На правах рукописи
КИС Ирина владимировна
Технология получения антисептического
коллагенсодержащего средства
Колмедокс
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени » (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).
Научный руководитель: доктор технических наук, профессор
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Бедоева Залихан Михайловна;
кандидат биологических наук
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»
Защита состоится «____» __________ 2010 г. в ___ ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени », 3. Тел. (4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени ».
Автореферат разослан «____» __________ 2010 года и размещен на сайте http://*****.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Коллаген – основной структурный белок соединительной ткани, выполняющий важные биохимические функции, основной из которых является репаративная. Повышенный интерес к коллагену обусловлен тем, что он сочетает в себе многие свойства синтетических полимеров, а также свойства биологических полимеров [, 2000; , 2002; , 2004; , 2006].
Используя коллаген в качестве биологически активной матрицы, и совмещая его с лекарственными средствами направленного действия, в последние годы удалось создать множество эффективных и стабильных форм монопрепаратов [, , 1990; , 1999; , 2001; , 2004].
В настоящее время важным направлением в современной химиотерапии бактериальных инфекций является предотвращение или замедление развития резистентности микроорганизмов, а так же борьба с уже сформировавшейся лекарственно устойчивой микрофлорой. Поэтому разработка комплексных лекарственных средств пролонгированного действия, содержащих несколько совместимых компонентов – антибиотиков, антисептиков и др., способных при сочетании взаимно усиливать активность, расширять спектр антимикробного действия и которые будут иметь эффективность при полиэтиологичных заболеваниях животных является актуальной задачей.
Цель и задачи работы. Цель работы заключается в разработке технологии получения антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Оптимизировать биотехнологические параметры получения геля коллагена из отходов кожевенного сырья.
2. Разработать технологию изготовления комплексного антисептического коллагенсодержащего средства.
3. Оценить активность in vitro и безвредность на лабораторных животных разработанного антисептического средства.
4. Определить стабильность средства в процессе хранения.
5. Изучить терапевтическую эффективность средства Колмедокс и установить сроки выведения остаточных количеств доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата из организма коров после курсового применения препарата.
6. Разработать проект нормативно-технической документации по изготовлению, контролю качества и применению антисептического коллагенсодержащего средства.
Научная новизна. Впервые разработана технология изготовления комплексного антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс. Средство представляет собой светло-коричневую жидкость в форме раствора, содержащего доксициклина 20 мг, метронидазола 20 мг, хлоргексидина биглюконата 4 мг, лидокаина 5 мг, коллагена 1 мг и растворителя (триэтиленгликоль) до 1,0 см3. Оптимизированы биотехнологические параметры получения коллагена из отходов кожевенного сырья. Установлено, что внесение в состав коллагена 1мг/см3 приводит к замедлению высвобождения in vitro антисептических компонентов на 24 часа по сравнению с контрольным вариантом (без коллагена). При содержании коллагена 5 мг/см3 в антисептическом средстве, элиминация доксициклина, метронидазола и хлоргексидина замедляется в два раза - с 36 часов до 72 часов.
Практическая значимость работы. Предложено новое коллагенсодержащее антисептическое средство Колмедокс для лечения эндометритов у коров и инфицированных ран у домашних животных.
На базе совместно с ветспециалистами производственного подразделения разработаны технологические параметры и изготовлены четыре опытно-производственные серии средства Колмедокс.
Материалы исследований включены в проект нормативно-технической документации (СТО 28-2009, технологический регламент изготовления и инструкция по применению).
Разработанный проект нормативно-технической документации, пакет документов на антисептическое средство Колмедокс, необходимых для регистрации на территории РФ, приняты в Россельхознадзоре и направлены для дальнейшего испытания в ФГУ «ВГНКИ».
