На правах рукописи
ФИЛИППОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА
РОЛЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИНВАЗИВНОСТИ И АПОПТОЗА ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ
НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени » Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор
доктор медицинских наук,
профессор Гариб Фируз Юсуфович
Ведущая организация:
Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика » Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «17» октября 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава
Автореферат разослан «23» июня 2011 года
Ученый секретарь диссертационного Совета,
кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т. Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Наружный генитальный эндометриоз, одно из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, характеризуется ростом эндометриальной ткани вне полости матки, преимущественно в перитонеальной полости, и является причиной развития у пациенток болевого синдрома и бесплодия (Vinatier D., e. a, 2000; Nap A.., e. a., 2004; Rodgers P. A., е. а., 2009). Гипотеза о важной роли иммунных нарушений в развитии эндометриоидных гетеротопий получила в последние годы широкое распространение ( с соавт., 2005; с соавт., 2007; Iwabe T., e. a., 2000; Lebovic D. I., e. a., 2001; Berkkanoglu M., Arici A., 2003; Ulukus M, Arici A., 2005; Kyama C. M., e. a., 2009; Velasco I., e. a., 2010).
Развитие и рост эндометриоидных очагов происходит в перитонеальной полости. Известно, что в перитонеальной жидкости содержится большое количество клеток иммунной системы, преимущественно макрофагов, и разнообразных биологически активных веществ, участвующих в регуляции процессов клеточного роста и пролиферации (Vinatier D., e. a., 2001; Yang W. C.V., e. a., 2004; Nap A.., e. a., 2004). У женщин с эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация макрофагов, усилена их активация и продукция ими целого ряда цитокинов и факторов роста (Halme J., e. a., 1987; Gazvani R., Templeton A., 2002; Sidell N., e. a., 2002; Kyama C. M., e. a., 2003; Yang W. C.V., e. a., 2004). Однако до сих пор остается не решенным вопрос о том, почему, несмотря на высокий уровень активации, перитонеальные макрофаги пациенток с эндометриозом не элиминируют из перитонеальной полости гетеротопический эндометрий. В основе этого явления могут лежать нарушения экспрессии макрофагами функциональных рецепторов, а также изменения продукции цитокинов, хотя прямых доказательств этой гипотезы до сих пор не получено.
Эндометриальные клетки у пациенток с эндометриозом обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферацией и инвазивностью ( с соавт., 2007; Vinatier D., e. a., 2000; Brenner R. M., e. a., 2002). Особую роль в обеспечении инвазивности эндометриальных клеток при эндометриозе отводят повышенной продукции протеолитических ферментов из семейства матриксных металлопротеиназ (MMPs) в ткани эндометриоидного очага (Ueda M., e. a., 2002; Alviggi C., e. a., 2004; Chen Q. H., e. a., 2004; Li Y., Lang J. H., 2006; Collette T., e. a., 2006). Однако до сих пор не установлены факторы, которые могут влиять на усиление синтеза ММРs при эндометриозе. Считают, что выживанию эндометрия в перитонеальной полости способствует угнетение апоптоза эндометриальных клеток (Dmowski W. P., e. a., 2004; Nishida M., e. a., 2004; Harada Н., е. а., 2004, 2007; Taniguchi F., e. a., 2011). По данным литературы, фагоциты играют важную роль в индукции апоптоза (Mor G., Abrahams V. M., 2003). Однако участие перитонеальных макрофагов в регуляции апоптоза клеток эндометрия при эндометриозе мало изучено.
Таким образом, выявление участия перитонеальных макрофагов и гуморальных факторов перитонеальной жидкости в обеспечении повышенной жизнеспособности и инвазивности ткани эндометриоидных очагов является актуальной задачей клинической иммунологии, так как позволит уточнить иммунные аспекты формирования и роста гетеротопий.
Цель исследования: установить механизмы участия перитонеальных факторов в регуляции апоптоза и инвазивности эндометриальных клеток при наружном генитальном эндометриозе для выяснения новых патогенетических аспектов эндометриоза
Задачи исследования:
1. Установить особенности функционального состояния перитонеальных макрофагов и содержания кальпротектина, IL-8, и MCP-1 в перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом.
2. Определить особенности экспрессии факторов, регулирующих апоптоз и инвазию (MT-1, XIAP, каспаза-3, ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом.
3. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на апоптоз стромальных клеток и на экспрессию факторов, регулирующих апоптоз (MT-1, XIAP, каспаза-3), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом и здоровых женщин.
4. В эксперименте in vitro оценить влияние перитонеальных факторов на экспрессию генов, регулирующих инвазивность (ММР-2, ММР-9, TIMP-1, TIMP-2), в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом.
5. Выявить влияние секреторных продуктов перитонеальных макрофагов и перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом на инвазию эндометриальных клеток в матригеле.
