На правах рукописи
ИВАНУШКИН ПЕТР АЛЕКСАНДРОВИЧ
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА СОЕВОГО БЕЛКА ДЛЯ РАСШИРЕНИЯ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва – 2011
Диссертационная работа выполнена на кафедре «Аналитическая химия»
ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»
Научный руководитель: - доктор технических наук, доцент
Официальные оппоненты: -
доктор технических наук, доцент
,
кандидат технических наук
Ведущая организация:
Московский государственный университет технологий и управления им.
Защита состоится «23» июня 2011 г. в 11 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» Москва, Волоколамское шоссе, ауд. 3-101.
Автореферат размещен на сайте www. *****.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.
Отзывы на автореферат, заверенные печатью учреждения, просим направлять ученому секретарю Совета.
Автореферат разослан «23» мая 2011 г.
Ученый секретарь Совета, к. т.н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одним из приоритетных направлений развития «белой» биотехнологии, как отмечено в проекте «Стратегии развития биотехнологической отрасли Российской Федерации на 2010 – 2020 гг.», является повышение пищевой ценности отечественных продуктов питания. По экспертным оценкам Общества биотехнологов России им. и Союза предприятий биотехнологической отрасли, в настоящее время рацион практически всех групп населения Российской Федерации, в том числе материально-обеспеченных, характеризуется недостаточным содержанием белка, витаминов и незаменимых аминокислот. Дефицит пищевого белка в России оценивается в размере 600 тыс. т.
Восполнение белкового дефицита в рационе населения за счет других источников является важной задачей по сохранению и укреплению здоровья нации.
Среди всех сельскохозяйственных культур по содержанию белка соя занимает второе место в мире после пшеницы, но используется соевый белок для пищевых целей по оценкам ФАО не более, чем на 10%, хотя, как отмечено в документах Всемирной Организации Здравоохранения, соевые белки отличаются уникальным аминокислотным составом, практически не уступающим белкам животного происхождения.
Большой вклад в разработку научных основ и технологии применения растительного белка (в том числе соевого) в пищевых продуктах внесли исследования российских ученых , , , , .
Однако потенциал соевых белков в пищевой промышленности реализован еще не полностью. По оценке консалтингового агентства Market Advice, основное потребление соевых белков приходится на мясную и пищеконцентратную промышленность (производство мясных продуктов, соевого молока и продуктов на его основе, соусов и приправ) и только 15% на другие отрасли. В основном это – хлебопекарная и кондитерская промышленности, а применение соевого белка в сокосодержащих и кисломолочных продуктах, пользующихся большим спросом у населения, очень незначительно. Главным сдерживающим фактором является необходимость получения водорастворимого продукта, содержащего белковые вещества в определенной степени расщепления, который должен при этом обладать и определенными функциональными свойствами, гарантирующими возможность ее применения в рецептурах сокосодержащих и кисломолочных продуктов без ухудшения органолептических и физико-химических показателей качества.
Эти вопросы могут быть решены на основе ферментативной модификации соевой муки, являющейся вторичным продуктом производства соевого масла, путем проведения направленного биокатализа с использованием протеолитических ферментных препаратов, и это определяет актуальность представленной работы.
Цель работы - разработка условий проведения направленного биокатализа для получения продуктов ферментативной модификации соевой муки и технологических решений по их применению в сокосодержащих напитках, кисломолочных продуктах и кормопроизводстве.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
- исследование и сравнительная характеристика некоторых кинетических характеристик ферментных препаратов при гидролизе изолированного соевого белка и соевой обезжиренной муки;
- оптимизация условий получения продуктов ферментативной модификации соевой муки с применением композиции протеолитических ферментных препаратов, имеющих различное происхождение;
- оценка химического состава продуктов ферментативной модификации соевой муки для их применения в составе ряда пищевых продуктов;
- исследование влияния технологических факторов на функциональные свойства продуктов ферментативной модификации соевой муки;
- разработка технологических решений для применения продуктов ферментативной модификации соевой муки в производстве сокосодержащих напитков и кисломолочных продуктов.
- разработка схемы получения кормовой белковой добавки на основе вторичных продуктов получения продуктов ферментативной модификации соевой муки.
Научная новизна. Выявлено влияние условий ферментативного гидролиза белков соевой обезжиренной муки на химический состав полученных продуктов, позволяющие оценить их с точки зрения пищевой и биологической ценности и дана оценка их функциональных свойств для эффективного использования в составе пищевых продуктов.
Получены математические зависимости, позволяющие обосновать состав мультиэнзимных композиций, на основе ферментных препаратов, имеющих различное происхождение и условия направленного ферментативного катализа для повышения степени гидролиза белков обезжиренной соевой муки
Методом SE-HPLC выявлены различия в распределении белка и продуктов его гидролиза по молекулярной массе в продуктах ферментативного гидролиза модельного (ИСБ) и природного субстратов, полученных под действием ферментных препаратов Нейтраза, Флавозим и Бирзим П7 и МЭК на их основе.
На основании проведенных исследований выявлены зависимости, характеризующие влияние предварительной обработки соевой обезжиренной муки растворами, имеющими различное значение рН на содержание низкомолекулярных растворимых веществ и выход белка.
Получены зависимости, характеризующие влияние технологических факторов ограниченного биокатализа (рН и время гидролиза) и способа получения продуктов ферментативной модификации на функциональные свойства.
