На правах рукописи
ЗАЦЕПИН
Виктор Викторович
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЦИСТАМИНА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-1β ПРИ ОСТРОМ РАДИАЦИОННОМ ПОРАЖЕНИИ
03.00.01 - радиобиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт - Петербург
2009
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. » МО РФ.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор
доктор медицинских наук профессор
Ведущая организация: НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ военной медицины МО РФ.
Защита диссертации состоится “___” ___________ 2009 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.11 при Военно-медицинской академии им. ( Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. .
Автореферат разослан “___” ___________ 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор
Актуальность. В настоящее время, в связи с расширением сфер использования источников ионизирующих излучений в различных областях жизнедеятельности человека, повышается актуальность защиты от поражающих факторов радиационной природы [, 2008; , , 2008; Pellmar T. S., Rockwell S., 2005]. Особую значимость мероприятия противорадиационной защиты будут иметь при возникновении аварийных ситуаций на объектах атомной энергетики, в случае применения ядерного оружия в современных войнах и локальных военных конфликтах, а также при использовании радиоактивных веществ в террористических или диверсионных целях [, , 1992; , 2001; и др., 2008; Cirincione J., 2002]. Важной представляется и проблема предотвращения лучевых поражений у экипажей длительных пилотируемых космических экспедиций [ и др., 2007]. В этих условиях технические решения – экранирование частей тела, создание гипоксических условий и т. п., не в состоянии в полной мере обеспечить достаточный уровень противолучевой защиты людей и дальнейший прогресс в этой области, может быть достигнут лишь при комплексном использовании физических методов защиты и применения медикаментозных средств, повышающих радиорезистентность организма [, , 2002; и др., 2009].
Среди средств медицинской противорадиационной защиты представлены препараты для профилактики радиационных поражений (радиопротекторы), средства повышения радиорезистентности организма, средства ранней патогенетической терапии лучевых поражений, средства профилактики и купирования первичной реакции на облучение и средства профилактики ранней преходящей недееспособности [ и др., 2001; , 2006; Walker R. J., 1988]. Отдельная группа лекарственных препаратов предназначена для профилактики внутреннего облучения и оказания помощи при попадании радиоактивных веществ внутрь организма.
Наиболее изученными и высокоэффективными медицинскими средствами противорадиационной защиты являются радиопротекторы [ Г, 2001; Giambarresi L. J., Walker R. J., 1989; Bump E., 1997]. Однако их применение ограничено сроками использования (исключительно до радиационного воздействия), часто – малой терапевтической широтой и, как следствие, достаточно высокой токсичностью в оптимальных радиозащитных дозах [, 2003; Landauer M. R., 1992; Seed T., 2005].
Этих недостатков практически лишены средства длительного поддержания повышенной радиорезистентности организма, но они менее эффективны, чем радиопротекторы [ и др., 2004; , 2007]. В связи с этим разрабатываются новые радиопротекторы и рецептуры, исследуется возможность повышения эффективности и безопасности существующих препаратов, изучается перспективность применения нескольких радиозащитных средств в дозах, при которых не проявляется их токсическое действие [ и др., 1994; Seed T. et al., 2002; Monoba M. et al., 2006]. Тем не менее, в настоящее время для практического применения в РФ подходят лишь радиопротекторы из групп аминотиолов и индолилалкиламинов: цистамин и препарат Б-190, а также средство длительного поддержания повышенной радиорезистентности организма – гепарин [, , 2008].
Другим важным направлением современной радиобиологии является разработка средств ранней патогенетической терапии радиационных поражений [ и др., 2008; Song J. Y., 2003; Weiss J. F., Landauer M. R., 2006]. В экспериментальных исследованиях доказана высокая эффективность экстракорпоральных методов детоксикации, гормональных препаратов, адаптогенов, стимуляторов регенерации, предшественников глутатиона и др. [ и др., 2008; Whitnall M. H., 2001; Mouthon M., 2002; Otsolic N. et al., 2007; Shukla J. et al., 2009]. В то же время многочисленные отечественные и зарубежные исследования в области создания новых средств лечения радиационных поражений доказывают высокую эффективность использования для этих целей стимуляторов гемопоэза, в частности цитокинов [, 2000; Neta R., 1991, 1997; Signore A., 2000; Meeren A. et al., 2002]. Одним из наиболее эффективных средств ранней терапии лучевых поражений из группы цитокинов является интерлейкин-1β [,1997; и др., 2002; и др., 2005; , 2009; Neta R., 1988, 1994; Singh V. K. et al., 2005].
Повышение эффективности медицинской противорадиационной защиты может быть достигнуто путем использования лечебно-профилактических схем, включающих в себя применение препаратов с различными механизмами противолучевого действия [Pellmar T. C. et al., 2005; Seed T., 2005]. Наиболее перспективной из таких схем представляется применение профилактических противолучевых средств – цистамина, Б-190 или гепарина до облучения со стимулятором гемопоэза интерлейкином-1β, внедренном в качестве средства экстренной терапии радиационных поражений. Однако, в литературе практически отсутствуют сведения о радиомодифицирующих эффектах совместного применения радиопротекторов и цитокинов. Вместе с тем, изучение эффектов и механизмов комплексного применения противолучевых препаратов и интерлейкина-1β является необходимым условием для их использования в современных схемах медицинской противорадиационной защиты.