Апробация работы. Основные положения и результаты работы были доложены и обсуждены на ІІ - ом съезде ветеринарных фармакологов и
токсикологов России «Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии» (Казань, 2009), материалы по разработке антисептического средства рассмотрены и одобрены на заседании научно-методической комиссии ФГОУ ВПО МГАВМиБ 01.06.2009 и научно-производственном совещании 04.06.2010, на международной конференции, посвященной 90-летию со дня основания ФГОУ ВПО МГАВМиБ «Актуальные проблемы товароведения сырья и продуктов животного происхождения, промышленных и продовольственных товаров, экологии» (Москва, 2009), на Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 6 научных статей, в т. ч. 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, в т. ч. 40 страниц приложений и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практическое использование полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, включающий 160 источников, в том числе 50 иностранных. Материалы диссертации иллюстрированы 14 рисунками и 21 таблицей.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту.
1. Усовершенствованная технология получения коллагена, позволяющая получить на его основе средство Колмедокс.
2. Состав и технология производства нового коллагенсодержащего антисептического средства Колмедокс.
3. Динамика высвобождения in vitro антисептических компонентов из коллагенсодержащего средства Колмедокс.
4. Результаты оценки антимикробной активности in vitro, безвредности на лабораторных животных и терапевтической эффективности разработанного антисептического средства Колмедокс.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в период с 2007 по 2010 гг. на кафедре товароведения и технологии сырья животного происхождения им. ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины биотехнологии имени ». Ряд экспериментов был проведен на базе . В качестве подопытных животных использованы 162 беспородные белые мыши массой 18 – 20 г и 5 кроликов породы шиншилла.
Гель уксуснокислого коллагена получали по запатентованной методике [, , и др. 1995; 1999] в нашей модификации из некондиционных шкур (порезы) крупного рогатого скота, приобретенных на убойных пунктах хозяйств Московской области.
Гель коллагена исследовали на стерильность в соответствии с ГОСТ .
Содержание белка в геле коллагена определяли методом Къельдаля (2002), аминокислот — на аминокислотном анализаторе (модель 835 производства «Hitachi») в Аккредитованном испытательном лабораторном центре «БИОТЕСТ» Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ).
Антимикробную активность монокомпонентных образцов и препаративной формы антисептического средства Колмедокс определяли методом серийных разведений с использованием следующих тест-культур микроорганизмов: Staphylococcus aureus 493; Streptococcus pneumonia 19; Escherichia coli 1597; Salmonella dublin 29; Pasteurella multocida 225; Microsporum canis 213; Trichophyton mentagrophytes 135; Trichophyton verucosum 130.
Для изучения влияния коллагена на продолжительность высвобождения антисептических компонентов (доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата) была смоделирована биосистема in vitro по принципу диффузии высокомолекулярных веществ через полупроницаемую мембрану.
Изучение острой, субхронической токсичности и раздражающего действия на слизистые оболочки средства Колмедокс проводили по методикам, описанным в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ» (2005).
Для установления срока и режима хранения была изучена стабильность опытных образцов антисептического средства Колмедокс. Испытания проводили в течение 24 месяцев при температуре 4 – 6 0С и 25 0С.
Определение подлинности и массовой доли доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата в средстве Колмедокс проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение подлинности лидокаина проводили по качественной реакции на ароматические первичные амины и хлориды. Массовую долю лидокаина определяли титрометрическим методом. Подлинность и массовую долю коллагена определяли по оксипролину колориметрическим методом.
Терапевтическую эффективность средства Колмедокс изучали при эндометритах крупного рогатого скота в хозяйствах Московской, Вологодской, Калужской и Смоленской областях и при лечении инфицированных ран у домашних животных (кошки и собаки) в условиях ветеринарных клиник.
Остаточное количество доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата в образцах мышечной ткани и молока определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с пределом детектирования 0,01 мкг/см3.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы «STATISTICA».
Результаты исследованиЙ
Усовершенствование технологии получения геля коллагена
В связи с тем, что некондиционные шкуры (порезы) крупного рогатого скота являются одним из основных недубленых отходов кожевенного сырья и не представляют экономической ценности для хозяйств, мы, с учетом, стоявших перед нами задач, сочли целесообразным использовать именно их для наработки геля коллагена.