Получены данные (по составу сахаров, аминокислотному составу, содержанию липидов, белка, изофлавонов и др.), позволяющие охарактеризовать продукты ферментативной модификации соевой муки с точки зрения пищевой и биологической ценности.
Практическая значимость. Предложены технологические решения, позволяющие модифицировать существующую схему получения продуктов ферментативной модификации соевой муки за счет включения стадии ее предварительной обработки, способствующие снижению ЭНРВ и повышению выхода белка в конечном продукте.
Дана оценка химического состава продуктов ферментативной модификации соевой муки, полученных по стандартной и модифицированной схемам.
Разработаны принципиальные технологические схемы производства продуктов ферментативной модификации соевой муки. Определены условия проведения основных стадий технологического процесса. Проведена промышленная апробация и выпуск опытной партии продуктов ферментативной модификации соевой муки в условиях .
Разработаны рецептуры и предложены технологические решения для создания напитков на основе соков, а также низкожирного йогуртового напитка, имеющих повышенную пищевую ценность. Разработан проект нормативной документации на сокосодержащий напиток повышенной пищевой ценности.
В результате производственных испытаний в условиях Солодовпиво» показана возможность повышения пищевой ценности сокосодержащих напитков на основе концентратов соков за счет внесения продуктов ферментативной модификации соевой муки.
Предложена малоотходная технология переработки вторичных продуктов (соевой пасты и соевого экстракта) получения продуктов ферментативной модификации соевой муки в составе пищевых продуктов (йогуртовый напиток) и для получения кормовой белковой добавки на основе дрожжей С. tropicalis.
Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах по утвержденному списку ВАК.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Основное содержание работы изложено на 214 листах машинописного текста, проиллюстрировано 42 рисунками и 40 таблицей. Список литературы включает 267 источников отечественных и зарубежных авторов.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы дан анализ и обобщены современные данные о химическом составе соевых семян и запасных белках сои, о ферментативном гидролизе как перспективном способе переработки соевой муки для применения в пищевой промышленности, сое как источнике белка для создания новых видов пищевых продуктов. Рассмотрены особенности функциональных свойств гидролизатов белка, применяемых в пищевой промышленности.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1.Объекты и методы исследования
В работе использовали муку соевую дезодорированную полуобезжиренную (ГОСТ 3898-56) из генетически немодифицированной сои, выращенной в Казахстане, урожай 2008 г.; молоко пастеризованное с жирностью 0,5 % ТМ «Домик в деревне»; ферментные препараты Бирзим П7 (фирма «Erbsloeh», предоставленные фирмой «Döhler»); Нейтраза, Флавозим и Вискозим L (фирма «Novozymes»); изолированный соевый белок «Майсол» (фирма «Sinoglory Soypro Co., Ltd.»); препараты Fibruline®S20, Fibruline®Instant, а также Фибрулоза® (компания Cosucra); гуммиарабик FIBREGUM™ и добавку EQUACIA™ (компания CNI – Коллоид, Франция); GRINDSTED R SВ 550 А (фирмы «Danisco»); симбиотическую закваску молочнокислых бактерий (МКБ) для йогурта СТБп (ГНУ ВИМИ Россельхозакадемии); культуры С. tropicalis, С. utilis, С. maltosa, Saccharomyces cerevisiae (из коллекции кафедры «Биотехнология» МГУПП).
Протеолитическую активность ферментных препаратов определяли по методу Ансона в модификации Рухлядевой, амилолитическую – по методу Рухлядевой и Горячевой. Определение аминного азота в гидролизате проводили методом формольного титрования.
Общий белок определяли методом Кьельдаля, растворимый белок – методом Лоури, фракционный состав белка - методом SE-HPLC. Содержание свободных аминокислот в продуктах гидролиза соевой муки проводили методом ВЭЖХ.
Общий сахар определяли дихроматным методом, редуцирующие сахара - методом Шорля, содержание общих углеводов и растворимых углеводов - антроновым методом. Определение содержания крахмала методом Эверса. Состав углеводов в гидролизатах анализировали по ГОСТ Р 4.1.1672-03 с использованием метода ВЭЖХ.
Содержание массовой доли влаги определяли стандартным методом высушивания до постоянной массы. Определение зольности (минерального состава) проводили методом сухого озоления. Содержание сухих веществ (СВ) в гидролизатах определяли измерением показателя преломления на рефрактометре. Содержание клетчатки (целлюлозы) определяли методом Кюшнера и Ганека. Определение лигнина проводили удалением «нелигниновых» компонентов гидролизом концентрированными кислотами с учётом по массе остатка. Определение пектиновых веществ - по пектату кальция. Содержание жира определяли ускоренным экстракционно-весовым методом по ГОСТ 15113.9-77. Определение состава жирных кислот проводили методом газовой капиллярной хроматографии по ГОСТ Р .
Растворимость белков соевой муки в зависимости от рН определяли методом Кальдерона. Индекс растворимости сухих белковых продуктов водоудерживающую способность (ВУС), жироудерживающую способность (ЖУС), пенообразующую способность (ПОС) при различных рН определяли по модифицированной методике Дисли и Шериана. Стабильность пены (СП) измеряли в течение исследуемого периода времени в процентах к исходной высоте пены. Определение эмульгирующей способности (ЭС) выражали через индекс эмульгирующей способности модифицированным турбидиметрическим методом.