Целью исследования явилась экспериментальная оценка эффективности комплексной схемы профилактики и ранней терапии радиационных поражений, включающей последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β, при остром внешнем радиационном воздействии.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:
1. Изучить влияние интерлейкина-1β на радиозащитную эффективность цистамина, препарата Б-190 и гепарина по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, подвергнутых внешнему относительно равномерному облучению в дозах СД 50-100/30.
2. Определить особенности постлучевых изменений костномозгового кроветворения в условиях профилактического применения цистамина и раннего терапевтического использования интерлейкина-1β.
3. Выявить модифицирующее влияние последовательного применения цистамина и интерлейкина-1β на динамику количества лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови после облучения.
4. Оценить функционально-метаболическое состояние нейтрофилов периферической крови у животных, подвергнутых радиационному воздействию на фоне профилактического введения цистамина и/или раннего терапевтического применения интерлейкина-1β.
5. Исследовать эффекты изолированного и совместного применения цистамина и интерлейкина-1β в отношении постлучевых изменений клеточности органов кроветворения, количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток у облученных животных.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка радиозащитной эффективности последовательного введения профилактических противолучевых средств и интерлейкина-1β при острых радиационных поражениях.
Показано, что интерлейкин-1β при его применении в ранние сроки после острого относительно равномерного облучения увеличивает радиопротекторную эффективность цистамина, препарата Б-190 и гепарина, что проявляется повышением выживаемости облученных мышей. Установлено, что наиболее выраженный радиозащитный эффект развивается при последовательном профилактическом применении цистамина за 20-30 мин до облучения и раннем терапевтическом использовании интерлейкина-1β через 15 мин послерадиационного воздействия.
Выявлено, что совместное применение цистамина и интерлейкина-1β позволяет снизить выраженность постлучевой цитопении в кроветворных органах и сохранить большее количество жизнеспособных гемопоэтических клеток, чем изолированное использование этих препаратов. Обнаружено позитивное влияние этой лечебно-профилактической схемы на динамику лейкопенического синдрома, развивающегося у мышей после радиационного воздействия. Установлено, что последовательное введение цистамина и интерлейкина-1β позволяет снизить глубину постлучевой лейкопении и ускорить темп восстановления количества нейтрофилов и лимфоцитов. Показано также, что в нейтрофилах периферической крови облученных животных, получавших цистамин и интерлейкин-1β, более быстро нормализуется содержание гликогена, активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.
Выявлено, что совместное введение данных препаратов предотвращает снижение количества CD3+ и CD19+ лимфоцитов в периферической крови и повышает число зрелых и промежуточных форм нейтрофилов в костном мозге облученных мышей. Кроме того, установлено, что цистамин и интерлейкин-1β при их последовательном применении увеличивают спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность клеток красного костного мозга и селезенки, а также стимулируют продукцию интерлейкина-2 спленоцитами облученных животных.
Практическая значимость. Экспериментально обоснован новый подход к повышению эффективности медицинской противорадиационной защиты путем последовательного применения радиопротекторов и средств ранней терапии радиационных поражений. Показана целесообразность использования комплексных схем, включающих введение цистамина, препарата Б-190 или гепарина до облучения и интерлейкина-1β после радиационного воздействия, для повышения радиорезистентности организма в условиях острого внешнего относительно равномерного облучения.
Предложен алгоритм экспериментальной оценки эффективности радиопротекторов и средств ранней терапии лучевых поражений, включающий последовательное изучение критериев выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности гемопоэтических клеток костного мозга, количества лейкоцитов циркулирующего пула, цитохимических показателей нейтрофилов, количественного состава и функциональной активности основных иммунокомпетентных клеток в периферической крови и кроветворных органах.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Последовательное введение цистамина до облучения и интерлейкина-1β в ранние сроки после лучевого воздействия увеличивает выживаемость лабораторных животных, подвергнутых внешнем острому относительно равномерному облучению, в большей степени, чем их изолированное применение.
2. Совместное применение цистамина и интерлейкина-1β позволяет снизить глубину постлучевых нарушений гемопоэза, предотвратить развитие цитопении в кроветворных органах, уменьшить выраженность лейкопенического синдрома, ускорить восстановление основных субпопуляций лимфоцитов и нейтрофилов, стимулировать функциональную и метаболическую активность этих клеток.
Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основе полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в ходе учебного процесса и научно-исследовательской работы на кафедрах военной токсикологии и медицинской защиты и военно-полевой терапии Военно-медицинской академии им. , а также лаборатории иммунофармакологии Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов ФМБА России.
В процессе выполнения диссертационного исследования подано и принято к использованию 3 рационализаторских предложения.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2007), Международной научно-практической конференции “Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения” (Северск, 2007), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008).
Связь диссертационного исследования с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. (темы НИР № 2 VMA.03.02.01.0808/0292 шифр «Гемопоэз», № VMA.02.02.02.0810/0192 шифр «Цитокин»).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлены 17 таблицы и 10 рисунка. Список литературы содержит 169 библиографических источников, из них 87 отечественных и 82 иностранных публикаций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на 1250 мышах-самцах (550 белых беспородных и 700 гибридах CBA x С57В1 первого поколения) массой 18-20 г. Животные были выращены в питомнике РАМН “Рапполово” и в ходе исследования находились на обычном виварном режиме.
