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;
- (минус) - гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов
отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по
шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции
выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в
одну.
Из этой жидкости готовят разведение с меньшим процентом
гемолиза по следующей схеме:
-------TTTTT
¦ Номера пробирок ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+------++++++
¦Гемолизированная ¦1,0 ¦0,75 ¦0,5 ¦0,25 ¦- ¦
¦жидкость ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------++++++
¦Физиологический ¦- ¦0,25 ¦0,5 ¦0,75 ¦1,0 ¦
¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------++++++
¦Процент гемолиза ¦100 ¦75 ¦50 ¦25 ¦0 ¦
+------++++++
¦Оценка в крестах ¦- ¦+ ¦++ ¦+++ ¦++++ ¦
L------+++++
Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми
сыворотками определяют путем сравнения со шкалой и выражают в
крестах.
4.3.7. Диагностическая оценка РСК и РДСК
Реакцию считают:
- положительной - при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в
одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном
гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
- сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест
в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе
эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
- отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в двух
(трех) пробирках.
В благополучных по бруцеллезу хозяйствах при получении
сомнительного результата сыворотки крови этих животных исследуют
повторно черезсут. Животных, сыворотки крови которых дали
дважды сомнительную РСК (РДСК), считают реагирующими отрицательно.
В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах при получении
дважды сомнительного результата в РСК (РДСК) животных считают
реагирующими положительно.
В благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота,
ранее вакцинированного против бруцеллеза, животных, реагирующих
положительно только в РСК (РДСК) в разведении сыворотки не выше
1:10, считают реагирующими сомнительно и проводят повторные
исследования черезсут. При повышении титра заболевание
считают установленным. В случае сохранения титра в РСК (РДСК) на
прежнем уровне, животных считают здоровыми, а хозяйство -
благополучным по данному заболеванию.
4.4. Постановка и учет реакции иммунодиффузии (РИД) с
0-полисахаридным антигеном
4.4.1. Реакция иммунодиффузии (РИД) с 0-полисахаридным
антигеном (0-ПС антиген) основана на выявлении специфических
антител, синтезирующихся в организме животных, инфицированных
возбудителем бруцеллеза.
4.4.2. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике
бруцеллеза крупного рогатого скота
4.4.2.1. В благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота
хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:
- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);
- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно
реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных
родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.
4.4.2.2. В благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота
хозяйствах, где проводится иммунизация животных агглютиногенными
противобруцеллезными вакцинами:
- при плановых исследованиях животных одновременно с РА (РА и
РИД);
- при контроле эпизоотического состояния животных по
бруцеллезу, но не ранее, чем через 1,5 мес. после вакцинации;
- для дифференциации реакций, полученных в РА (не выше 200 МЕ)
или (и) РСК (РДСК) не выше, чем в разведении 1:10.
4.4.2.3. В неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого
скота хозяйствах:
- через 1,5 мес. после иммунизации или очередной реиммунизации
противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами с целью раннего
выявления больных бруцеллезом животных;
- для более полного выявления инфицированных животных,
особенно среди телок и нетелей, целесообразно проведение 2 -
4-кратных исследований сыворотки крови животных в течение первых 6
месяцев после иммунизации (реиммунизации);
- через 6 месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных
для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе реакций,
предусмотренных нормативными документами по профилактике и борьбе
с бруцеллезом;
- при снятии с хозяйств ограничений по бруцеллезу одновременно
с РА, РСК (РДСК) и другими реакциями, утвержденными в
установленном порядке.
4.4.3. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике
бруцеллеза северных оленей
4.4.3.1. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где
противобруцеллезные вакцины не применяют:
- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);
- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно
реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных
родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.
4.4.3.2. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где
животных иммунизируют против бруцеллеза агглютиногенными
вакцинами:
- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД) для
оценки эпизоотического состояния по бруцеллезу не ранее чем через
2 мес. после иммунизации;
- для исследования сыворотки крови животных, сомнительно
реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных
родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.
4.4.3.3. В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах:
- с целью более раннего выявления больных бруцеллезом
животных, но не ранее чем через 2 мес. после иммунизации против
бруцеллеза агглютиногенными вакцинами;
- при снятии ограничений с хозяйства одновременно с РА, РСК
(РДСК) и другими реакциями, утвержденными в установленном порядке.