Определение кислотности по Тёрнеру и степени синерезиса кисломолочных напитков проводили по ГОСТ 3626-84.
Содержание общего азота по Несслеру определяли стандартным методом. Определение содержания массовой доли влаги методом высушивания до постоянной массы. Определение общего фосфора по методу Бриггса. Определение титра дрожжевой суспензии в камере Горяева.
Определение микробиологических показателей проводили по стандартным методикам в соответствии с правилами и нормами СанПиН 2.3
Обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики. Все опыты проводили не менее, чем в трех повторностях. Математическое планирование и обработку экспериментальных данных осуществляли методом центрального униформ – ротатабельного планирования с последующей графической интерпретацией параметров оптимизации с помощью программ Excel, MatStat и Statistica.
2.2. Разработка условий направленного биокатализа для получения продуктов ферментативной модификации соевой муки
Для ферментативной модификации соевой обезжиренной муки были выбраны ФП бактериального (Нейтраза, Бирзим П7) и грибного происхождения (Флавозим), которые различаются субстратной специфичностью и эффективностью ферментативного гидролиза.
В результате исследования кинетики действия ФП на модельном субстрате в условиях изолированного соевого белка (ИСБ) установлено, что все могут быть использованы с достаточной степенью эффективности для гидролиза соевого белка.
При протеолизе мучной суспензии атакуемость белков может быть снижена в силу наличия ингибирующих факторов (липидов, полисахаридов, остаточных количеств ингибиторов белковой природы и др.), и имеющей место компартментализации белков. В этой связи была изучена кинетика действия ферментных препаратов при использовании в качестве субстрата – ОСМ (рис.1). Установлено, что максимальная скорость гидролиза наблюдается при концентрации ФП Нейтраза 0,6 ед. ПС/г муки и концентрации субстрата 100 мг/мл, ФП Флавозим - 1,0 ед. ПС/г муки и концентрации субстрата 100 мг/мл.
| Рис. 1. Зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза ФП Нейтраза (1) и Флавозим (2) от концентрации субстрата |
В рамках модели Михаэлиса-Ментен, связывающей начальную скорость реакции, максимальную скорость реакции и исходную концентрацию субстрата. Рассчитывали значения кажущихся кинетических параметров Km(каж) и Vmax(каж) исследованных ФП, используя экспериментальные кинетические зависимости и известные математические методы преобразования уравнения Михаэлиса-Ментен (Лайнуивера – Берка, Эди – Хофсти, Вульфа - Августинсона). Значения кинетических параметров, полученные расчетно-графическими методами, сведены в табл. 1.
Таблица 1
Кинетические параметры Кm и Vmax для ФП Нейтраза и Флавозим
№ п/п | Методы преобразования | ФП | |||
Нейтраза | Флавозим | ||||
Km каж, мг/мл | Vmax×10-3 каж, мг/мл·мин | Km, каж, мг/мл | Vmax ×10-3 каж, мг/мл·мин | ||
1 | Лайнуивера - Берка | 250 | 40,0 | 200 | 20,0 |
2 | Эдди – Хофсти | 275 | 37,5 | 188 | 26,0 |
3 | Вульфа - Августинса | 150 | 36,0 | 200 | 12,0 |
4 | Средние значения кине-тических параметров | 225,0 | 37,8 | 196,0 | 19,3 |
Сравнение численных значений «кажущихся» Кm для исследуемых ФП показывает, что Кm Флавозима имеет наименьшее значение 196 мг/мл, т. е. обладает наибольшей специфичностью к белкам ОСМ, Нейтраза имеет Кm 225 мг\мл. Несмотря на принятые допущения, полученные при расчете, кинетические параметры косвенно свидетельствуют о различном сродстве изучаемых ферментных препаратов к субстрату, что позволяет сделать предположение о целесообразности совместного применения данных ферментных препаратов для эффективного гидролиза соевой муки.
2.3. Оптимизация условий получения ПФМСМ с применением МЭК
С учетом различного характера действия ФП, включая различную селективность к пептидным связям и разное сродство к субстрату, проводили исследования по влиянию состава МЭК и условиям внесения ФП Флавозим с применением методов математического планирования на основе униформ-ротатабельных планов.
Анализ полученных поверхностей отклика и математических зависимостей показывает (рис.2), что оптимальными условиями ферментативного гидролиза необходимо считать: для МЭК Нейтраза – Флавозим: оптимальная дозировка ФП Нейтраза 0,35 ед. ПС/г муки; Флавозима - 0,35 ед. ПС/г муки; время внесения Флавозима – 0 – 30 мин при выбранных ранее условиях – t= 45°С и рН= 6,0 – 6,5 ;для МЭК Бирзим – Флавозим: дозировки ФП Бирзим 0,50 ед. ПС/г муки; Флавозима - 0,35 ед. ПС/г муки; время внесения Флавозима - 0 – 30 мин при выбранных ранее условиях – t= 45°С и рН= 6,0 – 6,5.
|
|
Рис. 2. Накопление аминного азота в ПФМСМ в зависимости от времени внесения и концентраций ФП
А – МЭК Нейтраза + Флавозим; Б– МЭК Бирзим П7 + Флавозим
Установлено, что применение МЭК для гидролиза ОСМ позволяет повысить степень гидролиза до 11,9% в случае МЭК (Нейтраза+ Флавозим) и до 16,3% при использовании МЭК (Бирзим П7 + Флавозим) (рис.3). В то время как степень гидролиза ОСМ при действии указанных выше ферментных препаратов при раздельном внесении составляет 9,0 – 10,6%.