Различные способы получения дисперсий коллагена, как правило, включают в себя такие основные стадии как предварительная обработка коллагенсодержащего сырья щелочно-солевым раствором и последующее растворение его слабыми органическими кислотами. Особую роль здесь играет выбор химических реагентов, их соотношений и концентраций.
Наши исследования были направлены в основном на подбор и сравнительное испытание трех вариантов состава щелочно-солевого раствора, содержащего перекись водорода:
I вариант – 20 г/л гидроксида натрия (NaOH), 10 г/л перекиси водорода (H2O2) и 3 г/ л сульфида натрия (Na2S).
II вариант – 50 г/л гидроксида натрия (NaOH), 10 г/л перекиси водорода (H2O2) и 3 г/л сульфида натрия (Na2S).
III вариант – 100 г/л гидроксида натрия (NaOH), 10 г/л перекиси водорода (H2O2) и 3 г/л сульфида натрия (Na2S).
Для каждого варианта (в трех повторностях) готовили равнозначные образцы шкуры массой 1 кг.
Образцы шкуры очищали от механических примесей, разрезали на кусочки размером 5х5 см, помещали в емкость с перемешивающим устройством, промывали теплой водопроводной водой. После удаления промывной жидкости, в емкость с образцами вносили щелочно-солевой раствор и выдерживали в полученной смеси в течение 30 часов при 25°С. В результате воздействия щелочно-солевого раствора во всех образцах отмечено полное удаление волосяного покрова, в первом и втором вариантах частичное набухание коллагена. В третьем варианте, набухание и разрыхление кусочков было более выраженным, по всей видимости, за счет более высокой концентрации гидроксида натрия.
Обработанное щелочно-солевым раствором сырье трехкратно промывали холодной водопроводной водой 1:10 и один раз 0,1М раствором уксусной кислоты (CH3COOН) для нейтрализации щелочи. Подготовленный коллагенсодержащий материал измельчали на мясорубке и смешивали 1:5 с 1М раствором уксусной кислоты для растворения коллагена. Через 3-е суток измельченный материал приобретал форму геля. Причем было отмечено, что образцы первого варианта содержали плотные кусочки не растворившегося материала, по всей видимости, как следствие недостаточного разрыхления коллагена из-за сравнительно низкой концентрации щелочи. Для получения однородного продукта все образцы подвергали обработке на проточном гомогенизаторе Vertis с добавлением дистиллированной воды (Н2О) 1:5. Таким образом, из каждого образца шкуры массой один килограмм получали десять килограмм геля коллагена (рис. 1).
|
В полученных образцах геля коллагена определяли содержание белка и аминокислотный состав. Концентрация белка в 1 и 2 вариантах существенно не отличалась и составила 21,2±0,03 мг/см3 и 20,6±0,01 мг/см3 соответственно. Содержание белка в третьем варианте было ниже на 11,2 % и составило 18,3±0,01 мг/см3, по всей видимости, высокая концентрация NаOH в растворе повлияла на нарушение структуры коллагена и частичную его потерю в процессе промывки.
По результатам аминокислотного анализа коллагена, во всех образцах установлено высокое содержание таких аминокислот как глицин (5,18 – 6,00 мг/ см3), гидроксипролин (2,34 – 2,72 мг/ см3), пролин (2,14 – 2,48 мг/ см3) и глутаминовая кислота (1,50 – 1,74 мг/ см3).
В результате проведенной серии опытов по отработке получения геля коллагена с использованием щелочно-солевого раствора с различной
концентрацией гидроксида натрия установлено, что наиболее приемлемой оказалась концентрация компонентов щелочно-солевого раствора по второму варианту, который использовали при разработке технологии изготовления антисептического средства.