Радиобиологические эксперименты, связанные с облучением лабораторных животных, проводили в рентгеновском кабинете кафедры военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии им. , в отделе моделирования радиационных поражений Научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ (Санкт-Петербург).
Общее относительно равномерное рентгеновское облучение мышей осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 при условиях: напряжение 180 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Cu + 1,0 мм Al, мощность дозы 0,282 мА/кг (52,2 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 50 см, облучение одностороннее, направление облучения: спина-грудь. Внешнее g-облучение мышей осуществляли на установке ИГУР-1 с источником 137Cs; мощность экспозиционной дозы составляла 0,703 мА/кг (130 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 1 м, облучение двухстороннее боковое. Дозиметрический контроль условий облучения осуществляли расчетным и ферросульфатным методами с последующей оценкой результатов на спектрофотометре.
В работе использовался рекомбинантный ИЛ-1b человека производства Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов ФМБА России (Санкт-Петербург). Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) через 15 мин после облучения, разведенным в 0,2 мл физиологического раствора. Препарат Б-190, выпущенный Научно-производственным центром «Фармзащита» ФМБА России, вводили внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг (4 мг/особь) за 15-20 мин до облучения в 0,5 мл 0,5 % раствора крахмала. Цистамин вводили в дозе 225 мг/кг (4,5 мг/особь) хлористоводородной соли за 20-30 мин до облучения в 0,2 мл физиологического раствора. Животные контрольных групп вместо цистамина получали 0,2 мл физиологического раствора в те же сроки, что и животные опытных групп. Гепарин производства Меркле ГмбХ (Германия) вводили внутрибрюшинно в дозе 5 ед./особь (250 ед./кг), разведенным в 0,2 мл физиологического раствора за 2 суток до лучевого воздействия. Животным контрольных групп вместо изучаемых препаратов вводили растворитель по той же схеме и в те же сроки, что и животным опытных групп.
Схема экспериментальной оценки радиозащитной эффективности изучаемых препаратов включала последовательное изучение показателей выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных, параметров радиочувствительности гемопоэтических клеток костного мозга, динамики клеток циркулирующего пула периферической крови, постлучевых изменений функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови и иммунологических показателей.
Изучение выживаемости и средней продолжительности жизни погибших животных проводили в течение 30 сут после облучения. По результатам оценки выживаемости при дозах СД50/30 рассчитывали фактор изменения дозы (ФИД) препаратов при их изолированном и последовательном введении.
Оценку числа и функциональной активности стволовых кроветворных клеток осуществляли методами эндогенного и экзогенного колониеобразования [Till J. E., McCulloch E. A., 1961] по количеству колоний, выросших на селезенках мышей на 9 сут после облучения.
Общее количество лейкоцитов определяли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского [Альтгаузен, 1964].
Цитохимическое определение миелопероксидазы проводили по методу R. K. Root, T. P. Stossel (1974) в модификации с соавторами (1999) при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-МПО. Интрацеллюлярное выявление щелочной фосфатазы осуществляли методом азосочетания [Kaplow L. S., 1955] при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-ЩФ. Цитохимическое выявление гликогена в нейтрофилах периферической крови проводили методом ШИК-реакции при помощи набора реагентов Диахим-ЦитоСтейн-ПАС. Реагенты для цитохимических исследований производились НПФ «Абрис+» (Санкт-Петербург).
Клеточность костного мозга, тимуса и селезенки облученных животных определяли в камере Горяева [ и др., 1988 ]. Абсолютное количество и относительное содержание Ly6+CD11b+, Ly6-CD11b+, CD3+, CD19+ оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител методом проточной цитофлюорометрии [Williams J. J., 1992]. Пролиферативную активность лимфоцитов изучали в реакции бласттрансформации путем определения ответа на КонА в дозах 0,5 и 1,0 мкг/мл, ЛПС в дозах 0,1 и 1,0 мкг/мл [, , 1998]. Способность спленоцитов синтезировать и продуцировать интерлейкина-2 в ответ на введение КонА в дозах 1 и 5 мкг/мл определяли по S. Gillis (1982).
Обследование экспериментальных животных с оценкой гематологических, цитохимических и иммунологических показателей проводили до облучения, а также через 1, 9, 18 и 30 сут после облучения.
Полученные данные подвергали обработке методами вариационной статистики с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Данные в таблицах представлены в виде X ± mx. Оценку различий средних значений в экспериментах с большим количеством животных и нормальным распределением средних величин проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическими методами с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Обработка результатов, представленных в относительных единицах, осуществлялась с помощью таблиц (1967). Вероятность p < 0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В условиях внешнего радиационного воздействия последовательное применение цистамина в дозе 225 мг/кг и раннее терапевтическое введение интерлейкина-1b в дозе 50 мкг/кг позволяет существенно увеличить выживаемость облученных животных (табл. 1).
