Связь полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем цитогенетических нарушений у рабочих уранового производства

Ж1., 2, 2, 1

СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ GSTM1 и GSTT1 С УРОВНЕМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У РАБОЧИХ УРАНОВОГО ПРОИЗВОДСТВА

Исследована связь полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем хромосомных аберраций у рабочих Целинного горно-химического комбината, которые в результате профессиональной деятельности в течение 1-25 лет контактировали с производными урана. В исследованных группах рабочих наблюдалось достоверное, по сравнению с контролем (р<0,001), увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет – парных ацентрических фрагментов и одиночных фрагментов. Не выявлено взаимосвязи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с уровнем цитогенетических нарушений.

В процессе профессиональной деятельности человек подвергается воздействию различных антропогенных факторов, как химической, так и физической природы. Ключевая роль в метаболизме поступающих извне соединений принадлежит системе детоксикации ксенобиотиков. Вариации в активности ферментов детоксикации и индивидуальная чувствительность к воздействию токсических агентов обусловлена полиморфизмом генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Установлено, что экспрессия полиморфных вариантов этого семейства генов непосредственно регулируется влияниями средовых факторов химической природы [1]. Полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 является одним из факторов, влияющих на частоту хромосомных аберраций при воздействии пестицидов, табачного дыма, ароматических углеводородов и т. д., при этом «нулевой» генотип GSTM1 обусловливает увеличение частоты аберраций хроматидного типа, а полная делеция по обоим генам: GSTM1 и GSTT1, ассоциируется с повышением частоты аберраций хромосомного типа [2]. Изучение влияния генных полиморфизмов на уровень хромосомных повреждений в когортах лиц, подвергающихся хроническому воздействию ионизирующего излучения может увеличить чувствительность цитогенетических показателей как биомаркеров генотоксического воздействия, а также помочь в идентификации групп риска. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение роли полиморфизма генов глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) в индивидуальном цитогенетическом ответе на хроническое воздействие ионизирующей радиации.

Материалы и методы

Обследуемая группа состояла из 100 рабочих Целинного горно-химического комбината (ЦГХК) в г. Степногорск, Северного Казахстана, которые в процессе профессиональной деятельности контактировали с производными урана в течение 1-25 лет. В зависимости от профессионального стажа группа рабочих была разделена на 2 подгруппы: со стажем работы от 1 до 12,5 лет (50 человек); и со стажем работы – от 12,5 до 25 лет (50 человек). Контрольную группу составили 56 жителей Джамбулского района Алматинской области. Перед взятием биопроб крови, совместно с медицинскими работниками проводили анкетирование когорт, регистрируя: возраст, пол, профессиональный стаж, наличие заболеваний.

Никто из представителей контрольной группы не подвергался терапевтическому облучению, не имел профессионального контакта с химическими и радиоактивными веществами. Контрольная и экспонированная группа были выравнены по возрасту (+/- 5 лет); полу; национальности; в обеих группах не было зарегистрировано серьезных заболеваний.

Пробы крови забирали из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином для цитогенетического анализа и с ЭДТА - для молекулярно-генетического. Пробирки в специальном контейнере, при температуре +4-6ОС, транспортировали для анализа в диагностическую лабораторию в течение 10 час. Культивирование лимфоцитов проводили по стандартной методике [3]. К 200 мкл гепаринизированной крови добавляли 6,13 мл среды RPMI (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,61 мл сыворотки крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co., St. Loius, USA), 0,06 мл пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK), 0,12 мл глутамина (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и 0,07 мл ФГА (Sigma-Aldrich Co., Irvine, UK) и инкубировали в термостате при 370С в течение 72 час. Колцемид в конечной концентрации 0,01мкг/мл (Gibco, New-York, USA) добавляли за 2 часа до снятия культуры. Через 72 часа культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,075 М КСL в течение 10 мин, трижды фиксировали в смеси метанол-ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 3:1. Готовую суспензию клеток наносили на чистые охлажденные и влажные стекла. Высохшие мазки окрашивали 6% красителем Романовского-Гимза в течение 10 мин. Анализ хромосом производили с помощью светового микроскопа фирмы “Leica” (Germany), при суммарном увеличении х 1000.