Обоснование и оптимизация изготовления антисептического
коллагенсодержащего средства Колмедокс
При выборе оптимального состава лекарственной формы антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс нами был испытан ряд вариантов композиций.
В качестве антисептических веществ испытывали доксициклин, метронидазол и хлоргексидин биглюконат, которые применяются при лечении метритов животных и инфицированных ран, используются в монокомпонентных коллагенсодержащих лекарственных формах, имеют различный механизм действия на микробную клетку и не оказывают побочного действия на организм млекопитающих. При составлении оптимальной композиции готовой лекарственной формы препарата важно было подобрать растворитель для всех компонентов.
Нами были испытаны три растворителя - дистиллированная вода, монопропиленгликоль и триэтиленгликоль при разных значениях температуры и в зависимости от последовательности растворения компонентов. Учитывая изоэлектрическую точку коллагена и кислотность среды в раневом содержимом (рН 5-6), готовили базовую лекарственную форму в виде раствора.
В результате проведенных исследований установлено, что дистиллированная вода в качестве растворителя оказалась неудачным вариантом из-за не стабильности водного раствора доксициклина как в моноварианте, так и в сочетании с другими компонентами. В монопропиленгликоле и триэтиленгликоле удалось получить растворы доксициклина и метронидазола. Хлоргексидин биглюконат обладал высокой растворимостью во всех трех растворителях.
При изучении влияния температурного фактора на растворимость компонентов, было установлено, что наиболее оптимальной для растворения метронидазола оказалась температура в диапазоне 60-80°С. Растворение доксициклина происходило также быстро, однако в течение суток препаративная форма приобретала темно-коричневый цвет за счет быстрого окисления. При температуре 40°С доксициклин растворился полностью в течение 15-20 мин, при этом сохранялась стабильность приготовленного раствора препарата.
При испытании в качестве растворителя монопропиленгликоля и триэтиленгликоля были получены сходные результаты. Учитывая экономическую составляющую, дальнейшие испытания проводили с использованием триэтиленгликоля.
В качестве обезболивающего компонента в полученные образцы добавляли 5 мг/см3 лидокаина. Для получения биокомпозитов в раствор антисептических веществ вносили гель коллагена из расчета 1 – 5 мг/см3 по белку.
Оценка антибактериальной активности монокомпонентных образцов (содержащих один из антисептических компонентов: доксициклин, метронидазол или хлоргексидин биглюконат) и средства Колмедокс показала, что значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) средства для St. aureus и E. coli составило соответственно 0,20±0,05 мкг/см3 и 0,40±0,05 мкг/см3, то есть увеличилось более чем в 10 раз по сравнению с монокомпонентными образцами. Взаимоусиливающий эффект от применения комбинации антисептических веществ, вероятно, обусловлен тем, что они имеют различный механизм действия на микробную клетку. Так, доксициклин действует за счет подавления белкового синтеза, взаимодействуя с 30s-субъединицами рибосом микробных клеток, метронидазол нарушает репликацию ДНК и ингибирует внутриклеточное дыхание чувствительных микроорганизмов, а хлоргексидин нарушает осмотическое равновесие бактериальных клеток (потеря калия, фосфора).
Таким образом, на основе проведенных исследований было подобрано оптимальное соотношение компонентов, которые обеспечивают получение опытно–лабораторных образцов средства с выраженной антимикробной активностью (рабочее название Колмедокс). Средство Колмедокс представляет собой светло-коричневую жидкость в форме раствора, содержащего доксициклина 20 мг, метронидазола 20 мг, хлоргексидина биглюконата 4 мг, лидокаина 5 мг, коллагена 1 мг и растворителя (триэтиленгликоль) до 1,0 см3 .
В условиях согласно разработанному технологическому регламенту нами было изготовлено 4 опытно-производственных серии
средства Колмедокс.