ФИД, оцененный по показателю выживаемости облученных мышей при применении цистамина в дозе 225 мг/кг составил 1,5, при введении препарата Б-190 в дозе 200 мг/кг – 1,3, при применении гепарина за 2 сут до лучевого воздействия в дозе 250 ед./кг – 1,0, при раннем терапевтическом введении интерлейкина-1β в дозе 50 мкг/кг – 1,2. Следует отметить, что при последовательном введении препарата Б-190 с интерлейкином-1β показатель ФИД вырос до 1,5, а при последовательном применении гепарина с цитокином до 1,4. Наиболее эффективным оказалось последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β: ФИД, по критерию выживаемости облученных в дозе СД50/30 белых мышей, составляет 1,6.
Таблица 1
Влияние профилактического применения цистамина, препарата Б-190, гепарина и раннего терапевтического применения интерлейкина-1β на выживаемость (%) облученных белых беспородных мышей
Условия эксперимента | Дозы облучения, Гр | Условия эксперимента | Дозы облучения, Гр | Условия эксперимента | Дозы облучения, Гр | ||||||
7 (n=10) | 8 (n=10) | 9 (n=10) | 6,3 (n=10) | 6,8 (n=12) | 7,3 (n=15) | 7 (n=10) | 8 (n=12) | 9 (n=15) | |||
Облучение | 77,8 ± 5,2 | 11,1 ± 0,5 | 0,0 ± 0,5 | Облучение | 50,0 ± 5,0 | 25,0 ± 2,5 | 0,0 ± 0,5 | Облучение | 20,0 ± 2,0 | 8,3 ± 0,4 | 0,0 ± 0,5 |
Цистамин + облучение | 100,0 ± 5,0 | 55,6 ± 3,5 | 70,0 ± 4,0 | Б-190 + облучение | 60,0 ± 6,0 | 40,0 ± 4,0 | 33,3 ± 5,0 | Гепарин + облучение | 20,0 ± 2,0 | 16,7 ± 1,7 | 0,0 ± 0,5 |
Облучение + ИЛ-1 | 66,7 ± 5,3 | 44,4 ± 2,2 | 40,0 ± 3,0 | Облучение + ИЛ-1 | 60,0 ± 6,0 | 25,0 ± 2,5 | 20,0 ± 2,0 | Облучение + ИЛ-1 | 40,0 ± 4,0 | 13,3 ± 1,1 | 8,3 ± 0,4 |
Цистамин + облучение + ИЛ-1 | 100,0 ± 5,0 * # | 88,9 ± 4,5 * # " | 80,0 ± 4,5 * # " | Б-190 + облучение + ИЛ-1 | 90,0 ± 9,0 * # " | 83,3 ± 8,0 * # " | 46,7 ± 5,0 * # " | Гепарин + облучение + ИЛ-1 | 30,0 ± 3,0 * " | 41,7 ± 4,2 * # " | 13,3 ± 1,1 * # " |
* - p < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); " - p < 0,05 по сравнению с введением цистамина (Б-190, гепарина) и последующим облучением; # - p < 0,05 по сравнению с облучением и последующим введением интерлейкина-1β | |||||||||||
Примечание:
- Животных, получивших цистамин, гепарин или их сочетания с интерлейкином-1β, подвергали рентгеновскому облучению на установке РУМ-17.
- Животных, получивших препарат Б-190 и его сочетание с интерлейкином-1β, подвергали гамма-облучению на установке ИГУР-1.
- Данные представлены в виде M ± m
Полученные нами данные о высокой радиопротекторной эффективности цистамина согласуются с данными других авторов [, 1989; 1989]. Экспериментальные данные о высокой ранней терапевтической эффективности интерлейкина-1b в отношении выживаемости животных в условиях внешнего острого рентгеновского облучения, полученные нами, также подтверждаются многочисленными данными других исследователей [, 2000; , 2005].
По мнению ряда авторов, применение ИЛ-1b в ранние сроки после радиационного воздействия не только способствует повышению выживаемости облученных мышей, но и приводит к увеличению клеточности костного мозга и повышению числа КОЕ на селезенке по сравнению с животными контрольной группы [, 2002; Herve V., 1996].
Стимуляция пролиферативной активности гемопоэтических клеток-предшественников под влиянием раннего терапевтического введения интерлейкина-1b и, как следствие этого, увеличение числа КОЕ-С9 в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования было обнаружено и в наших исследованиях.
Таблица 2
Влияние профилактического введения цистамина и раннего терапевтического применения интерлейкина-1β на количество 9-ти суточных колониеобразующих единиц на селезенках белых беспородных мышей-самцов, выявленных в методике эндогенного колониеобразования
Условия облучения | Доза облучения, Гр | ||
6,5 | 7,5 | 8,5 | |
Облучение (контроль) | 16,7 ± 4,0 | 9,2 ± 4,2 | 6,0 ± 0,0 |
Цистамин + облучение | 21,2 ± 5,4 | 17,2 ± 4,8* | 17,3 ± 4,9* |
Облучение + ИЛ-1β | 21,7 ± 9,0 | 19,8 ± 7,8* | 6,7 ± 0,9 |
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 36,3 ± 3,4* # " | 32,0 ± 9,3* " | 25,8 ± 5,1* # " |
* - p < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); " - p < 0,05 по сравнению с введением цистамина и облучением; # - p < 0,05 по сравнению с облучением и введением интерлейкина-1β |
Показано, что последовательное применение цистамина и интерлейкина-1b способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и увеличению пролиферативной активности гемопоэтических клеток в большей степени, чем изолированное введение изучаемых препаратов (табл. 2).