Рис. 3. Динамика накопления аминного азота при гидролизе ОСМ ФП Нейтраза (1), Бирзим (2), Флавозим (3), МЭК Нейтраза-Флавозим (4) и МЭК Бирзим + Флавозим (5)
Разработана модифицированная схема, отличающаяся от исходной, предварительной обработкой ОСМ подкисленной водой с рН 3,5 и 1%-ным раствором Na2CO3 в течение 15 мин (рис. 4). При этом выход белка увеличивается на 44,0%, по сравнению с экстракцией водой, содержание ЭНРВ снижается. Показано, что по модифицированной схеме могут быть получены сухие ПФМСМ с пониженным содержанием ЭНРВ и с увеличенным в 2 раза содержанием белка.
Рис.4. Исходная (А) и модифицированная (Б) технологические схемы получения ПФМСМ
2.4 Оценка химического состава продуктов ферментативной модификации соевой муки для их применения в составе ряда пищевых продуктов и биотехнологии
Для оценки эффективности действия ФП Бирзим П7, Нейтраза, Флавозим и их МЭК на ИСБ и белок ОСМ проводили сравнительную оценку молекулярно-массовых распределений белка, полученных методом SE-HPLC.
Данные по молекулярному распределению белков в ферментативных гидролизатах (табл. 2) показывают, что за 8 часов гидролиза образуются пептиды и олигопептиды различной молекулярной массы и аминокислоты в различном соотношении. Ферментный препарат Бирзим П7 медленнее расщепляет высокомолекулярные белки сои, а Флавозим, обладая эндо - и экзопептидазными активностями, осуществляет достаточно глубокий гидролиз белков соевой муки. Увеличение продолжительности гидролиза до 17 часов позволяет получать гидролизаты, содержащие в основном пептиды, олигопептиды и аминокислоты, имеющие молекулярную массу менее 45 кДа. Существенные отличия наблюдаются и в ферментативных гидролизатах, полученных под действием МЭК на основе выбранных ФП.
Так, в гидролизате, полученном при действии МЭК за 8 часов гидролиза, преобладают белки и пептиды с молекулярной массой 25-45 кДа (30,4%) и 15-25 кДа (45,8%). В течение следующих 9 ч в гидролизате, полученном под действием ФП Нейтраза и Флавозим, продолжают накапливаться белки и пептиды с молекулярной массой 25-45 кДа (49,7%) и 15-25 кДа (36,8%), а также короткие олигопептиды с молекулярной массой 5-15 кДа. А при действии ФП Бирзим П7 и Флавозим наблюдается другое соотношение белков этих фракций: 25-45 кДа (28,6%) и 15-25 кДа (42,3%). Через 9 ч гидролиза сохраняется достигнутое соотношение фракций.
Таблица 2
Фракционный состав белков соевой муки и ее гидролизатов, полученных с помощью протеолитических препаратов за 8 и 17 ч гидролиза
Время удерживаниямин | Молекулярная масса, кДа | Соевая мука | Продукты ферментативного гидролиза, полученные под действием | |||||||||
Нейтраза | Бирзим | Флавозим | Нейтраза + Флавозим | Бирзим + Флавозим | ||||||||
8,0 | 17,0 | 8,0 | 17,0 | 8,0 | 17,0 | 8,0 | 17,0 | 8,0 | 17,0 | |||
5,8 | Более 130 | 14,1 | 4,9 | 2,9 | 16,4 | 12,7 | 23,6 | 21,7 | 12,2 | 2,7 | 8,9 | 8,5 |
7,5 | 45-130 | 41,2 | 27,7 | 2,3 | 12,9 | 3,6 | 14,8 | 12,2 | 1,7 | 0,0 | 9,7 | 9,2 |
10,8 | 25-45 | 23,5 | 18,4 | 51,1 | 27,4 | 37,5 | 27,7 | 23,4 | 30,4 | 49,7 | 28,6 | 29,9 |
12,2 | 15-25 | 11,7 | 40,8 | 36,2 | 37,1 | 39,9 | 25,5 | 34,2 | 45,8 | 36,8 | 42,3 | 41,6 |
16,8 | 5-15 | 9,4 | 8,2 | 7,5 | 6,1 | 6,2 | 5,5 | 6,1 | 7,8 | 10,7 | 7,7 | 8,2 |
20,2 | Менее 1,5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 2,7 | 2,3 | 1,9 | 0,0 | 2,7 | 2,5 |
Методом SE-HPLC показан различный характер действия исследуемых ферментов Нейтраза, Бирзим и Флавозим и МЭК на их основе на ИСБ и ОСМ. Более глубокий гидролиз высокомолекулярных белков осуществляется с участием ферментного препарата Нейтраза и МЭК на основе этого ФП.
Таким образом, в результате проведенных исследований можно констатировать, что разработанные условия и режимы получения белковых гидролизатов ИСБ и соевой муки позволяют получить гидролизаты существенно различающиеся фракционным составом, что в свою очередь, обусловливает в дальнейшем их различные функциональные свойства (растворимость, пенообразующую, эмульгирующую способность и другие) в условиях технологического процесса производства различных продуктов питания.