Опытно-производственные серии средства Колмедокс в форме раствора готовили в реакторе (рис. 2) с соблюдением правил асептики. Для приготовления средства в реактор вносили триэтиленгликоль и стерилизовали его при температуре 100 0С путем пропускания пара через «рубашку» реактора. Далее охлаждали растворитель до температуры 80 0С путем пропускания через «рубашку» реактора холодной воды. В реактор вносили при постоянно работающей мешалке лидокаин, метронидазол, затем снижали температуру до 40 0С и вносили доксициклин, гель коллагена и раствор хлоргексидина биглюконата. Растворение очередного компонента осуществляли после полного растворения предыдущего. Для удаления растворимого кислорода из раствора проводили барбатацию азотом. Далее проводили фасовку готовой формы во флаконы. Приготовленное таким образом средство Колмедокс контролировали по всем показателям качества, предусмотренных СТО и передавали ветспециалистам для определения терапевтической эффективности.
|
Изучение динамики высвобождения in vitro действующих веществ из антисептического средства Колмедокс
Одним из критериев оценки активности препаративной лекарственной
формы является определение скорости высвобождения антисептических компонентов и продолжительности их действия на месте введения.
При изучении in vitro влияния коллагена на продолжительность высвобождения трех антисептических компонентов из препаративной формы нами было испытано более двадцати образцов, содержащих коллаген в концентрациях 1 мг/см3 и 5 мг/см3, и образцы, не содержащие коллаген.
Все испытуемые образцы содержали доксициклина 20 мг/см3, метронидазола 20 мг/см3 и хлоргексидина биглюконата 4 мг/см3.
Рис. 3. Динамика высвобождения доксициклина, метронидазола и
хлоргексидина биглюконата in vitro из образцов антисептического
средства: а – без коллагена; б – содержащего 1 мг/см3 коллагена;
в – содержащего 5 мг/см3 коллагена
В результате проведенных исследований (рис.3) было установлено, что из трехкомпонентных образцов полное высвобождение доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата в диализный раствор происходило за 36 часов. Внесение в состав коллагена приводит к значительному замедлению диффузии. Так при внесении коллагена 1 мг/см3 высвобождение антисептических компонентов замедляется на 24 часа по сравнению с вариантом без коллагена. А при содержании коллагена 5 мг/см3 в средстве Колмедокс в течение 72 часов элиминировало только около 70% антисептических компонентов.
Этот факт свидетельствует о том, что внесение коллагена приводит к образованию нестойких биокомплексов с антисептическими компонентами, что влияет на скорость их диссоциации и последующей диффузии через диализную мембрану.
В результате проведенных исследований установлено также, что наиболее прочным оказался биокомпозит коллаген-хлоргексидин биглюконат.
Изучение in vitro антимикробной активности антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс
На основании проведенных микробиологических исследований было установлено, что антисептическое средство Колмедокс является высокоактивным средством в отношении штамма золотистого стафилококка и кишечной палочки при значении минимальной подавляющей концентрации (МПК) 0,25±0,07 мкг/см3 и 0,40±0,06 мкг/см3 соответственно. Менее выраженным антимикробным действием характеризуется препарат в отношении штаммов Streptococcus pneumonia (3,12±0,50 мкг/см3), Salmonella dublin (4,57±0,23 мкг/см3), Pasteurella multocida (10,40±0,27 мкг/см3). Штаммы грибных культур оказались более устойчивы к испытуемому средству и значение МПК составило в среднем 23,4±0,22 мкг/см3.
Токсикологические параметры антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс
Изучение острой токсичности. Изучение параметров острой токсичности антисептического средства Колмедокс показало, что при однократном внутрижелудочном введении предельно допустимого объема (1см3) средства все опытные мыши оставались живы. Поэтому готовили образец средства Колмедокс с суммарным содержанием антисептических компонентов 220 мг/см3, т. е. в 5 раз превышающих оригинальные (44 мг/см3).
В результате исследований установлено, что при внутрижелудочном введении лекарственного средства Колмедокс мышам среднесмертельная доза (ЛД50) составила 6667±58,5 мг/кг массы животного.