Геномные мутации (анеуплоидия, полиплоидия) не учитывали, поскольку наиболее информативным показателем влияния мутагенов среды являются хромосомные аберрации. Пробелы (гэпы) в число аберраций не включали. Регистрировали все типы хромосомных аберраций, доступные для анализа при равномерном окрашивании хромосом (дицентрики, центрические кольца, парные и одиночные фрагменты). При микроскопическом исследовании метафазных пластинок придерживались критерия отбора и анализа препаратов, изложенных в работах и др. и и др.[3,4]. Всего было проанализировано 31200 метафазных пластинок. Для каждого человека анализировали по 200 метафаз. Хромосомный анализ проводили на зашифрованных препаратах методом “слепого контроля”.

Выделение ДНК из клеток крови проводили стандартным методом с фенол-хлороформной очисткой. Молекулярно-генетический анализ был проведен в США (Department of Preventive Medicine and Community Health, The University of Texas Medical Branch, Galveston). Генотипирование для генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР, используя соответствующие праймеры:

GSTM1: 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C

5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G;

GSTT1: 5’-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC

5’- TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA.

Электорофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Гомозиготность по «нулевым» аллелям генов GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию специфических фрагментов размером 480 п. н. (для GSTT1) и 215 п. н. (для GSTM1).

Полученные результаты обрабатывали традиционными методами вариационной статистики [5]. Достоверность различий определяли, используя t - критерий Стьюдента, метод c2, дисперсионный анализ.

Результаты и обсуждение

Цитогенетическая характеристика обследованных групп

Результаты цитогенетического обследования групп представлены в таблице 1. Всего в экспонированной группе обнаружено 508 хромосомных аберраций, т. е. аберрации встречались с частотой 2,54±0,11%. Подавляющее большинство составляли парные ацентрические фрагменты – 387 (1,93±0,09%). Частота одиночных фрагментов составила 0,29±0,03%. Также были выявлены нестабильные хромосомные обмены (НХО) (0,31±0,04%), среди которых было 47 дицентриков и 16 центрических колец.

В первой и второй группах рабочих, имеющих профессиональный стаж от 1 до 12,5 лет и от 12,5 до 25 лет, соответственно, выявлено увеличение частоты хромосомных аберраций, в основном за счет парных ацентрических фрагментов. Уровень НХО в первой группе оказался выше, чем во второй. По-видимому, уменьшение количества НХО связано с длительным культивированием (72 часа), которое было предпринято с целью сохранения материала, вследствие длительной транспортировки крови. Выявлена тенденция к увеличению цитогенетических нарушений у рабочих, имевших более длительный профессиональный стаж. Обнаружены достоверные различия по частоте хромосомных аберраций между двумя экспонированными группами и контролем (р<0,001).

При обследовании контрольной группы среднегрупповая частота клеток с аберрациями составила 0,56±0,07%, из них доля НХО составляла 0,17±0,04%, парных фрагментов - 0,39±0,05%, одиночных фрагментов – 0,06±0,02%. Полученные нами результаты по частоте хромосомных аберраций в контрольной группе согласуются с аналогичными данными других исследователей [6-8]. Авторами было показано, что при обследовании 437 взрослых здоровых жителей г. Москвы, (проанализировано более 70 тысяч клеток), частота спонтанных хромосомных аберраций в культивированных лимфоцитах периферической крови человека составила 1,16%, при этом выявленные нарушения хроматидного типа, в основном одиночные фрагменты, составили более 50% всех аберраций [6]. Согласно данным Снигиревой с сотр., при цитогенетическом анализе 48124 метафаз от здоровых доноров доля НХО составила 0,02% [7]. В аналогичной работе других авторов, было обнаружено 36 НХО из 51893 проанализированных метафаз, что составило 0,07% [8]. Опираясь на эти результаты можно утверждать, что колебания частоты спонтанных аберраций хромосом у здоровых доноров, не подвергавшихся прямому радиационному воздействию, находятся в пределах 1-2%.