С целью более полного исследования состава свободных аминокислот ПФМСМ под действием ФП Нейтраза, Флавозим и Бирзим П7 нами был изучен фракционный состав продуктов гидролиза в течение 6 ч методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. В результате проведенных исследований установлено, что все образцы ОСМ, подвергнутые ферментативному воздействию, содержат весь набор аминокислот, однако их распределение в образцах различно.
Установлено, что ПФМСМ практически сбалансированы по содержанию метионина, цистина и лизина и их содержание составляет примерно 19% от суммы общих аминокислот. Наиболее важными аминокислотами, входящими в состав напитков для спортсменов, являются валин, лейцин и изолейцин. Доля этих аминокислот наибольшая в ПФМСМ, полученном с использованием ФП Нейтраза, и составляет 54,4%.
Для более полной характеристики продуктов модификации соевой муки определяли содержание некоторых углеводов. Методом ВЭЖХ установлено, что ПФМСМ, полученный с помощью МЭК Нейтраза-Флавозим, содержит (%): сахарозу – 10,5, глюкозу – 19,2, фруктозу – 21,2, стахиозу – 10,8, раффинозу – 2,4. Полученные результаты свидетельствуют о высоком содержании углеводов в ферментативном соевом гидролизате, которое необходимо учитывать при использовании его в составе пищевых продуктов.
Семена сои являются одним из редких продуктов, содержащих изофлавоны, которые сконцентрированы в гипокотиле сои и отсутствуют в масле, в связи с этим исследовали содержание изофлавонов в продуктах ферментативного гидролиза соевой муки методом ВЭЖХ. Установлено, что в ПФМСМ содержатся следующие основные изофлавоны: даидзеин и глицитеин (в пересчете на даидзеин) – 137,3 мг/100 г гидролизата, а также генистеин – 90,4 мг/100 г гидролизата, которые являются природными антиоксидантами.
Таблица 3
Химический состав продуктов ферментативного гидролиза соевой муки
№ п/п | Компоненты | Содержание, % | |
Стандартная» схема | Модифицированная» схема | ||
1 | Влажность | 8,0 | 7,6 |
2 | Белок | 47,0 | 68,0 |
3 | Общий сахар | 39,5 | 20,0 |
4 | Клетчатка | 2,0 | 2,0 |
5 | Пектиновые вещества | 0,5 | 0,1 |
6 | Липиды | 2,5 | 2,0 |
7 | Зола | 0,5 | 0,3 |
Проведена сравнительная оценка ПФМСМ, полученных с применением ферментного препарата Бирзим П7, полученных по стандартной и модифицированной схемам. Данные, представленные в табл. 3, показывают, что ПФМСМ, полученные по модифицированной схеме, содержат на 45% больше белка, чем продукты, полученные по исходной схеме. Кроме того, содержание углеводов в них меньше на 50%.
Таким образом, показано, что по модифицированной схеме могут быть получены сухие ПФМСМ с пониженным содержанием ЭНРВ и с увеличенным содержанием белка.
2.5. Исследование влияния технологических факторов на функциональные свойства продуктов ферментативной модификации соевой муки
Известно, что функциональные свойства (ФС) белковых гидролизатов как комплекс физико-химических характеристик зависит от ряда исходных параметров, среди них физико-химические свойства исходного белка, специфичность используемой протеазы, условия проведения гидролиза, степень гидролиза, молекулярно-массовое распределение и др.
Принимая во внимание различный характер действия на белки СОМ ФП Нейтраза, Бирзим П7, Флавозим и МЭК на их основе, изучали ФС полученных ПФМСМ (табл.4).
Установлено, что ПФМСМ, полученные по стандартной и модифицированной схемам, обладают хорошей растворимостью, поскольку индекс растворимости ОСМ составил 20%, в то время как для ПФМСМ индекс растворимости равен 1,0 %, способны образовывать устойчивые гели и имеют хорошую растворимость белков в диапазоне рН 2,5-8,5 по сравнению с ОСМ.
Получены данные об изменении ЭС в течение 7,5 гидролиза ОСМ исследуемыми ФП. Установлено, что под действием ФП Нейтраза в течение 4,5 ч, получается ПФМСМ, обладающий стабильными ЭС.
Таблица 4
Влияние способа получения ПФМСМ на ФС
№ п\п | ФТС | Исходная схема | Модифицированная схема |
1 | ВУС | ПФМСМ образуют гели | ПФМСМ образуют гели |
2 | ЖУС | ПФМСМ обладают низкой ЖУС | ПФМСМ обладают высокой ЖУС |
3 | Индекс растворимости | 1,0% | 1,0% |
4 | Растворимость в диапазоне рН | ПФМСМ растворимы при рН 3,0-4,5, растворимость выше на 20-25% | ПФМСМ растворимы при рН 3,0-4,5 |
5 | Мутность при рН 3,0-4,0 | Высокая 2,5 | Низкая 0,5 |
6 | ЭС | Не влияет | Не влияет |
7 | ПОС | Зависит от рН | Не зависит от рН |
8 | СП | Зависит от рН | Не зависит от рН |
|
|
| |
| |
Б
|
|
|
Рис. 5. Модификация ПОС ПФМСМ с помощью МЭК Нейтраза + Флавозим (А) и МЭК Бирзим + Флавозим (Б)
А
|
|
|
|
Б
|
|
|
Рис. 6. Модификация СП, образуемой ПФМСМ с помощью МЭК Нейтраза + Флавозим (А) и МЭК Бирзим + Флавозим (Б)
Разработана методика определения ПОС ПФМСМ и проведены исследования по влиянию технологических факторов (время гидролиза, рН среды) на ПОС и СП продуктов гидролиза, полученных по разным схемам.