На основании полученных данных антисептическое коллагенсодержащее средство Колмедокс в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007-76 можно отнести к 4 классу опасности – вещества малоопасные (ЛД50 > 5000 мг/кг).
Изучение субхронической токсичности. Изучение параметров субхронической токсичности антисептического средства Колмедокс проводили на беспородных белых мышах массойг. Препарат вводили ежедневно в течение 21 суток перорально при помощи зонда в желудок в следующих дозах: 1 группе – 1/5 от ЛД50 (1333,4 мг/кг); 2 группе – 1/10 от ЛД50 (666,7 мг/кг); 3 группе – 1/20 от ЛД50 (333,35 мг/кг); 4 группе (контрольная) – композиция лидокаин – коллаген - триэтиленгликоль без антисептических веществ. Наблюдение за клиническим состоянием мышей вели на протяжении 31 суток от начала опыта.
Клинический анализ крови показал, что уровень гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов не изменялось на протяжении эксперимента, т. е. статистически значимых изменений не выявлено.
В результате проведенных исследований установлено, что изменений массы органов при применении средства Колмедокс мышам не выявлено в сравнении с контролем.
Изучение раздражающего действия на слизистые оболочки (конъюнктивальная проба). Исследование раздражающего действия антисептического средства Колмедокс проводили на 5 кроликах породы шиншилла. Для постановки пробы 1 каплю антисептического средства Колмедокс вводили глазной пипеткой с вытянутым тонким концом в конъюнктивальный мешок правого глаза животных, а в левый глаз (контрольный) животных закапывали 1 каплю физиологического раствора. Реакцию учитывали через 15 минут и спустя 24, 48 часов по внешнему виду конъюнктивы и по реакции склеры.
В течение всего срока наблюдения видимых изменений со стороны слизистой оболочки, как левого глаза (контрольного), так и правого (опытного) не выявлено. Отмечали лишь небольшое слезотечение, роговица глаза была прозрачная, без видимых изменений. Таким образом, изучаемое средство не обладает раздражающим эффектом при воздействии на слизистые.
Стабильность средства Колмедокс в процессе хранения
Хранение – этап технологического цикла товародвижения от выпуска готовой продукции до потребления или утилизации, цель которого — обеспечение стабильности исходных свойств или их изменение с минимальными потерями. Таким образом, при разработке новых лекарственных средств устанавливаются параметры стабильности, как действующего вещества, так и готовой формы препарата.
Органолептические, физико-химические и биологические свойства антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс исследовали по таким показателям качества как внешний вид, цветность, номинальный объем, безвредность, подлинность и массовая доля метронидазола, доксициклина, хлоргексидина биглюконата, лидокаина, коллагена.
Опытные серии средства Колмедокс были заложены на хранение в течение 24 месяцев при температуре 4–6ºС и 25°С. Пробы отбирали каждые 6 месяцев и проводили испытания по выше указанным показателям качества.
В течение всего опыта такие показатели как внешний вид, цветность, номинальный объем, безвредность оставались практически без изменений.
Так же установлено, что в течение всего срока наблюдения содержание лидокаина и коллагена изменяется незначительно, т. е. разница в значениях не достоверна и находится в пределах ошибки.
Определение подлинности и количественного содержания антисептических компонентов (метронидазола доксициклина и хлоргексидина биглюконата) в испытуемых образцах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Полученные результаты показали, что в процессе всего срока хранения (24 месяца) средства Колмедокс при температуре 4-6°С не происходит достоверных изменений содержания антисептических веществ (доксициклина – 19,5 - 20,0 мг/см3; метронидазола – 19,7 – 20,0 мг/см3; хлоргексидина биглюконата – 3,9 – 4,0 мг/см3). Изучение содержания антисептических веществ в препарате при хранении в условиях 25 0С также не выявило достоверных отклонений от нормативных требований к препарату.