Научная новизна исследования
Установлены новые иммунные механизмы, участвующие в развитии и росте эктопического эндометрия в перитонеальной полости пациенток с наружным генитальным эндометриозом.
Показано, что развитие и рост очагов эндометриоза в перитонеальной полости происходят на фоне угнетения экспрессии перитонеальными макрофагами молекул, участвующих в межклеточном взаимодействии, презентации антигена и запуске апоптоза.
Выявлено, что распространенные формы наружного генитального эндометриоза ассоциируются с усилением внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов макрофагами, и повышением содержания в перитонеальной жидкости хемокинов и кальпротектина.
Показано, что развитие эндометриоза связано с нарушением регуляции апоптоза в ткани эндометрия, проявляющимся в повышении синтеза анти-апоптотическиого фактора XIAP в эутопическом эндометрии, усилении экспрессии мРНК каспазы-3 в ткани эндометриодного очага и резком снижении уровня экспрессии мРНК МТ-1 как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии пациенток с эндометриозом.
Впервые установлено, что у здоровых фертильных женщин макрофаги и растворимые факторы перитонеальной жидкости in vitro усиливают апоптоз эндометриальных стромальных клеток, тогда как у пациенток с эндометриозом перитонеальная жидкость снижает апоптоз эндометриальных стромальных клеток, а перитонеальные макрофаги угнетают экспрессию мРНК регулирующих апоптоз факторов (MT-1, XIAP и каспазы-3) в ткани эутопического эндометрия.
Выявлено усиление инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе за счет изменения баланса в системе ММРs/TIMPs в сторону преобладания активности протеолитических ферментов.
Впервые показано, что факторы перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия, при этом перитонеальная жидкость повышает синтез в ткани эндометрия протеолитического фермента ММР-2, а макрофаги – угнетают экспрессию мРНК антипротеолитических факторов TIMP-1 и TIMP-2.
Впервые выявлено, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом аутологичная перитонеальная жидкость и продуцируемые макрофагами растворимые факторы усиливают инвазию в матригеле клеток эутопического эндометрия.
Практическая значимость результатов исследования
Выявлены новые патогенетические механизмы развития наружного генитального эндометриоза, заключающиеся в уточнении роли перитонеальных факторов в регуляции инвазивности и апоптоза эндометриальных клеток.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии степени тяжести наружного генитального эндометриоза, основанные на определении относительного содержания в перитонеальной жидкости уровня IL-8+ перитонеальных макрофагов.
Предложены новые дополнительные диагностические критерии наружного генитального эндометриоза, основанные на определении уровня экспрессии в эндометрии мРНК XIAP.
Положения, выносимые на защиту
Высокий уровень синтеза XIAP в эутопическом эндометрии при наружном генитальном эндометриозе обеспечивает повышение жизнеспособности эндометриальных клеток при их попадании в перитонеальную полость, тогда как усиление протеолитической активности ММР-2 и ММР-9 на фоне высокого уровня синтеза каспазы-3 способствует росту эндометриоидного очага.
Снижение экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами и усиление продукции провоспалительных цитокинов приводит к нарушению локального иммунного ответа и изменению микроокружения в перитонеальной полости, вызывая угнетение апоптоза клеток эутопического эндометрия и усиление их инвазивных свойств, что обеспечивает рост гетеротопий.
Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); 90-й Юбилейной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию академии «Неделя науки - 2010» (Иваново, 2010); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» с элементами научной школы для молодежи (Пермь, 2010).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени » Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии и иммунологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводилось выполнение иммунологических исследований. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 8 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 197 источников, в том числе 24 отечественных и 173 иностранных источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. » Минздравсоцразвития России, директор д. м.н. . Исследования проводились в гинекологической клинике, эндоскопическом отделении - зав. к. м.н. , лаборатории клинической иммунологии - зав. д. м.н. профессор , лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д. м.н. профессор .
Всего было обследовано 126 женщин, поступивших в гинекологическую клинику ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. » Минздравсоцразвития России, объединенных в следующие клинические группы: 35 практически здоровых женщин фертильного возраста с реализованной репродуктивной функцией (контрольная группа) и 91 женщина с наружным генитальным эндометриозом, из которых у 62 женщин (68%) был диагностирован эндометриоз I-II степени, а у 29 пациенток (32%) – эндометриоз III - IV степени.
Материалом для исследования служили: перитонеальная жидкость, биоптаты эндометрия из полости матки и ткань эндометриоидных очагов.
