Неофициальный перевод материала штаб-квартиры ВОЗ, опубликованного по адресу:
http://www. who. int/entity/wer/2013/wer8804.pdf
Выявление вирусов гриппа субтипа A при помощи полимеразной цепной реакции: Программа ВОЗ по внешней оценке качества – итоговый анализ за 2012 год
Введение
Глобальный вирусологический надзор за гриппом ведется посредством Системы по эпиднадзору за гриппом и принятию ответных мер (ГСЭГОМ) свыше 50 лет[1]. В настоящее время 140 учреждений в 110 странах признаются ВОЗ в качестве Национальных центров по гриппу (НЦГ). Лабораторная сеть также включает в себя 6 Сотрудничающих центров ВОЗ, 4 Головных контрольных лабораторий и специальные группы, создаваемые для решения определенных возникающих вопросов.
При постоянной эволюции вирусов гриппа, включая время от времени вызывающие заражение людей циркулирующие человеческие и нечеловеческие вирусы с пандемическим потенциалом, необходимо поддерживать регулярный эпиднадзор и мощный лабораторный диагностический потенциал. Благодаря технологическому прогрессу доступность использования молекулярных методов быстрого и чувствительного выявления вирусов стала шире, и оно приобрело значимость - особенно там, где оборудование для культивирования вируса не общедоступно. С учетом весьма важной потребности в обеспечении качества лабораторного тестирования, в 2007 была начата работа Программы ВОЗ по внешней оценке качества (EQAP) проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для вируса гриппа субтипа A. Она стала средством слежения за качеством и сопоставимостью показателей работы лабораторий-участниц в области рутинной диагностики и эпиднадзора за сезонными и другими новыми вирусами гриппа, например, за вирусом гриппа птиц A(H5N1) и пандемическим вирусом гриппа A(H1N1)pdm09. Сводные данные о показателях работы лабораторий-участниц по панелям с 1 по 10 (с 2007 по 2011 год) сообщались в Еженедельном эпидемиологическом бюллетене[2],[3], [4], [5] .
В 2012 году данный проект продолжал свою работу при координации со стороны Глобальной программы по гриппу ВОЗ, реализуемой референс-лабораторией по гриппу H5 и Национальным центром по гриппу в Центре охраны здоровья (Специальный административный район Китая Гонконг) и при поддержке Сотрудничающих центров ВОЗ по научным исследованиям и референс-диагностике гриппа, других референс-лабораторий по гриппу H5 и региональных бюро ВОЗ.
В настоящее время программа проводит тестирование раз в год. В данном докладе обобщаются результаты оценки одиннадцатой вирусной панели, которая направлялась лабораториям-участницам с апреля 2012 года по июнь 2012 года.
Подготовка панели
Сублимированные инактивированные гамма-излучением вирусы гриппа A и B были отправлены лабораториям-участницам. Вирусы были выращены в культуре клеток почек собак Мадин-Дарби (MDCK), инактивированных путем иррадиации гамма-излучением, а затем подготовленных так, как описано ранее2, 3, ,4, 5.
Состав панели
Одиннадцатая панель состояла из 10 зашифрованных образцов, представленных вирусами гриппа в различной концентрации, и в том числе вирусом гриппа A(H5N1) генетической клады 2.3.2.1, гриппа A(H3N2), A(H1N1)pdm09, A(H9N2) и гриппа B. В эту панель был включен образец, не содержащий вируса. Подробная информация о составе панели приведена в таблице 1. Участникам были даны указания восстановить до тестирования каждый образец при помощи предусмотренного восстанавливающего буфера. Был также приложен вопросник по используемым методам выявления и генным мишеням.
Распространение панели и ответы участников
До того, как панели были отправлены, к участию были приглашены НЦГ и другие национальные лаборатории по гриппу. Одиннадцатая панель отправлялась при помощи курьерской службы с апреля 2012 года по июнь 2012 года при температуре окружающей среды из референс-лаборатории по гриппу H5 и Национального центра по гриппу в Центре защиты здоровья в САР Гонконг в 170 лабораторий-участниц в 134 странах 6 регионов ВОЗ, как было описано ранее2, 3, 4, 5.
Большая часть лабораторий получила образцы панели в течение недели после отправки: 125 из ,5%) и 163/,9%) сообщили результаты до последнего дня.