Установлено, что ПОС ПФМСМ, полученных с помощью ФП Бирзим П7 и Нейтраза, постепенно увеличивается в течение 6 ч гидролиза белков ОСМ, а затем начинает уменьшаться, в то время как ПОС ПФМСМ, полученных с помощью ФП Флавозим, существенно не изменяется в ходе гидролиза.
СП ПФМС, полученных под действием ФП, имеет другой характер. Так, ФП Нейтраза приводит к снижению СП за 7,5 часов гидролиза, ФП Флавозим и Бирзим П7 способствуют увеличению СП до 6 часов гидролиза, а затем резкому снижению до 90% и 50%, соответственно.
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что способ получения ПФМСМ влияет на их ФС, это легло в основу исследований по получению ПФМСМ с применением МЭК.
В зависимости от соотношения ферментных препаратов в составе МЭК определяли такие функциональные свойства как пенообразующая способность, стойкость пены, эмульгирующие свойства с использованием метода униформ – ротатабельного планирования. На основании полученных результатов эксперимента с помощью программы STATISTICA 6,0 были построены поверхности отклика. На рис.5 и 6 в качестве примера представлены кривые зависимости ПОС и СП от дозировок ферментных препаратов в составе МЭК.
Результаты проведенных исследований говорят о возможности модификации ПОС и СП ПФМСМ при действии различных МЭК. Так, ПФМСМ, полученные с помощью разработанных МЭК, обладают достаточно высокой ПОС. Однако, пены ПФМСМ, полученных под действием МЭК Бирзим П7 + Флавозим, стабильнее в диапазоне исследуемых концентраций ферментных препаратов.
Проведены исследования по изменению мутности растворов гидролизатов в широком диапазоне рН. Установлено, что наименьшей прозрачностью исследуемые ферментативные соевые гидролизаты обладают в диапазоне рH 2,86-3,8, что необходимо учитывать при использовании гидролизатов для обогащения напитков с пониженным значением рН. Кроме того, проводили оценку прозрачности гидролизатов, полученных с применением различных ферментных препаратов, в течение 7,5 часов гидролиза.
Показано различное действие МЭК Нейтраза + Флавозим и МЭК Бирзим + Флавозим на растворимость ПФМСМ белков соевой муки. Установлено, что для повышения пищевой ценности напитков с рН 3,0 лучше использовать ПФМСМ, полученные с помощью МЭК Бирзим + Флавозим.
2.6. Разработка технологических решений для применения продуктов ферментативной модификации соевой муки
Исследования химического состава продуктов ферментативного гидролиза показали, что они, помимо полноценного белка, содержат водорастворимые пептиды, свободные аминокислоты и углеводы, в том числе глюкозу и сахарозу, липиды, фосфолипиды изофлавоны и их можно использовать для повышения пищевой ценности пищевых продуктов. Кроме того, продукты ферментативной модификации соевой муки имеют различные функциональные свойства и могут быть использованы для различных категорий пищевых продуктов.
В связи с изложенным выше, продукты модификации соевой муки использовали для повышения пищевой и биологической ценности пищевых продуктов. Исследования проводили в соответствии со схемой (рис.7).
Разработана рецептура йогуртового напитка, с внесением ПФМСМ в количестве 1,3%. При этом количестве по сравнению с контролем сгусток образуется за 6 ч с кислотностью по Тернеру 143о и наблюдается самый низкий синерезис – 53 %. Титр молочнокислых бактерий составил 107 КОЕ.
По органолептическим показателям йогуртовый напиток имел цвет от молочного до светло-кремового, вкус и запах приятный, свойственный кисломолочному продукту. Полученный низкожирный йогуртовый напиток имеет повышенную пищевую ценность, поскольку в его состав входят белки, пептиды и аминокислоты, а также ценные биологически активные изофлавоны растительного происхождения.
Рис.7. Схема проведения исследований по применению ПФМСМ в пищевой промышленности и биотехнологии
Применение продуктов ферментативной модификации соевой муки в
пищевых продуктах
Принимая во внимание хорошую растворимость ПФМС при пониженных значениях рН на базе концентратов соков разработана рецептура сокосодержащего напитка, содержащего ПФМСМ в количестве 5 кг на 1 т напитка и витаминно-минеральный премикс в количествах, удовлетворяющих суточные потребности взрослого человека на 10-30 %. Результаты исследований апробированы в производственных условиях на Солодовпиво». Получены положительные отзывы.
Технология кисломолочных продуктов, предусматривающая сквашивание молока чистыми штаммами молочнокислых бактерий, предполагает их активизацию как при сквашивании продукта, так и на стадии приготовления закваски. В последнем случае применяют питательные среды, содержащие различные элементы питания бактерий, в основном углеводы. Их используют в составе питательных сред либо в чистом виде (лактулоза, декстрин-мальтоза и др.), либо в виде углеводосодержащих продуктов (кукурузный экстракт). Особое место в ряду углеводных стимуляторов занимают олигосахариды, в том числе соевые (раффиноза и стахиоза).
Принимая во внимание высокое содержание углеводов в ЭНРВ, который является вторичным продуктом получения ПФМСМ, изучали возможность его включения в состав питательных сред для культивирования кисломолочных бактерий.