Иммунологические методы исследования:
- выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной жидкости стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,078) (Boyum A., 1968);
- выделение обогащенной популяции стромальных клеток из ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин стандартным ферментативным методом (Clover L. M., et. al., 2000);
- определение особенностей экспрессии функциональных молекул на поверхности макрофагов перитонеальной жидкости с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). Характеристика используемых мАТ представлена в Таблице 1. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для оценки внутриклеточной продукции цитокинов проводили процедуру пермеабилизации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invinrogen, Camarillo, CA, USA). Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, использовали коммерческий набор с Annexin V (CALTAG Laboratories, USA). Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickonson, USA).
Таблица 1.
Панель мАТ, использованных в исследовании
№ п/п | мАТ | Клон | Фирма-производитель | Флюорохромная метка |
1 | CD11b | - | , Москва | FITC |
2 | CD49e | IIA1 | BD Boisceinces, USA | PE |
3 | CD95 | DX2 | Caltag Laboratories, USA | PE |
4 | CD 95L | Alf-2.1 | InvitrogenTM, USA | PE |
5 | CD 86 | HA5.2B7 | Beckman Coulte, Francer | PE |
6 | HLA-DR | - | , Москва | PE |
7 | IL-1β | CRM56 | eBioscience, USA | FITC |
8 | IL-8 | R&D Systems, USA | FITC | |
9 | TNFα | IPM2 (188) | Beckman Coulter, France | PE |
10 | IL-6 | 7IL6 | BioErgonomics, France | PE |
11 | IL-12 | C8.6 | InvitrogenTM, USA | FITC |
12 | CD45 | HI30 | Caltag Laboratories, USA | FITC |
13 | CD14 | TuK4 | Caltag Laboratories, USA | PE |
14 | Vimentin | Vim 3B4 | Mouse IgG2a | DakoCytomation, Denmark |
15 | Recombinant human AnnexinV | - | InvitrogenTM, USA | FITC |
16 | Мышиные IgG1 | - | BD Boisceinces, USA | FIFC |
17 | Мышиные IgG2a | - | BD Boisceinces, USA | PE |
- оценка содержания в перитонеальной жидкости кальпротектина (S100A8/A9), МСР-1 и IL-8 методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland). Характеристика тест-систем представлена в Таблице 2.
Таблица 2.
Характеристика тест-систем для определения цитокинов, использованных при проведении исследования.
№ п/п | Цитокин | Фирма-производитель | Предел чувствительности Тест-системы |
1. | Кальпротектин, S100A8/S100A9 | Buhlmann Laboratories AG, Switzerland | 0,4 мкг/мл |
2. | МСР-1 | Bender MedSystems, Austria | 2,3 пг/мл |
3. | IL-8 | Bender MedSystems, Austria | 2,0 пг/мл |
- количественное определение экспрессии мРНК в эутопическом и эктопическом эндометрия методом полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в реальном времени на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA). В работе использовались следующие наборы праймеров и зондов: ОНКОСКРИН 12-Q для определения интенсивности экспрессии гена b-2-микроглобулина человека (ген домашнего хозяйства), ИММУНОСКРИН 8-Q для выявления интенсивности экспрессии гена человека ММР-2, ИММУНОСКРИН 10-Q для выявления интенсивности экспрессии гена человека TIMP-2, ИММУНОСКРИН 13-Q для выявления интенсивной экспрессии гена человека XIAP, ИММУНОСКРИН 16-Q для выявления интенсивности экспрессии гена человека МТ-1 (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия); наборы для количественного определения кДНК генов ММР-9, TIMP-1 и каспазы-3 (CASP-3) ( Био», г. Санкт-Петербург, Россия);
- культивирование in vitro эксплантов эутопического эндометрия женщин основных клинических групп наблюдения с обогащенной популяцией аутологичных перитонеальных макрофагов, или в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости при 37 0С и 5% СО2 в течение 24 часов, с последующим определением уровня экспрессии мРНК генов, регулирующих апоптоз и инвазию в эндометриальных биоптатах;
- получение супернатантов 24- часовых культур перитонеальных макрофагов;
- оценка влияния перитонеальной жидкости и супернатантов 24-часовых культур перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом на инвазию стромальных клеток эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в матригеле с использованием коммерческого набора BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences, USA)
Общее количество проведенных исследований составило 1540.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2003. Достоверность различий показателей в группах определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Проведенные нами исследования выявили ряд особенностей синтеза факторов, регулирующих апоптоз, в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом. Было установлено, что в эутопическом эндометрии при эндометриозе достоверно повышался синтез фактора XIAP (Х-сцепленного ингибитора апоптоза) по сравнению с аналогичным показателем в эндометрия здоровых женщин и в эктопическом эндометрии женщин с эндометриозом (22,51±9,62x103 копий пар/мкл – эутопический эндометрий женщин с эндометриозом; 0,38±0,18 x103 копий пар/мкл – контрольная группа; 2,90±1,59x103 копий пар/мкл - эктопический эндометрий, p<0,05 в обоих случаях). Отличительной характеристикой эктопического эндометрия являлся повышенный уровень экспрессии мРНК каспазы-3 (3,80±1,25x103 копий пар/мкл - эктопический эндометрий женщин с эндометриозом; 0,72±0,33x103 копий пар/мкл - эндометрий здоровых женщин, p<0,05; 0,38±0,09103 - эутопический эндометрий женщин с эндометриозом, p<0,05, p<0,01 соответственно), Как в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом, так и в ткани эндометриоидного очага отмечалось снижение уровня экспрессии мРНК МТ-1 по сравнению с таковым в контрольной группе (361,89±124,74x103 копий пар/мкл - эндометрий здоровых женщин; 46,56±23,76x103 копий пар/мкл - эутопический эндометрий женщин с эндометриозом; 42,364±17,42x103 копий пар/мкл - эктопический эндометрий женщин с эндометриозом, p<0,05 в обоих случаях).