ФИД, оцененный по критерию образования эндогенных 9-ти суточных колониеобразующих единиц на селезенках облученных мышей при изолированном применении цистамина в дозе 225 мг/кг составил 1,45, при терапевтическом введении интерлейкина-1β в дозе 50 мкг/кг – 1,13, при последовательном введении цистамина и раннем лечебном применении интерлейкина-1β – 1,64.
Содержание экзогенных колониеобразующих единиц в костном мозге облученных в дозе 2 Гр мышей-самцов гибридов (CBA x C57Bl) F1 при последовательном введении цистамина и раннем лечебном применении интерлейкина-1β превышало аналогичные значения в группах животных, получивших цистамин или интерлейкин-1β (табл. 3).
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 1. Содержание КОЕ-С9 на селезенке мышей гибридов (CBA x C57Bl) F1 после воздействия различных доз облучения на фоне применения цистамина и интерлейкина-1β (в перерасчете на 106 мкц)
* - p < 0,05 по сравнению с облучением; " - p < 0,05 по сравнению с введением цистамина; # - p < 0,05 по сравнению с введением интерлейкина-1β
Таким образом, и по критерию экзогенного колониеобразования последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β было более эффективным, чем изолированное использование отдельных препаратов.
Повышение пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток, в свою очередь, приводит к ускорению темпов восстановления нарушенного вследствие радиационного воздействия гемопоэза и, как итог – увеличению числа зрелых клеток в периферической крови.
|
|
|
Подтверждением возможности существования подобного механизма реализации ранней терапевтической активности интерлейкина-1β могут являться и данные, полученные нами при изучении показателей периферической крови у облученных животных (рис. 2).
|
Рис. 2. Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови мышей гибридов (CBA x C57Bl) F1, подвергнутых облучению в дозе 8 Гр, на фоне применении цистамина и интерлейкина-1β
Так, установлено, что в условиях внешнего облучения в дозах СД70/30 последовательное применение цистамина и интерлейкина-1b более эффективно снижает выраженность ранней постлучевой лейко - и нейтрофилопении и увеличивает темп восстановления количества клеток белой крови, чем изолированное применение интерлейкина-1b. Общее число лейкоцитов в периферической крови у облученных в дозе 8 Гр мышей-гибридов, получивших оба препарата, на 1 сут после облучения в 2 раза, на 9 сут – в 4 раза, на 18 сут – в 2,4 раза, а к 30 сут после облучения – почти в 2 раза превышало аналогичные показатели контрольной группы, хотя и не достигало значений физиологической нормы интактных мышей.
Динамика числа нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови облученных животных, получивших оба препарата, практически полностью повторяла изменения, регистрировавшиеся при изучении общего числа лейкоцитов. Однако в ранние сроки наблюдения в крови животных, получивших и цистамин и интерлейкин-1b, отмечен нейтрофилез: содержание нейтрофилов в 1,4 раза превышало данный показатель интактных мышей и в 2,8 раза – число клеток у животных контрольной группы. Следует отметить, что эффект в отношении клеток белой крови при использовании данной схемы введения цистамина и интерлейкина-1b реализовывался, в основном, за счет влияния на нейтрофильный пул лейкоцитов периферической крови.
Ускорение темпов восстановления гемопоэза у облученных животных под влиянием раннего терапевтического применения интерлейкин-1b было показано также в работе (2004).
Одним из возможных механизмов радиомодифицирующего действия интерлейкина-1β является стимуляция им факторов неспецифической радиорезистентности [, 2002; , 2009]. Выраженное активирующее действие рекомбинантного интелейкина-1β на показатели, характеризующие функционально-метаболическую активность нейтрофилов, являющихся наиболее чувствительными и мобильными клетками системы неспецифической резистентности организма, выявлено и в ходе проведенных нами исследований.
В частности установлено, что лечебное введение интерлейкина-1b увеличивало количество гликогена в нейтрофилах периферической крови у облученных животных в ранние сроки после воздействия, а с 9 сут – достоверно превышало показатели соответствующего нелеченного контроля (рис. 3). При этом профилактическое применение цистамина практически не оказывало влияния на содержание гликогена в нейтрофилах облученных мышей.
|
|
|
Рис. 3. Динамика содержания гликогена в нейтрофилах периферической крови мышей гибридов (CBA x C57Bl) F1, подвергнутых облучению в дозе 8 Гр, на фоне применения цистамина и интерлейкина-1β
Наиболее выраженный эффект на количество гликогена в нейтрофилах периферической крови оказывало последовательное введение цистамина и интерлейкина-1b.
Также установлено, что последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β практически полностью предотвращало вызванное ионизирующим излучением снижение активности миелопероксидазы в нейтрофилах, а, начиная с 12-14 сут эксперимента активность данного фермента превышала показатели мышей контрольной группы. Кроме того, на протяжении всего срока наблюдения данный показатель у животных, получивших и цистамин и интерлейкин-1β, достоверно превышал аналогичные значения других опытных групп.