Известно, что в горнодобывающей промышленности, в частности, урановой, рабочие подвергаются хроническому влиянию ионизирующей радиации, в основном за счет радона и его дочерних короткоживущих продуктов [9]. Выявленное нами увеличение хромосомных нарушений у профессиональных рабочих подтверждается данными других исследователей, показавших, что у шахтеров уранодобывающих предприятий наблюдалось увеличение клеток с хромосомными аберрациями по сравнению с контролем [10,11,12]. Также показано, что увеличение числа аберрантных клеток по сравнению с контролем наблюдалось не только у лиц, занятых на переработке и добыче урана, но и у населения, проживающего вблизи уранодобывающих предприятий [13].

Таким образом, опираясь на наши собственные данные и результаты исследований других авторов можно заключить, что воздействие производственных факторов уранового производства на рабочих вызывает генотоксический эффект, выражающийся в увеличении частоты хромосомных аберраций. Цитогенетический анализ показал как увеличение частоты аберраций хромосомного типа – парных ацентрических фрагментов, дицентрических хромосом и центрических колец, являющихся известными маркерами радиационного воздействия, так и аберраций хроматидного типа – одиночных фрагментов, образование которых может быть вызвано комбинированным воздействием радиации и химических мутагенов.

Связь цитогенетических показателей с генотипом

Глутатион-S-трансферазы (GSTs) — полигенное суперсемейство изоферментов, включающее 7 семейств: α, μ, π1, σ, q, κ, ξ [14]. Синтез глутатион-S-трансфераз контролируется различными генами, в которых выявлены полиморфизмы, приводящие к изменению активности фермента. Наибольший интерес представляют члены семейств μ и q. Известно, что члены семейства μ (GSTM) - GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4, GSTM5, GSTM6, локализованы на хромосоме 1р13 [15]. Для гена GSTM1 установлены две мутации: точковая замена, не имеющая функциональных проявлений [16], и протяженная делеция гена (10 т. п.н.), которая приводит к полному отсутствию синтеза белкового продукта [17]. Член семейства q - ген GSTT1 локализован на хромосоме 22q11.2. Полиморфизм этого гена, обусловлен наличием двух аллелей — функционально активной (GSTT1*1) и неактивной (GSTT1*0) (нулевой). Аллель GSTT1*0 соответствует частичной или полной делеции, приводящей к снижению или отсутствию ферментативной активности [18].

Результаты генотипирования полиморфизма генов (GSTT1 и GSTM1) у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе представлены в таблице 2. Гены GSTT1 и GSTM1 анализировались на наличие или отсутствие делеции, т. е. «+/+» - нормальная аллель гена, наличие делеции по одному гену «+/-», «-/+»соответственно, «-/-» - полная делеция. Частоты гомозигот по делециям генов GSTT1 и GSTM1 среди рабочих составили 19% и 62%, соответственно. Полная делеция по двум генам GSTМ1 и GSTТ1 была выявлена у 8% рабочих. Полученные нами результаты по распространенности нулевого генотипа GSTT1 и GSTM1 согласуются с аналогичными литературными данными [4, 5].

В таблице 3 приведены результаты по связи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с цитогенетическими нарушениями (хромосомные аберрации) у обследованных лиц. Из полученных данных видно, что для отдельно взятых «плюсовых» и «минусовых» локусов генов GSTM1 и GSTT1, не было выявлено достоверно значимых различий по частоте хромосомных аберраций. Вместе с тем, у индивидуумов, как с делецией по отдельно взятым локусам этих генов, так и с полной делецией по двум генам GSTM1 и GSTT1, наблюдалась тенденция к увеличению частоты хромосомных аберраций, однако эти различия не достоверны. Результаты, полученные нами, согласуются с данными других авторов. В научном исследовании, проведенном совместно несколькими европейскими лабораториями (Италия, Норвегия, Дания, Финляндия), по взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций, риском рака и генетическом полиморфизмом GSTM1 и GSTT1, не было установлено ассоциации между полиморфизмом генов (GSTM1 и GSTT1) и уровнем хромосомных аберраций, однако была выявлена зависимость между хромосомными нарушениями и риском рака [19]. В работе Сальниковой с соавторами также не выявлено взаимосвязи между частотой хромосомных аберраций с генотипами по отдельно взятым локусам (GSTM1, GSTT1, GSTP1 и MTHFR) у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС [20].