Известно, что МТ-1 регулирует процессы клеточной пролиферации и роста и антиоксидантную защиту клеток (Theocharis S. E., 2004; Wichereck L., e. a., 2005). Низкий уровень синтеза МТ-1 может приводить к нарушению процессов, контролирующих развитие апоптоза, в эутопическом, и эктопическом эндометрии при эндометриозе.
Выявленное нами повышение синтеза анти-апоптотического фактора XIAP в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом может обуславливать повышенную устойчивость к апоптозу эндометриальных клеток при данном заболевании, что, по-видимому, облегчает их выживание при попадании в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса и может способствовать формированию эндометриоидных очагов. Однако в самом эндометриоидном очаге отсутствие значительных изменений синтеза XIAP и повышенная экспрессия мРНК каспазы-3 свидетельствует о преобладании активности проапоптотических факторов, что, вероятно, определяет доброкачественный характер роста эктопического эндометрия.
Важную роль в обеспечении процессов инвазии эндометриальных клеток в перитонеальной полости отводят тканевому протеолизу, осуществляемому ферментами из семейства матриксных металлопротеиназ (ММР) и их тканевых ингибиторов (TIMP) (Lu X. E., e. a.,2006; Braunmeier A. G., e. a., 2006; Hinsbergh V. W.M., 2006). Нами было выявлено, что в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом был усилен по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин синтез ММР-2 (0,89±0,27x103 копий пар/мкл – контрольная группа, 2,40±0,63x103 копий пар/мкл – эндометриоз, p<0,05) и ее специфического ингибитора TIMP-2 (4,09±0,74x103 копий пар/мкл – контрольная группа; 13,53±3,94x103 копий пар/мкл – эндометриоз, p<0,05), а также ингибитора ММР-9 - TIMP-1 (2,72±1,33x105 копий пар/мкл – контроль, 24,44±9,02x105 копий пар/мкл - эндометриоз соответственно, p<0,05). При этом синтез ингибиторов ММРs в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом существенно превышал уровень синтеза самих матриксных металлопротеиназ.
В очаге эндометриоза по нашим данным был значительно повышен по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин уровень экспрессии мРНК ММР-2 (0,89±0,27x103 копий пар/мкл – контрольная группа, 5,89±2,29 x103 копий пар/мкл – очаг эндометриоза, p<0,05); ММР-9 (0,27±0,16 x105 копий пар/мкл – контрольная группа, 13,78±5,04x105 копий пар/мкл - очаг эндометриоза, p<0,05) и TIMP-1 (2,72±1,33x105 копий пар/мкл – контрольная группа, 87,73±31,19x105 копий пар/мкл очаг эндометриоза, p<0,05). Баланс активности ферментов с про - и антипротеолитической активностью в эндометриоидном очаге изменялся по сравнению с эутопическом эндометрием женщин с эндометриозом и характеризовался практически одинаковым уровнем экспрессии мРНК как ММР-2, так и ее специфического ингибитора TIMP-2.
Таким образом, формирование и рост эктопического эндометрия сопровождаются значительными изменениями в регуляции апоптоза и инвазии. С другой стороны, особенности перитонеального микроокружения, в которое попадают клетки эндометрия, также значительно меняются при наружном генитальном эндометриозе.