Установлено, что введение в питательную среду ЭНРВ благоприятно влияет на развитие МКБ и его целесообразно рекомендовать для включения в состав питательных сред для культивирования Lactobacillus bulgaricum и Streptococcus thermophilus.
Кроме того, разработана рецептура комбинированного йогуртового напитка, обогащенного ЭНРВ. Для приготовления йогуртового напитка использовали пастеризованное гомогенизированное молоко с жирностью 3,2%, в качестве закваски применяли симбиотическую закваску молочнокислых бактерий (МКБ) для йогурта СТБп, содержащую культуры Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricum. Закваску вносили в количестве 5% по объему. При использовании 1,3% GRINDSTED R SВ 550 А в комбинации с Fibrulose F97 была получена однородная вязкая структура сгустка при высокой кислотности. Полученный напиток имеет повышенную пищевую ценность за счет внесения ЭНРВ, а также ценные пребиотические олигосахариды.
Применение продуктов переработки сои в кормопроизводстве
Предложена малоотходная технология переработки вторичных продуктов соевой пасты и соевого экстракта для получения кормовой белковой добавки на основе дрожжей С. tropicalis.
Соевая паста содержит ценные питательные вещества: белок (11%), углеводы (7,3%), минеральные вещества(2,7%) и может быть использована в кормопроизводстве, а также в качестве компонента питательных сред для культивирования микроорганизмов.
Для увеличения биодоступности углеводов проводили их предварительный гидролиз с помощью ферментного препарата Вискозим L. Выбраны оптимальные условия гидролиза соевой пасты: концентрация ФП 10,8 ед. β-ГА /г пасты, концентрация соевой пасты-10%. Установлено, что за 3 часа гидролиза соевой пасты ФП Вискозим образуется 1,4 %РВ.
Кроме того, с применением методов математического планирования эксперимента проводили оптимизацию состава питательной среды для глубинного культивирования дрожжей С. tropicalis . Разработана питательная среда следующего состава: ферментированная соевая паста – 30 г/л, MgSO4 - 0,5 г\л, (NH4)2HPO4 - 0,9 г\л и (NH4)2SO4 – 1,7 г\л. Установлено, что при культивировании дрожжей титр дрожжевых клеток составил 1,49 10 8 кл.\мл, содержание белка – 41,0 %, содержание фосфора – 11,0%.
|
|
|
Рис. 8. Накопление биомассы дрожжей С. tropicalis при различных концентрациях (NH4)2HPO4 и (NH4)2SO4
Х1 – количество (NH4)2HPO4; Х2 – количество (NH4)2SO4 (г) при постоянной дозировке MgSO4 (г), Y8 – титр дрожжей С. tropicalis
Проведены исследования по аминокислотному составу кормовой добавки. Установлено, что она богата такими незаменимыми аминокислотами как аргинин, метионин, лейцин, изолейцин, тирозин, валин и фенилаланин. Кроме этого, методом ВЭЖХ исследован жирнокислотный состав кормовой добавки. Установлено, что содержание линолевой кислоты, которая относится к незаменимым жирным кислотам и необходима для нормальной жизнедеятельности организма, составляет 47,74% .
Высокое содержание протеина и жирных кислот в кормовой белковой добавке позволяет ее включать в рационы кормов.
Приведенные исследования являются основой для создания малоотходной технологии переработки соевого сырья для применения в пищевой и комбикормовой промышленности.
На основании проведенных исследований были сделаны следующие ВЫВОДЫ:
1. На основе экспериментальных исследований кинетики действия протеолитических ферментных препаратов различного происхождения (Бирзим П7, Нейтраза, Флавозим) в условиях модельного субстрата (ИСБ) и соевой муки определены оптимальные условия проведения направленного биокатализа белков соевой обезжиренной муки с целью получения продуктов ферментативной модификации соевой муки. Установлено, что при оптимальных концентрациях участников ферментативного гидролиза и оптимальных условиях их взаимодействия, максимальное накопление аминного азота в гидролизатах достигается в первые шесть часов гидролиза, которое составляет 0,8-0,60 мг/мл при концентрации СОМ – 100 мг/мл и концентрации ферментных препаратов Бирзим П7 - 0,5 ед. ПС/г муки, Нейтраза- 0,6 ед. ПС/г муки, Флавозим -1,0 ед. ПС/Г муки.
2. С применением методов математического планирования на основе униформ-ротатабельных планов проведена оптимизация состава МЭК, состоящих из ФП Нейтраза и Флавозим, а также Бирзим П7 и Флавозим, и получены регрессивные уравнения, описывающие накопление аминного азота и содержание белка в зависимости от концентрации ферментных препаратов и времени их внесения в реакционную среду. Совместное применение ферментных препаратов в МЭК способствует интенсификации процесса гидролиза СОМ и увеличению степени гидролиза до 11,6% при использовании ФП Нейтраза и Флавозим, и до 18,4% в случае использования МЭК Бирзим П7 и Флавозим, по сравнению с использованием каждого ферментного препарата в отдельности (степень гидролиза 9,0-10,0%). Для получения продуктов с глубокой степенью гидролиза белков соевой муки целесообразно увеличить продолжительность гидролиза до 17 часов, при этом содержание аминного азота увеличивается до 4,65-3,69 мг/мл, что превышает содержание в исходной муке в 3,7 и 4,6 раза.