Таблица 1. Состав панели и результаты Национальных центров по гриппу и других лабораторий в Программе ВОЗ по внешней оценки качества выявления вирусов гриппа A и B, панельгод)
Вирусы гриппа | Штамм/кладаа | Номер образца | Копий на μlb | Количество (%) лабораторий, правильно идентифицировавших образец (число лаборатории равно 163) |
A(H5N1) | 2.3.2.1 | V04-2012 | 6,690 x 101 | ,5) |
A(H5N1) | 2.3.2.1 | V05-2012* | 6,352 | ,9) |
A(H5N1) | 2.3.2.1 | V07-2012 | 4,678 x 102 | ,3) |
A(H5N1) | 2.3.2.1 | V08-2012 | 4,505 x 101 | ,4) |
A(H5N1) | 2.3.2.1 | V09-2012 | 4,505 x 101 | ,0) |
A(H3N2) | Вирус, подобный вирусу A/Victoria/361/2011 | V03-2012 | 2,890 x 101 | ,1) |
A(H1N1)pdm09 | Вирус, подобный вирусу A/California/7/2009 | V10-2012 | 6,433 x 101 | ,7) |
A(H9N2) | Вирус A/Hong Kong/33982/2009 | V01-2012* | 1,646 x 101 | ,6) |
Грипп B | Вирус, подобный вирусу B/Wisconsin/1/2010 (линия Ямагата) | V06-2012 | 3,930 x 101 | ,5) |
Отрицательный | н/д | V02-2012 | н/д | ,7) |
а В основу номенклатуры вирусов гриппа A(H5N1) положен ген гемагглютинина. Дополнительную информацию см. по адресу: http://www. who. int/influenza/gisrs_laboratory/h5n1_nomenclature/en/
b Измерено при помощи ПЦР в реальном времени через 5 дней хранения вирусной РНК при 25°C.
* Представляющие сложность образцы не учитывались при оценке.
н/д – нет данных.
Результаты работы лабораторий
С учетом тех же самых критериев, что и для панелей 1-102, 3, 4, 5, 109 из ,9%) лабораторий-участниц вернули правильные результаты по всем 10 образцам. В целом,,6%) участников вернули один неправильный результат, а,6%) вернули более 1 неправильного результата (таблица 2). Среди 159 участников, сообщивших о результатах по гриппу A(H5), ,4%) верно идентифицировал все 5 образцов вируса гриппа A(H5). Показатели работы лабораторий-участниц по регионам ВОЗ продемонстрированы на рисунке 1.
Семь лабораторий-участниц сообщили о положительных результатах для отрицательного образца (V02-2012), и показатель числа ложноположительных результатов составил 4,3% (таблица 1).
Показатели работы лабораторий-участниц в программе по внешней оценке качества, 11 панель (2012 год) | |
Показатели работы | Количество (%) лабораторий (163) |
10 образцов правильно | ,9) |
9 образцов правильно | 27 (16,6) |
6-8 образцов правильно | 21 (12,9) |
<6 образцов правильно | 6 (3,7) |
Были включены два разных вируса гриппа A(H5N1). Для первого вирусного образца (V04-2012) и соответствующего десятикратно разведенного образца (V05-2012) показатели числа правильных ответов были равны, соответственно, ,5%) и ,9%). Для второго вирусного образца (V07-2012) и двух идентичных десятикратно разведенных образцов (V08-2012) и (V09-2012) показатели числа правильных ответов были равны, соответственно, ,3%), ,4%) и %).
Что касается образца (V03-2012) вируса гриппа A(H3N2) и образца (V10-2012) вируса гриппа A(H1N1)pdm09, то правильные результаты сообщили, соответственно, ,1%) и ,7%) лабораторий. По образцу вируса гриппа B линии Ямагата (V06-20,5%) участников сообщили правильные результаты.
Чтобы в порядке эксперимента определить возможности лабораторий-участниц, впервые был включен образец вируса гриппа A(H9) (V01-2012). Наряду образцом вируса гриппа A(H5) с низкой концентрацией (V05-2012 с 6,352 копий/литр)8 эти два представляющих сложность образца не учитывались при оценке в одиннадцатой панели. Показатель выполнения для участников, которые вернули правильные результаты по всем 8 оценивавшимся образцам в одиннадцатой панели, составил 82,2% (134 из 163), в то время как 87,7% (143 из 163) участников вернули правильные результаты по всем 4 оценивавшимся образцам гриппа A(H5). Сравнение показателей работы лабораторий для всех панелей показано на рисунке 2.
В этой панели 54 из ,1%) участников сообщили неправильные результаты. Подробности представлены в таблице 3.
Методы выявления
Как и в случае с предшествующими панелями, существовали значительные различия в стратегиях тестирования и протоколах ПЦР, использовавшихся лабораториями-участницами для скрининга вирусов типа A и B и вирусов субтипа A(H1)pdm09, A(H3) и A(H5)2, 3, 4, 5. Более половины участников использовали протоколы из Центров по контролю и профилактике заболеваний США. Несмотря на использование различных протоколов ПЦР различия результатов тестирования были незначительными. Только 12,3% (20 из 163) лабораторий-участниц осуществляли субтипирование вируса гриппа A(H9). Среди этих 20 лабораторий 4 также осуществили субтипирование нейраминидазы и правильно сообщили об N2. В итоговый доклад о показателях работы лабораторий, который был распространен среди всех участников, была включена подробная информация о генах-мишенях, методах выявления и источниках использовавшихся праймеров/зондов и ферментов.