Результаты изучения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах подвергшихся облучению животных свидетельствуют о высокой радиопротекторной активности цистамина и о выраженном стимулирующем влиянии интерлейкина-1β в отношении функционально-метаболического состояния нейтрофилов периферической крови и их костномозговых предшественников. Последовательное введение препаратов достоверно увеличивает активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови по сравнению с контролем и опытными группами животных, получивших цистамин и интерлейкин-1β изолированно, на протяжении всего срока наблюдения.
В ходе дальнейших исследований было установлено, что последовательное применение цистамина и интерлейкина-1b достоверно снижало глубину клеточного опустошения в красном костном мозге (рис. 4) и селезенке мышей на 1 сут после облучения, а также позволяло практически восстановить их клеточность до исходного значения к 9 сут наблюдения.
Следует отметить, что последовательное введение препаратов не снижало глубину клеточного опустошения в тимусе мышей на 1 сут после облучения, но восстанавливало клеточность органа к 9 сут наблюдения до значений необлученного фона.
|
|
Рис.4. Динамика клеточности красного костного мозга у мышей гибридов (CBA x C57Bl) F1, подвергнутых облучению в дозе 8 Гр, на фоне применения цистамина и интерлейкина-1β
Установлено также, что последовательное применение цистамина и интерлейкина-1b в значительной степени предотвращало снижение количества Т - и В- лимфоцитов в периферической крови, а также оказывало позитивное влияние на количество Т - и В - лимфоцитов в селезенке облученных в дозе 8 Гр мышей (табл. 3).
Таблица 3
Влияние профилактического введения цистамина и раннего терапевтического введения интерлейкина-1β на динамику клеточных маркеров селезенки у мышей-гибридов (CBA x C57Bl) F1, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 8 Гр, млн./мл
Показатель | Условия облучения | Сроки исследования, сут | ||||
До облучения | Сроки исследования после облучения, сут | |||||
1 | 9 | 18 | 30 | |||
CD3+ | Облучение (контроль) | 36,2 ± 2,3 | 7,8 ± 1,9 | 4,3 ± 0,4 | 7,5 ± 2,4 | - |
Цистамин + облучение | 8,8 ± 2,8 | 16,0 ± 2,8*# | 34,9 ± 7,9*# | 17,2±1,5 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 9,1 ± 2,1 | 6,0 ± 1,0* | 20,3 ± 5,0* | 17,4±3,2 | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 9,1 ± 1,9 | 17,0 ± 4,0*# | 20,5 ± 3,0*" | 19,2±3,9 | ||
CD19+ | Облучение (контроль) | 28,7 ± 1,1 | 1,1 ± 0,3 | 1,0 ± 0,2 | 1,1 ± 0,3 | - |
Цистамин + облучение | 0,3 ± 0,1 | 1,2 ± 0,3# | 3,7 ± 0,4*# | 10,7±2,6 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 1,1 ± 0,1 | 0,5 ± 0,1 | 1,6 ± 0,3 | 10,3±3,2 | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 1,4 ± 0,3" | 1,3 ± 0,3# | 5,6 ± 1,5*# | 10,9±3,0 | ||
Ly6+CD11b+ | Облучение (контроль) | 1,3 ± 0,3 | 4,6 ± 0,9 | 0,1 ± 0,1 | 22,9 ± 4,9 | - |
Цистамин + облучение | 7,9 ± 1,6 | 0,1 ± 0,1 | 21,6 ± 4,4 | 2,8±0,4 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 2,5 ± 0,6 | 0,1 ± 0,1 | 9,8 ± 1,9* | 4,1±1,3 | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 5,5 ± 0,7#" | 0,5 ± 0,1*#" | 18,4 ± 4,1# | 1,3±0,2#" | ||
* - p < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); " - p < 0,05 по сравнению с введением цистамина и последующим облучением; # - p < 0,05 по сравнению с облучением и последующим введением интерлейкина-1β |
Кроме того, последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β увеличивало содержание незрелых форм гранулоцитов в селезенке облученных в дозе 8 Гр мышей-гибридов (CBA x C57Bl) F1 на 1 (в 6 раз по сравнению с контролем) и 9 сут исследования (в 4 раза по сравнению с контролем). До 18 сут наблюдения количество зрелых клеток в селезенке облученных мышей, которым вводили цистамин и интерлейкин-1β, было достоверно выше, чем в группе животных, получивших только интерлейкин-1β, а на 9 сут после облучения превышало аналогичные показатели и во всех остальных группах.
Также установлено, что последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β повышало число зрелых форм нейтрофилов в костном мозге облученных мышей-гибридов на протяжении всего срока наблюдения. Кроме того, последовательное введение препаратов также предотвращало снижение числа промежуточных форм гранулоцитов в костном мозге мышей после облучения.
В результате проведенных нами исследований было установлено, что лучевое воздействие приводило к резкому снижению количества Т - и В - лимфоцитов в периферической крови и селезенке облученных мышей в ранние сроки после облучения. Применение интерлейкина-1b как изолированно, так и с цистамином, практически не оказывало позитивного влияния на содержание CD3+ и CD19+ клеток в периферической крови и селезенке у облученных мышей на 1 сут наблюдения по сравнению с контролем.