Разработана модифицированная схема получения ПФМСМ с пони-женным содержанием ЭНРВ и увеличенным содержанием белка по сравнению с ПФМСМ, полученными по стандартной схеме, за счет введения стадий предварительной обработки растворами, имеющими различное значение рН.
3. Изучен химический состав ПФМСМ для их применения в пищевых продуктах. Методом SE-HPLC дана сравнительная оценка молекулярно-массовых распределений белка в продуктах гидролиза ИСБ и СОМ, полученных при использовании протеолитических ферментных препаратов различного происхождения и МЭК на их основе.
Установлено, что продукты, полученные по модифицированной схеме, содержат на 45% больше белка, чем в продуктах, полученных по стандартной схеме. Кроме того, содержание углеводов в них меньше на 50%.
Методом ВЭЖХ исследован углеводный состав продуктов ферментативного гидролиза соевой муки. Установлено в них высокое содержание олигосахаридов, в том числе стахиозы, относящихся к группе соединений, которые обладают пребиотическим действием.
Установлено, что в ферментативном гидролизате соевой муки содержатся изофлавоны - даидзеин и глицитеин, являющиеся фитоэстрогенами.
4. Дана характеристика продуктов ферментативной модификации по функциональным свойствам - пенообразующей способности, стабильности пены, эмульгирующей способности, растворимости, мутности (прозрачности). Показано, что способ получения ПФМСМ влияет на их ФС. Получены зависимости, характеризующие изменение некоторых функциональных свойств в зависимости от рН среды, продолжительности гидролиза и происхождения ферментного препарата. С использованием методов математического планирования эксперимента показана возможность модификации функциональных свойств ПФМСМ под действием МЭК, состоящей из ФП Нейтраза и Флавозим и Бирзим П7 и Флавозим.
5. Разработаны технологические решения для применения продуктов ферментативной модификации соевой муки. Проведена промышленная апробация и выпуск опытной партии продуктов ферментативной модификации соевой муки в условиях . Разработаны рецептуры специализированных напитков, содержащих ПФМСМ и витаминно-минеральный премикс на основе концентрированного апельсинового и персикового сока, имеющих повышенную пищевую ценность. Проведены производственные испытания в условиях Солодовпиво».
Разработана рецептура йогуртового низкожирного напитка с использованием ПФМСМ. Показано, что он содержит на 20% белка больше, чем известные низкожирные йогуртовые напитки.
6. Предложены технологические решения по утилизации соевой пасты и ЭНРВ, которые являются вторичными продуктами получения ПФМСМ по модифицированной схеме составе питательных сред для культивирования дрожжей C. tropicalis.
Проведена оптимизация состава среды для культивирования дрожжей и дана характеристика кормовой белковой добавки по содержанию белка, аминокислотному и жирнокислотному составу.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ
1. Иванушкин биохимических характеристик продуктов ферментативного гидролиза соевой муки / , , //Вестник МИТХТ.- 2009. - №2. - Т. 4.- С. 89-94.
2. Иванушкин действия ферментных препаратов Нейтраза и Флейворзайм на белок соевой муки / , , С // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2009. - № 3.-С. 45-48.
3. Иванушкин изучение ферментативных гидролизатов изолированного соевого белка и соевой муки методом SE-HPLC / , , // Вестник МИТХТ.- 2010. - Т.5.- с. 82-86.
4. Иванушкин кормовой белковой добавки на основе продуктов переработки сои / , , // Хранение и переработка сельхозсырья№ 4.- С.20-23.
Статьи и материалы конференций
1. Иванушкин некоторых функциональных свойств ферментативного соевого гидролизата / , , // В Сб. материалов V международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания». - ч.С.152-155.
2. Иванушкин биологически активной добавки к пище в виде ферментолизатов соевых белков / , , // Сборник докладов VI научно-технической конференции с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации: эффективное использование ресурсов отрасли», М.: ГОУ ВПО: МГУППС. 85-90.
3. А Питательные среды для молочнокислых бактерий с использованием отходов производства соевых ферментолизатов / , , // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва: -биохим-технологии», РХТУ им. , 2008.- С.- 96.
4. Иванушкин йогуртового напитка аминокислотами и изофлавонами соевого ферментативного гидролизата / , , //В сб. материалов VII международной научно-практической конференции и выставке «Технология и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты». - М.: МГУПП, 2009. - С.237-240.
5. Иванушкин протеолитических препаратов различного происхождения на изолированный соевый белок / , , //Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в пищевой промышленности», Самара, СамГУ.- 2009. - С. 71-73.
6. Иванушкин продуктов ферментативной модификации соевой муки с заданными свойствами /, , Н. Е Куликова// Инновационный форум пищевых технологий посвященный юбилею МГУПП. М., 2010, МГУПП. - С..
***
Принятые сокращения и обозначения
ВУС | - водоудерживающая способность |
ЖУС | - жироудерживающая способность |
МЭК | - мультиэнзимная композиция |
ОСМ | - обезжиренная соевая мука |
ПОС | - пенообразующая способность |
ПС | - протеолитическая активность |
ПФМСМ | - продукт ферментативной модификации соевой муки |
СП | - стабильность пены |
ФП | - ферментные препараты |
ФСП | - ферментированная соевая паста |
ФС | - функциональные свойства |
ЭНРВ | - экстракт низкомолекулярных растворимых веществ |
ЭС | - эмульгирующая способность |