Известно, что многие химические вещества, как эндогенные, так и поступающие из окружающей среды, обладают способностью усиливать синтез ферментов биотрансформации ксенобиотиков, что существенным образом определяет чувствительность организма к действию токсикантов. К числу сильных индукторов ферментов принадлежат и многие промышленные яды. Установлено, что индукция происходит за счет повторного попадания соединения в организм. Добыча и переработка урановой руды сопряжена с комбинированным воздействием на контингент профессиональных рабочих ряда потенциально вредных факторов: 1) радиоактивных элементов (урана, радия, тория и др.), входящих в виде аэрозолей в состав пылевой фракции воздуха; 2) радиоактивных газов радона и торона с дочерними продуктами распада; 3) внешнего g - и b-излучения урановой руды; 4) технологическим применением в урановом производстве активных реагентов с токсическими свойствами (паров кислот и щелочей) и присутствующих в руде химических соединений (пятиокиси фосфора, свободной двуокиси кремния, свинца, мышьяка и др.), многие из которых являются канцерогенами [9]. Таким образом, в результате хронического воздействия выше перечисленных соединений уранового производства происходит, по-видимому, постоянная индукция фермента глютатионтрансфераза, что приводит к истощению запаса глютатиона в клетках. Показано, что при поступлении токсикантов, в организме одновременно протекают процессы детоксикации и репарации. При однократном поступлении данных соединений в организм, интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов, однако при повторном воздействии, защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что приведет к развитию токсического процесса. Возможно, вследствие перечисленных выше причин, не обнаружено различия по частоте хромосомных аберраций между индивидуумами имеющими «плюсовой» и «минусовой» генотипы (таблица 3).

Авторы выражают глубокую признательность профессору У. Ау за предоставление результатов генотипического анализа, а также и за помощь в культивировании лимфоцитов.

Научно-исследовательская работа проведена в рамках Международного гранта - «Мониторинг населения Северного Казахстана, проживающего вокруг урановых рудников» Грант CRDF КВ2-2289 (США).

Таблица 1. Частота хромосомных аберраций у рабочих Целинного

горно-химического комбината и в контрольной группе

Группа	Количество метафаз (человек)	Количество аберраций, %	НХО (дицентрики + центр. кольца), %	Парные фрагменты, %	Одиночные фрагменты, %
I	10000(50)	2,41±0,15а-***	0,36 ±0,06	1,79±0,13 а-**	0,26±0,05 а-**
II	10	2,67±0,16 а-***	0,27±0,06	2,08±0,14 а-**	0,32±0,05 а-**
Всего	20	2,54±0,11 а-***	0,31±0,04	1,93 ± 0,09а-**	0,29±0,03 а-**
Контроль	11	0,56±0,07	0,17±0,04	0,39±0,05	0,06±0,02

Примечание: а - отличие от контрольной группы,** - p< 0,01; *** - p< 0,001

Таблица 2. Частоты генотипов GSTM1 и GSTT1 у рабочих Целинного

горно-химического комбината и в контрольной группе

Генотип	Локус	Рабочие ЦГХК, %	Контроль, %
GSTМ1	+/+	38	59
-/-	62	41
GSTT1	+/+	81	73
-/-	19	27

Таблица 3. Распределение хромосомных аберраций в зависимости от генотипа (GSTM1 и GSTT1)

у рабочих Целинного горно-химического комбината и в контрольной группе

Локус	Генотип	I группа (стаж 1-12,5 лет, n=50)	II группа (стаж 12,5-25 лет, n=50)	Контроль (n=56)
Количество метафаз (людей)	Количество аберраций	Частота аберраций	Количество метафаз (людей)	Количество аберраций	Частота аберраций	Количество метафаз (людей)	Количество аберраций	Частота аберраций
GSTM1	+	4	88	2,10±0,22	3	70	2,05±0,24	6600	36	0,54±0,08
-	5	127	2,20±0,19	6	163	2,47±0,19	4600	20	0,43±0,09
GSTT1	+	7	157	2,01±0,16	8	185	2,20±0,16	8200	44	0,53±0,07
-	2	58	2,63±0,34	1	48	3,00±0,43	3000	12	0,4±0,07
GSTM1 / GSTT1	-/ -	1	32	3,20±0,56		22	3,60±0,77	1600	4	0,25±0,01
+/ -	1	26	2,16±0,42	1000	26	2,60±0,50	1400	8	0,57±0,02
-/ +	4	95	1,97±0,20	6000	141	2,35±0,19	3000	16	0,53±0,01
+ /+	3	62	2.06±0,26	2400	44	1,83±0,27	5200	28	0,53±0,09