По нашим данным, в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом было значительно снижено относительное содержание макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CD11b (85,14±1,57% - контроль, 71,97±2,30% - эндометриоз, p<0,001), CD49e (87,91±2,19% - контроль, 80,16±2,34% - эндометриоз, p<0,05), HLA-DR (87,35±2,28% - контроль, 78,35±2,43% - эндометриоз, p<0,05) и CD95L молекулы (60,62±2,42% - контроль 46,37±2,65% - эндометриоз, p<0,001) по сравнению с группой контроля. При дифференцированном анализе данных, характеризующих экспрессию функциональных рецепторов перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом, в зависимости от степени распространенности эндометриоидного процесса, было установлено, что выявленные нарушения отмечались как при 1-2 стадии эндометриоза (CD11b+ - 71,58±2,91%, p<0,001; HLA-DR+ - 80,59±2,37, p<0,05; CD95L+ - 45,62±3,42%, p<0,001), так и при 3-4 стадии заболевания (CD11b+ - 73,10±3,19%, p<0,01; HLA-DR+ - 71,97±6,23%, p<0,05; CD95L+ - 48,50±3,41%, p<0,01). Таким образом, вне зависимости от стадии эндометриоза при данной патологии снижено количество перитонеальных макрофагов, экспрессирующих рецепторы, участвующие в регуляции процессов межклеточного взаимодействия, презентации антигена и в индукции апоптоза.
Одновременно у женщин с наружным генитальным эндометриозом нами отмечалось значительное нарушение внутриклеточной продукции провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами. Было установлено, что при эндометриозе в перитонеальной жидкости достоверно повышалось по сравнению с показателями контрольной группы содержание макрофагов, продуцирующих внутриклеточно IL-1β (64,51±3,40% - контрольная группа, 74,69±2,90% - эндометриоз, p<0,05), TNFa (63,11±3,37% - контрольная группа, 74,77±1,95% - эндометриоз, p<0,01) и IL-8 (67,10±2,96% - контрольная группа, 75,13±2,03% - эндометриоз, p<0,05). При этом продукция IL-1β, IL-6 и IL-8 коррелировала со стадией патологического процесса и максимально усиливалась при 3-4 стадии эндометриоза (IL-1β+ - 80,53±3,46%, p<0,001; IL-6+ -66,25±2,70%, p<0,05 и IL-8+ - 78,17±1,70%, p<0,01).
Внутриклеточная продукция перитонеальными макрофагами женщин с эндометриозом другого провоспалительного цитокина - TNFα, по нашим данным, была повышена как при 1-2, так и при 3-4 стадии заболевания. Наши результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными о высоком содержании этого цитокина в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом (Harada T. 2001, Berkkanoglu M. Arici A., 2003; Grund E. M., 2008). Многие исследователи считают, что TNFα играет ключевую роль в механизмах патогенеза эндометриоза, вызывая развитие воспалительных реакций в перитонеальной полости и оказывая непосредственное влияние на рост эндометриоидных гетеротопий (Grund E. M., 2008). Выявленный нами факт усиленной внутриклеточной продукции TNFα перитонеальными макрофагами женщин с эндометриозом вне зависимости от степени распространенности патологического процесса свидетельствует о важной роли этого цитокина в механизмах формирования эндометриоидного очага.
В нашей работе мы также оценили содержание в перитонеальной жидкости некоторых цитокинов, влияющих на апоптоз и инвазию. Нами было установлено, что у женщин с наружным генитальным эндометриозом в перитонеальной жидкости повышена концентрация кальпротектина (0,44±0,17 мкг/мл – контрольная группа, 1,28±0,38 мкг/мл – эндометриоз, p<0,05), MCP-1 (308,12±29,87 пг/мл – контрольная группа, 528,40±51,45 пг/мл – эндометриоз, p<0,01) и IL-8 (6,19±3,41 пг/мл – контрольная группа, 19,09±5,00 пг/мл – эндометриоз, p<0,05). Дифференцированный анализ данных в зависимости от стадии эндометриоза показал, что повышение уровня цитокинов в перитонеальной жидкости также зависело от степени распространенности патологического процесса. Максимальные значения концентрации цитокинов отмечались преимущественно у женщин с 3-4 стадией заболевания (кальпротектин - 1,86±0,65 мкг/мл, p<0,05; MCP-,18±74,79 пг/мл, p<0,001; IL-8 - 27,73±9,12 пг/мл, p<0,05).
Многочисленными исследованиями было показано, что провоспалительные цитокины непосредственно усиливают процессы пролиферации и роста клеток (Bedaiwy M. A., 2007; Mier-Cabrera J., 2011, Herrmann Lavoie C., 2007, Gazvani R., Templeton A., 2002). Поэтому выявленные нами изменения в локальной продукции цитокинов могут создавать условия, благоприятные для эктопического роста эндометриальной ткани.