4.4.4. Применение РИД с 0-ПС антигеном при диагностике
бруцеллеза овец и коз
4.4.4.1. В благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота
хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:
- при плановых исследованиях одновременно с РА (РА и РИД);
- при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно
реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных
родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.
4.4.4.2. В благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота
хозяйствах, где проводится иммунизация животных
противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:
- для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не
ранее чем через 5 мес., только после однократной их иммунизации
противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
- для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных
родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями.
4.4.4.3. В неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого
скота хозяйствах:
- с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных
не ранее чем через 5 мес., только после однократной иммунизации
противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
- при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу
хозяйств одновременно с РА, РСК (РДСК) и другими реакциями,
утвержденными в установленном порядке.
4.4.5. Компоненты реакции
4.4.5.1. Для постановки РИД применяется тест-система, основой
которой является 0-ПС антиген.
4.4.5.2. В состав тест-системы входит:
- 0-ПС антиген;
- контрольная положительная сыворотка;
- хлорид натрия;
- микробиологический агар.
4.4.5.3. Подготовка тест-системы к постановке реакции.
Приготовление 10% раствора хлорида натрия. Содержимое пакета с
NaCl растворяют в 700 мл дистиллированной воды.
Приготовление 0,8%-ного раствора агара. Навеску агара
переносят из флакона в колбу с 700 мл 10%-ного раствора хлорида
натрия и помещают в кипящую водяную баню. После расплавления агара
содержимое колбы фильтруют через ватный фильтр. Приготовленный
агар можно хранить при температуре С в течение 14 сут.
Приготовление геля для реакции иммунодиффузии. Отфильтрованный
раствор агара расплавляют и разливают в чашки Петри, на
поверхность стеклянных предметных стекол, стеклянных пластинок,
помещенных на горизонтальный столик (в чашки Петри толщиной слоя
не менее 2 мм); на предметное стекло - 2,5 мл; на стеклянную
пластину размером 6 х 9 см - 12,5 мл. После застывания геля в нем
штампом пробивают лунки: центральную диаметром 3 мм и по
окружности 6 лунок диаметром по 5 мм. Агаровый гель из лунок
удаляют с помощью вакуумного насоса или препаровальной иглы.
Для исследования используют сыворотки крови животных
неконсервированные или консервированные (см. п. 2.3.1). Мутные,
проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию в РИД не
подлежат.
4.4.5.4. Постановка реакции
Реакцию иммунодиффузии выполняют в чашках Петри или на
стеклянных пластинках различных размеров, в зависимости от
количества проб. Для исследования проб используют чашки
Петри; до 11 - предметные стекла; до 35 - пластинки размером 6 х 9
см; при большом количестве исследуемых проб можно использовать
стекла большего размера.
В центральную лунку вносят 20 мкл 0-ПС антигена, а в
периферические - по 40 мкл исследуемых сывороток крови.
На каждой пластинке (стекле) или чашке Петри ставят контроль с
положительной сывороткой.
Стекла (чашки Петри) после внесения компонентов помещают во
влажную камеру (эксикатор) приС.
4.4.5.5. Учет результатов
Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с
помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после
постановки реакции.
Линия преципитации между лунками с антигеном и исследуемой
сывороткой, сформировавшаяся через 24 ч, свидетельствует о
положительной реакции.
Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч,
подлежат перестановке.
Линия преципитации, сформировавшаяся через 24 или 48 ч при
перестановке, свидетельствует о положительной реакции.
4.4.5.6. Оценка реакции
При получении положительной РИД животное признают больным
бруцеллезом.
4.5. Постановка и учет результатов пластинчатой реакции
агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (роз бенгал проба
или РБП)
4.5.1. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз
бенгал антигеном (РБП) применяют как экспресс-метод диагностики
бруцеллеза у не иммунизированного противобруцеллезными вакцинами
крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, лошадей и северных
оленей (маралов).
4.5.2. Компоненты РБП:
- испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
- антиген, окрашенный бенгальским розовым (роз бенгал антиген)
(см. Прил. N 2, п. 6);
- позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;
- 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор (см. Прил.
N 2, п. 1).
4.5.3. Постановка РБП
Для массовых диагностических исследований используют "Комплект
инструментов и приспособлений для проведения серологических
исследований на бруцеллез сыворотки крови животных" (КИ),
выпускающийся отечественной промышленностью. В состав КИ входят:
- шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