Таблица 3 Подробная информация о неправильных результатах, сообщенных лабораториями-участницами в программе по внешней оценке качества, панельгод)
Образцы | Число участников | ||||||
Грипп A(H5) | Сообщение другого субтипа | Сообщение как об отрицательном на H5 | |||||
V04-2012 | 1 | 4 | |||||
V05-2012 | 5 | 14 | |||||
V07-2012 | 1 | 6 | |||||
V08-2012 | 4 | 6 | |||||
V09-2012 | 1 | 8 | |||||
Сообщение | |||||||
Не грипп A(H5) | A(H3) | A(H5) | A(H1)pdm09 | A(H6) | Influenza A (тип не определен) | Грипп B | Отрицательный |
V01-2012 (A(H9)) | 5 | 3 | 9 | 1 | н/д | 0 | 12 |
V02-2012 (отрицательный) | 2 | 0 | 1 | 0 | 3 | 1 | н/д |
V03-2012 (A(H3)) | н/д | 1 | 2 | 0 | н/д | 0 | 5 |
V06-2012 (грипп B) | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | н/д | 3 |
V10-2012 (A(H1)pdm09) | 1 | 2 | н/д | 0 | н/д | 0 | 4 |
н/д – нет данных | |||||||
Факторы, влияющие на показатели работы
Анализ одиннадцатой панели показал, что выявление вируса гриппа в низкой концентрации (V05-2012) было в значительной степени связано (p<0,05) с использованием ПЦР в реальном времени. Среди 159 лабораторий-участниц, которые сообщили результаты субтипирования вирусов гриппа H5, 7 участников использовали для субтипирования вирусов гриппа H5 только обычную ПЦР, а 5 из них сообщили отрицательные результаты по гриппу H5 для образца V05-2012. Это контрастирует с 9 из 152 лабораторий, использовавших ПЦР в реальном времени и сообщивших ложноположительные результаты для этого образца. Всем участникам настоятельно рекомендуется регулярно пересматривать методики тестирования, чтобы обеспечивать хорошую чувствительность и избегать ошибочного субтипирования вирусов гриппа A.
Анализ также показал, что неверная интерпретация результатов привела к тому, что 9 лабораторий-участниц сообщили неправильные результаты субтипирования вирусов гриппа A(H9). При анализе результата участникам рекомендуется строго следовать предоставленным инструкциям для применяемого(-ых) метода(-ов). Кроме того, сопутствующий опрос по надлежащей лабораторной практике (GLP) показал, что только 24,8% (42 из 148) лабораторий-респондентов осуществляли выявление вируса гриппа A(H9), и это могло бы объяснить, почему только 12,3% (20 из 163) правильно сообщили об образце гриппа A(H9).
Обсуждение
После восьмой панели в 2010 году число лабораторий, участвующих в EQAP, немного увеличилось – со 158 до 163. Инактивированные путем иррадиации гамма-излучением вирусы были включены в девятую панель и полностью заменили образцы РНК в одиннадцатой панели. Из-за дополнительного этапа выделения показатель числа лабораторий, сообщивших все результаты правильно, несколько снизился с 86% в восьмой панели до 77% и 78% в панелях 9 и 10 соответственно. Рост до 82% в одиннадцатой панели может быть результатом совершенствования выделения РНК или общего расширения возможностей тестирования. В том, что касается выявления вируса гриппа A(H5), показатель числа лабораторий, сообщивших все результаты правильно, в пяти последних панелях оставался неизменным на уровне около 88%.
Границы EQAP расширялись. В одиннадцатую панель был впервые включен образец вируса гриппа A(H9). В новые панели по-прежнему будут включаться реже обнаруживаемые субтипы вируса гриппа A с пандемическим потенциалом. В качестве испытания для оценки владения используемыми молекулярными методами, в следующей, двенадцатой, панели планируется также предусмотреть оценку способности выявлять устойчивость к антигриппозным противовирусным препаратам.
НЦГ и другим национальным лабораториям по гриппу рекомендуется продолжать свое участие в EQAP для повышения качества и стандарта общих возможностей диагностики и эпиднадзора за вирусами гриппа.
[1] См. http://www. who. int/influenza/gisrs_laboratory/en/
[2] См. No. 45, 2008 г., сс. 401–412.
[3] См. No. 48, 2009 г., сс. 493–504.
[4] См. No. 3, 2011 г., сс. 17–24.
[5] См. Noг., сс. 29–36.