Установлено, что раннее лечебное применение интерлейкина-1β не влияло на спонтанную продукцию спленоцитами ИЛ-2 на протяжении всего эксперимента, однако позволяло увеличить продукцию данного цитокина в ответ на введение КонА в дозах 1 и 5 мкг/мл в ранние сроки после лучевого воздействия. Вместе с тем, последовательное применение цистамина и интерлейкина-1β предотвращало постлучевое снижение спонтанной продукции ИЛ-2 спленоцитами облученных животных, а также увеличивало на 9 сут после облучения митоген-индуцированную продукцию ИЛ-2 по сравнению с контрольной группой и группами мышей, получивших только цистамин или интерлейкин-1β.
При изучении функционального состояния клеток костного мозга, селезенки и тимуса облученных животных установлено, что введение цистамина, как и лечебное введение интерлейкина-1, не оказывало позитивного влияния на спонтанную пролиферацию клеток иммунокомпетентных органов животных в ранние сроки после облучения (табл. 4). В то же время, последовательное введение цистамина и интерлейкина-1β увеличивало спонтанную пролиферативную активность клеток костного мозга у облученных мышей на 1 сут после облучения по сравнению с контролем и группами животных, получивших данные препараты изолированно. Спонтанная пролиферативная активность спленоцитов у облученных мышей, получивших и цистамин и интерлейкин-1β, на 1 сут наблюдения превышала показатели контроля и группы мышей, получивших интерлейкин-1β, но не отличалась от аналогичного значения в группе животных, получивших только цистамин.
Оценка пролиферативной активности Т - и В-лимфоцитов была проведена в реакции бласттрансформации. Раннее лечебное введение интерлейкина-1β как изолированно, так и в сочетании с цистамином, практически не вызывало изменений стимулированной активности T - и В-лимфоцитов в ответ на введение субоптимальных доз митогенов (КонА в дозе 0,5 мкг/мл и ЛПС в дозе 0,1 мкг/мл, соответственно). Активирующее действие последовательного введения цистамина и ИЛ-1 на индуцированную пролиферативную активность T - и В-лимфоцитов удалось получить только при применении максимальных доз митогенов (КонА в дозе 1,0 мкг/мл и ЛПС в дозе 1,0 мкг/мл). Возможно, что низкая митоген-индуцированная пролиферативная активность лимфоцитов при изолированном введении интерлейкина-1β и последовательном применении цистамина и интерлейкина-1β уже на 1 сут после облучения связана с прохождением пика пролиферативной активности лимфоцитов в более ранний период, чем без индукции под влиянием экзогенно введенного ИЛ-1.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что совместное применение цистамина и интерлейкина-1β позволяет снизить выраженность постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, предотвратить развитие цитопении в кроветворных органах, уменьшить выраженность лейкопенического синдрома, ускорить восстановление основных субпопуляций лимфоцитов и нейтрофилов, стимулировать функциональную и метаболическую активность этих клеток.
Орган | Условия облучения | Сроки исследования | ||||
До облучения | Сроки исследования после облучения, сут | |||||
1 | 9 | 18 | 30 | |||
Костный мозг | Облучение (контроль) | 32,2 ± 4,5 | 6,6 ± 1,2 | 49,3 ± 1,9 | 23,6 ± 7,7 | - |
Цистамин + облучение | 9,1 ± 2,2 | 28,9 ± 7,4 * | 24,1 ± 3,6 | 8,8 ± 2,2 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 8,7 ± 1,9 | 18,4 ± 3,8 * | 26,7 ± 3,9 | 9,8 ± 1,9 | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 16,4 ± 2,6* # " | 26,1 ± 5,8 * | 25,0 ± 3,6 | 16,1 ± 4,0 # " | ||
Селезенка | Облучение (контроль) | 3,9 ± 1,1 | 1,3 ± 0,3 | 19,5 ± 2,9 | 26,9 ± 5,3 | - |
Цистамин + облучение | 2,4 ± 0,4* | 3,3 ± 0,9 * | 16,2 ± 3,1 * | 3,7 ± 1,2 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 1,5 ± 0,3 | 10,1 ± 2,1 * | 16,5 ± 3,0 * | 8,3 ± 3,2 " | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 2,5 ± 0,3*# | 7,7 ± 1,6 *" | 18,9 ± 0,7 * | 12,4 ± 3,9 " | ||
Тимус | Облучение (контроль) | 52,2 ± 5,9 | 2,3 ± 0,1 | 55,5 ± 5,7 | 18,4 ± 2,0 | - |
Цистамин + облучение | 2,9 ± 0,2 | 45,3 ± 5,1 | 40,8 ± 9,9* | 55,3 ± 7,1 | ||
Облучение + ИЛ-1β | 2,3 ± 0,5 | 55,2 ± 4,9 | 41,3 ± 2,4* | 40,8 ± 7,9 | ||
Цистамин + облучение + ИЛ-1β | 2,5 ± 0,6 | 50,8 ± 7,0 | 42,2 ± 2,8* | 52,7 ± 4,7 | ||
* - p < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); " - p < 0,05 по сравнению с введением цистамина и последующим облучением; # - p < 0,05 по сравнению с облучением и последующим введением интерлейкина-1β |
Таблица 4
Влияние профилактического введения цистамина и раннего терапевтического введения интерлейкина-1β на спонтанную пролиферацию клеток костного мозга, селезенки и тимуса у мышей-гибридов (CBA x C57Bl) F1 после облучения в дозе 8 Гр, тыс. имп./мин
ВЫВОДЫ
1. Применение интерлейкина-1b в ранние сроки после радиационного воздействия позволяет на 25-40% увеличить радиопротекторную эффективность цистамина, препарата Б-190 и гепарина, оцененную по выживаемости белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых внешнему относительно равномерному облучению в дозах СД50-100/30. Наиболее эффективной из изученных лечебно-профилактических схем противорадиационной защиты является последовательное введение цистамина в дозе 225 мг/кг за 20-30 мин до облучения и интерлейкина-1b в дозе 50 мкг/кг через 15 мин после радиационного воздействия: ФИД по критериям выживаемости облученных в дозах СД50/30 мышей составляет 1,6.