Для проверки этого предположения нами была проведена серия экспериментов in vitro, в которых мы оценили влияние макрофагов и цитокинов перитонеальной жидкости на апоптоз и инвазивный потенциал клеток эутопического эндометрия при эндометриозе. Мы культивировали экспланты эутопического эндометрия в присутствии обогащенной популяции аутологичных перитонеальных макрофагов, либо в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости в течение 24 часов. После окончания срока культивирования из эксплантов эндометрия выделяли эндометриальные стромальные клетки и оценивали уровень их апоптоза в аннексиновом тесте. Кроме того, в ткани эндометрия определяли характер экспрессии мРНК генов, регулирующих апоптоз и инвазию. Контролем служили показатели эндометрия, культивировавшегося только в присутствии среды RPMI 1640.
Нами было установлено, что у здоровых женщин воздействие макрофагов и перитонеальной жидкости на экспланты эутопического эндометрия приводило к увеличению количества апоптирующих эндометриальных стромальных клеток, находящихся на поздних/необратимых стадиях апоптоза и имеющих фенотип Annexin V+Pi+ (37,74±4,12% - контроль, 53,23±4,25% - при инкубации с макрофагами, 54,35±2,25% - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05, p<0,01, соответственно). Кроме того, в данной группе перитонеальные макрофаги усиливали синтез каспазы-3 в ткани эндометрия (15,69±5,91х103 копий пар/мкл - контроль; 39,51±9,64х103 копий пар/мкл - при воздействии макрофагов, p<0,05).
Известно, что у здоровых женщин рефлюксный эндометрий элиминируется из перитонеальной полости за счет индукции апоптоза (Dmowski P. W., e. a., 1998, Harada T., e. a. 2004, Taniguchi F., е. а., 2011). Полученные нами данные подтверждают это мнение и свидетельствуют о важной роли макрофагов и растворимых факторов перитонеальной жидкости в этом процессе.
В то же время и макрофаги, и перитонеальная жидкость здоровых женщин усиливали экспрессию в эндометрии мРНК МТ-1 (21,51±2,59х103 копий пар/мкл – контроль, 54,19±13,90 х103 копий пар/мкл – при воздействии макрофагов, 68,79±21,68х103 копий пар/мкл – при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05 в обоих случаях). Как известно, металлотионеины обладают ярко выраженными антиоксидантными свойствами и способны к нейтрализации целого ряда свободных радикалов (Inoue K.-I., е. а., 2009) .Учитывая то, что при индукции апоптоза формируется противовоспалительное микроокружение, усиление синтеза факторов, таких как МТ-1, подавляющих развитие воспалительных реакций, в апоптирующих клетках представляется вполне логичным.
Таким образом, выявленное нами in vitro усиление апоптоза в ткани эндометрия после инкубации с аутологичной перитонеальной жидкостью или макрофагами, по всей видимости, является физиологичным и отражает необходимую реакцию перитонеального микроокружения на эктопически перемещенный эндометрий.
При эндометриозе направленность воздействия перитонеальных макрофагов и перитонеальной жидкости на апоптоз клеток эутопического эндометрия была другой. После инкубации эндометрия с аутологичной перитонеальной жидкостью мы отмечали снижение апоптоза эндометриальных стромальных клеток преимущественно за счет клеток, находящихся на ранних/обратимых этапах апоптоза и имеющих фенотип Annexin V+Pi - (24,59±1,88% - контроль, 17,38±2,46% - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05). Кроме того, при эндометриозе инкубация эндометрия с аутологичными перитонеальными макрофагами приводила к резкому снижению экспрессии мРНК XIAP (18,52±8,20х103 копий пар/мкл - контроль, 13,02±4,03х103 копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,01), каспазы-3 (18,52±8,20х103 копий пар/мкл - контроль, 0,42±0,22х103 копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05) и MT-1 (43,95±7,88х103 копий пар/мкл - контроль, 13,02±4,03 х103 копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,001). Складывается впечатление, что выявленная нами низкая экспрессия функциональных рецепторов и особенно CD95L-молекул, по всей видимости, приводит к угнетению апоптоз-индуцирующей функции макрофагов, что, в свою очередь может обуславливать нарушение своевременной элиминации жизнеспособных эндометриальных клеток при их попадании в брюшную полость.
Факторы перитонеальной жидкости также оказывали непосредственное влияние и на инвазивный потенциал эутопического эндометрия при эндометриозе. Нами было установлено, что аутологичные перитонеальные макрофаги при воздействии на эутопический эндометрий пациенток с эндометриозом снижали синтез в ткани TIMP-2 (10,36±2,60х103 копий пар/мкл - контроль, 1,76±0,64х103 копий пар/мкл - при воздействии макрофагов, p<0,05) и TIMP-1 (10,12±3,91х103 копий пар/мкл - контроль, 0,52±0,25х103 копий пар/мкл - при воздействии макрофагов, p<0,05), а перитонеальная жидкость резко усиливала экспрессию в ткани эндометрия мРНК ММР-2 (4,83±2,40х103 копий пар/мкл –контроль, 20,44±6,19х103 копий пар/мкл - при воздействии перитонеальной жидкости, p<0,05).