Таблица 4. Распределение хромосомных аберраций в зависимости

от генотипа (GSTM1 и GSTT1) по квартилям

Локус	Генотип	I квартиль	II квартиль	III квартиль	IV квартиль
N (человек)	Частота аберраций	N (человек)	Частота аберраций	N (человек)	Частота аберраций	N (человек)	Частота аберраций
GSTM1	+	21 4200	0.16±0.06	18 3600	0.80± 0.14	16 3200	1.65± 0.22	16 3200	3.28±0.31
-	18 3600	0.16± 0.06	21 4200	0.85± 0.14	23 4600	1.78± 0.19	23 4600	4.04±0.29
GSTT1	+	28 5600	0.14± 0.05	32 6400	0.84± 0.11	34 6800	1.72± 0.15	28 5600	3.69±0.25
-	11 2200	0.22± 0.09	7 1400	0.78 ±0.23	5 1000	1.80± 0.42	11 2200	3.81±0.40
GSTM1 / GSTT1	-/ -	5 1000	0.10± 0.09	5 1000	0.70± 0.26	1 200	2.5±1.10	5 1000	4.5±0.65
+ /+	15 3000	0.10 ±0.05	16 3200	0.78± 0.15	12 2400	1.60±0.25	10 2000	3.3±0.39

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.  , , Асеев человека и гены «предрасположенности»; Введение в предиктивную медицину. СПб.:Интермедика, 2000.271 с.

2.  Scatpato R., Hirvonen A., Migliore L. et al // Mut. Res. 19Р. 227-235.

3.  , , // Генетика. 1972, Т. 8, № 5, С.133-141.

4.  , , Барановская человека: Атлас. Москва: Медицина. 19с.

5.  Рокицкий в статистическую генетику. Минск: Вышейшая школа. 19с.

6.  , Чеботарев человека и мутагены внешней среды. Москва: Медицина.19с.

7.  CнигиреваГ. П., , // Матер. Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва. 2000. С.331.

8.  , , // Матер. Межд. конф. «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков». Москва.2000.С.259.

9.  , , Корнилов и обогащенный уран. Радиационно-гигиенические аспекты. Москва. Атомиздат. 19с.

10.  , , // Биотехнология. Теория и практика. 2000. № 3-4. С.18-21.

11.  Meszaros G., Bognar G., Koteles G. J. // Journal of occupational health.2004. V.46.P.310-315

12.  Smerhovsky Z, Landa K, Rössner P, Juzova D, Brabec M, Zudova Z, et al.// Mutat Res. 20Р.165-176.

13.  Аu W. W., Lane R. G., Legator M. S., Whorton E. B., Wilkinson G. S., Gabehart G. J. // Environ. Health Persent.1995. № 5. Р.466-470

14.  Landi S. // Mutat. Res. 20P. 247-283.

15.  Pearson W. R., Vorachek W. R., Xu S. J. et al. // Am. J.Human Genet.1993.53.P. 220-233.

16.  De Long J. L., Chang T. M., Whang-Peng J. et al. // Nucleic. Acid Res. 1988. V. 16. P..

17.  Seidegard J., Vorachek W. R., Pero R. W. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988.V. 85.P. .

18.  Pemble S., Schroeder K. R., Spencer S. R. et al. // Biochem J. 1994. V. 300. P. 271-276.

19.  Rossi A. M, Hansteen I-L., Skjelbred C. F., Ballardin M. et al. //Environ. Health. Perspect. 2009. February. 1P.203-208.

20.  , , , . // Радиац. биология. Радиоэкология. 2008. Т.48 №3. С. 303-312.