2. В условиях внешнего радиационного воздействия как изолированное, так и совместное применение цистамина и интерлейкина-1b способствует снижению выраженности постлучевых нарушений гемопоэза и увеличению пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток. Наибольшее количество колониеобразующих единиц на селезенках облученных мышей в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования определяется при последовательном введении цистамина за 20-30 мин до облучения и интерлейкина-1b через 15 мин после радиационного воздействия.
3. При рентгеновском облучении мышей в дозах СД70/30 последовательное профилактическое введение цистамина и раннее терапевтическое использование интерлейкина-1b более эффективно предотвращает развитие ранней постлучевой лейко-, лимфо - и нейтрофилопению и значительнее ускоряет темп восстановления количества клеток белой крови, чем изолированное применение этих препаратов.
4. Стимулирующий эффект совместного применения цистамина и интерлейкина-1b в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате облучения, проявляется в предотвращении снижения содержания миелопероксидазы и щелочной фосфатазы, поддержании более высокого уровня гликогена в клетках.
5. Последовательное введение цистамина до облучения и интерлейкина-1b после радиационного воздействия позволяет значительно уменьшить выраженность постлучевой цитопении в красном костном мозге и селезенке, предотвратить критическое снижение числа CD3+ и CD19+ лимфоцитов в периферической крови и селезенке, сохранить на физиологическом уровне количество зрелых и промежуточных форм гранулоцитов в костном мозге, а также увеличить функциональную активность миелокариоцитов и спленоцитов у мышей мышей-гибридов (CBA x C57Bl) F1, облученных в дозе 8 Гр.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Данные о высокой радиозащитной эффективности последовательного применения цистамина и интерлейкина-1b в отношении облученных мышей позволяют рекомендовать дальнейшее изучение комплексных схем профилактики и ранней терапии радиационных поражений в экспериментах на крупных лабораторных животных.
2. Для экспериментальной оценки радиозащитной эффективности средств профилактики и ранней терапии радиационных поражений может быть рекомендован алгоритм, включающий последовательное изучение выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности стволовых кроветворных клеток, количества лейкоцитов циркулирующего пула, цитохимических характеристик нейтрофилов периферической крови, клеточности органов кроветворения, числа и функциональной активности иммунокомпетентных.
СПИСОК РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Аксенова совершенствования средств и методов профилактики радиационных поражений / , , // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2006. – № 1 (15). – Приложение. – С. 404-405.
2. Гребенюк , средства и методы медицинской противорадиационной защиты / , , // Медицина катастроф. – 2007. – № 3(59). – С. 32-35.
3. Зацепин побочных токсических эффектов цистамина путем его совместного применения с интерлейкином-1β // Вопросы обеспечения химической безопасности в Российской Федерации: Сб. науч. трудов – СПб.: ООО “Изд-во ФОЛИАНТ”, 2007. – С. 112-114.
4. Лукашин и гепариноиды: источники получения, структура и биологические эффекты / , , // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2007. – № 4 (20). – С. 141-147.
5. Зацепин оценка эффективности изолированного и совместного применения интерлейкина-1β и Бестима в качестве средств ранней терапии радиационных поражений / , // Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения: Материалы IV междунар. науч.-практ. конф. – Северск-Томск: , 2007. - С. 30-31.
6. Зацепин раннего терапевтического применения интерлейкина-1β на выживаемость и костномозговое кроветворение облученных мышей / , , // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2008. – № 1 (21). – Приложение. – С. 135–138.
7. Гребенюк раннего терапевтического применения интерлейкина-1β на количество иммунокомпетентных клеток в периферической крови, тимусе, селезенке и костном мозге облученных мышей / , , // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2008. – № 3 (23). – Приложение. – С. 29–35.
8. Антушевич оценка эффективности Беталейкина, Бестима и препаратов глутатиона в качестве средств ранней терапии радиационных поражений / , , // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2008. – № 3 (23). – Приложение. – С. 207–208.
9. Зацепин интерлейкина-1β на радиозащитную эффективность цистамина / // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2008. – № 3 (23). – Приложение. – С. 212–213.
10. Гребенюк противорадиационная защита специалистов аварийно-спасательных формирований / , , // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2008. – № 4. – С. 13–18.