Можно предположить, что основным фактором, определяющим инвазивные свойства клеток эндометрия при наружном эндометриозе, является измененный цитокиновый профиль перитонеальной жидкости, в частности за счет высокой продукции провоспалительных цитокинов макрофагами. Так, есть данные, что TNFα может вызывать снижение экспрессии TIMPs (Collette T., Maheux R., 2006). По-видимому, участие перитонеальных макрофагов в усилении инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе проявляется в угнетающем действии макрофагов на синтез антипротеоилитических ферментов TIMP-1 и TIMP-2, что может опосредованно усиливать инвазивный потенциал эндометриальных клеток. Выявленное нами прямое стимулирующее влияние перитонеальной жидкости при эндометриозе на синтез ферментов с протеолитическим действием согласуется с имеющимися литературными данными. Так, в работе Cosin R. с соавторами (2010) было установлено, что перитонеальная жидкость пациенток с эндометриозом индуцировала экспрессию в культуре эндометриальных клеток мРНК урокиназного активатора плазминогена (uPA), обладающего как и ММРs, протеолитическим действием. Характер влияния перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом может быть обусловлен выявленным нами высоким содержанием в перитонеальной жидкости факторов, участвующих в регуляции клеточной инвазивности, таких как IL-8, МСР-1 и кальпротектин, поскольку по литературным данным, эти растворимые факторы усиливают активность ММРs и инвазивный потенциал эндометриальных и опухолевых клеток в культуре (Mulayim N., 2004, Yong H. Y., Moon A., 2007, Lu Y., 2006).
Таким образом, как макрофаги, так и цитокины перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом могут повышать инвазивный потенциал эндометриальных клеток, попадающих в перитонеальную полость, за счет усиления активности MMPs, тем самым, способствуя формированию и росту эндометриоидного очага.
Подтверждением нашего предположения об усилении инвазивного потенциала клеток эндометрия под действием растворимых факторов перитонеальной жидкости могут служить данные, полученные нами при изучении инвазии эндометриальных клеток в матригеле. Культивирование стромальных клеток эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в присутствии либо супернатантов 24-часовых культур перитонеальных макрофагов женщин с эндометриозом, либо аутологичной перитонеальной жидкости резко усиливало коэффициент миграции стромальных эндометриальных клеток в матригеле (53,52±3,33% - спонтанная инвазия, 71,85±2,15% - инвазия в присутствии супернатантов культур макрофагов, 76,07±1,43% - инвазия в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости, p<0,01 в обоих случаях).
Таким образом, при наружном генитальном эндометриозе как в эутопическом, так и в эктопическом эндометрии нарушена регуляция апоптоза и инвазии, а в перитонеальной полости отмечаются значительные изменения локального иммунного ответа, проявляющиеся в сниженной экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами и повышении концентрации провоспалительных цитокинов и хемокинов преимущественно за счет усиления цитокин-продуцирующей активности макрофагов. Перитонеальные макрофаги и растворимые факторы перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом могут оказывать прямое стимулирующее действие на инвазивный потенциал эндометриальных клеток, а также приводить к снижению апоптоза в эндометрии, что по-видимому, лежит в основе фундаментальных патогенетических механизмов формирования и роста эндометриоидных очагов в перитонеальной полости.
ВЫВОДЫ.
1. Наружный генитальный эндометриоз вне зависимости от степени распространенности патологического процесса ассоциируется со снижением содержания перитонеальных CD11b+, HLA-DR+ и CD95L+ макрофагов и повышением уровня макрофагов, внутриклеточно продуцирующих TNFα. Для женщин с малыми формами эндометриоза характерно уменьшение пула CD49e+ макрофагов, с распространенными формами эндометриоза – повышение уровня IL-1β+, IL-8+ и IL-6+ макрофагов в перитонеальной жидкости по сравнению с таковым у здоровых женщин.
2. Отличительной характеристикой женщин с распространенными формами наружного генитального эндометриоза является повышенное содержание в перитонеальной жидкости кальпротектина, IL-8 и MCP-1 по сравнению с нормативными значениями контрольной группы.
3. Наружный генитальный эндометриоз характеризуется нарушением регуляции апоптоза в эндометрии, что проявляется низким уровнем экспрессии мРНК MT-1 в эутопическом и эктопическом эндометрии, высоким уровнем экспрессии мРНК XIAP в эутопическом и каспазы-3 – в эктопическом эндометрии по сравнению с аналогичными показателями здоровых женщин.
4. У женщин с эндометриозом в эутопическом эндометрии отмечается усиление синтеза протеолитического фактора MMP-2 и повышение уровня экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2. В очаге наружного генитального эндометриоза повышен уровень экспрессии мРНК MMP-2, MMP-9 и TIMP-1 относительно показателей эндометрия здоровых фертильных женщин.
5. Перитонеальные макрофаги и перитонеальная жидкость здоровых женщин in vitro повышают уровень вступивших в апоптоз и апоптирующих стромальных клеток в эутопическом эндометрии, а перитонеальные макрофаги усиливают экспрессию мРНК MT-1 и каспазы-3 в эксплантах аутологичного эндометрия. При наружном генитальном эндометриозе культивирование эксплантов эутопического эндометрия в присутствии перитонеальной жидкости приводит к снижению количества апоптирующих эндометриальных стромальных клеток, находящихся на ранних/обратимых этапах апоптоза (Annexin V+Pi+), а в присутствии перитонеальных макрофагов - к угнетению экспрессии мРНК MT-1, XIAP и каспазы-3.
6. При наружном генитальном эндометриозе перитонеальные факторы усиливают инвазивные свойства клеток эутопического эндометрия: растворимые факторы перитонеальной жидкости способствуют усилению экспрессии мРНК протеолитического фермента ММР-2 в эндометриальных эксплантах, а перитонеальные макрофаги снижают экспрессию мРНК специфических ингибиторов ММРs - TIMP-1 и TIMP-2 в ткани аутологичного эутопического эндометрия.
7. В системе матригель как перитонеальная жидкость, так и супернатанты 24-часовых культур перитонеальных макрофагов женщин с эндометриозом усиливают инвазию эндометриальных стромальных клеток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Рекомендуется определять в биоптатах эутопического эндометрия пациенток с подозрением на наружный генитальный эндометриоз экспрессию мРНК XIAP в качестве дополнительного диагностического критерия.
У пациенток с наружным генитальным эндометриозом для уточнения степени распространенности патологического процесса рекомендуется определять относительное содержание перитонеальных макрофагов, внутриклеточно продуцирующих IL-8, и при значениях показателей IL-8+ макрофагов более 73,2% диагностировать наружный генитальный эндометриоз 3-4 стадии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. , , Анциферова перитонеальных макрофагов в регуляции апоптоза клеток эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе // Вестник Военно-Медицинской академии.- 2009.-№1(25).- С.498.
2. , , Шишков экспрессии генов, регулирующих инвазивность и апоптоз, в эутопическом и эктопическом эндометрии женщин с наружным генитальным эндометриозом // Аллергология и иммунология. -2009.- т.10, №2.- С.252-253.
3. , , Филиппова механизмы, определяющие нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунологият.11, №4-5.- С.400-401.
4. , , Филиппова апоптоз на системном и локальном уровне у женщин с бесплодием, ассоциированным с трубным фактором и наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунологият.11, №4-5.- С.422-423.
5. , , Анциферова фенотипа и цитокинового профиля перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе // Проблемы репродукции.- 2009.- спец. выпуск.- С.179-180.
6. Antsiferova Yu. S., Sotnikova N. Yu., Posiseeva L. V., Filippova E. S., Eliseeva M. A. Immune mechanisms of endometriosis lesions formation//Abstracts book of 12th International Symposium for Immunology of Reproduction - Varna, Bulgaria, 2009.- P. 77-78.
7. Sotnikova N. Yu., Antsiferova Y. S., Posiseeva L. V., Shishkov D. N., D, Posiseev D. V., Filippova E. S. Mechanisms regulating invasiveness and growth of endometriosis lesions in rat experimental model and in humans // Fertility and Sterility -2010.-Vol.93.-N8.-P..
8. , , / Особенности регуляции инвазии и апоптоза клеток эутопического и эктопического эндометрия при эндометриозе// Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии.-2010.- № 2/1 (29). - С.214.
9. , Анциферова перитонеальных факторов в регуляции апоптоза и инвазии эндометриальных клеток у женщин с эндометриозом// Российский Иммунологический журнал, октябрь - декабрь 2010, Т.4(13), №4, - С.439.
10. , , Филиппова регуляции апоптоза в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан№5.- С. 71-74.
11. , , Красильникова цитокинов перитонеальной жидкости в регуляции инвазивных свойств эндометриальных клеток при эндометриозе // Мать и Дитя в Кузбассе. -2011. – спец. выпуск №1. – С.304-309.
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CD – cluster of differentiation (кластер дифференцировки)
MMP – матриксная металлопротеиназа
FITC – флюоресцеин изотиоционат
РЕ – фикоэритрин
Pi - пропидиум иодид
RT-PCR – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
TIMP – тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы
ИФА – иммуноферментный анализ
мАТ – моноклональные антитела
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
Мф – макрофаги
ПЖ – перитонеальная жидкость
МТ-1 – металлотионеин-1
XIAP – X-сцепленный ингибирующий апоптоз белок