Из этого можно сделать заключение о сохранности основных
характеристик препарата, а именно, концентрации и компонентного состава действующих веществ без существенных изменений как минимум 24 месяца. Вследствие чего принято, что срок хранения готовой формы средства Колмедокс составляет 2 года.
Терапевтическая эффективность антисептического
коллагенсодержащего средства Колмедокс
Эффективность средства при лечении эндометритов крупного рогатого скота. Терапевтическую эффективность средства Колмедокс определяли совместно с ветспециалистами Н. А Костромитиновым () и ( дом Простор») на крупном рогатом скоте в различных хозяйствах - Племзавод «50-лет СССР», Вологодская область; , Калужская область; им. Кирова», Лотошинский район МО; СКП «Радищево», Гагаринский район Смоленская область при непосредственном участии ветспециалистов этих хозяйств.
Для изучения сроков выведения доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата в опыте были использованы 9 коров черно-пестрой породы 3-5 летнего возраста (Племзавод «50-лет СССР») с признаками серозного и серозно-гнойного эндометрита (зоотехнический брак). Антисептическое средство Колмедокс вводили внутриматочно по 50 см3 один раз в сутки в течение пяти дней. Через 3, 4 и 5 дней после последнего внутриматочного введения средства отбирали пробы молока и проводили убой по 3 животных. По результатам послеубойного осмотра было установлено, что признаков эндометрита не отмечено у 7 туш коров, у 2 - не значительные изменения в виде небольших участков серозного воспаления эндометрия. Таким образом, применение средства Колмедокс имеет выраженный терапевтический эффект при лечении эндометритов у коров.
В отобранных образцах молока и мышечной ткани определяли остаточные количества антисептических веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. На 4 сутки после окончания применения средства в мышечной ткани не отмечено содержания хлоргексидина биглюконата, но обнаруживались метронидазол и доксициклин. На 5 сутки концентрация всех антисептических веществ была ниже предела чувствительности метода. На основании полученных результатов можно рекомендовать использование молока в пищевых целях и убой животных на мясо не ранее чем, через 5 суток после последнего внутриматочного применения средства коровам.
Эффективность средства при лечении ран у собак и кошек. Изучение терапевтической эффективности антисептического средства Колмедокс при лечении инфицированных ран разной степени тяжести у кошек и собак проводили ветспециалисты на базе научно-производственного центра Бурятской государственной сельскохозяйственной академии и в условиях ветеринарной клиники .
Животным опытной группы на поверхность раны аэрозольно наносили антисептическое средство Колмедокс один раз в сутки, контрольной – эритромициновую мазь, сверху мази накладывали марлевую повязку. Курс лечения антисептическим средством Колмедокс составил 4 – 5 суток, а эритромициновой мазью – 5 – 9 суток.
Таким образом, в результате проведенных испытаний установлено, что при применении коллагенсодержащего антисептического средства Колмедокс происходит более ускоренный процесс заживления ран у кошек и собак.
ВЫВОДЫ
1. Оптимизирована схема получения коллагена из некондиционных шкур (порезы) крупного рогатого скота путем обработки щелочно-солевым раствором, содержащим 50 г/л гидроксида натрия, 10 г/л перекиси водорода и 3 г/л сульфида натрия в течение 30 ч при 25°С для удаления волосяного покрова и набухания коллагена с последующим промыванием и растворением в 1 М растворе уксусной кислоты.
2. Разработана технология изготовления комплексного коллагенсодержащего антисептического средства Колмедокс, содержащего в качестве действующих веществ 20 мг доксициклина, 20 мг метронидазола, 4 мг хлоргексидина биглюконата, 5 мг лидокаина, 1 мг коллагена и растворителя (триэтиленгликоль) до 1,0 см3.
3. Установлено in vitro пролонгирующее действие коллагена на антисептические компоненты (доксициклин, метронидазол и хлоргексидин биглюконат). Скорость высвобождения антисептических компонентов обратно пропорциональна концентрации коллагена в препаративной форме. Внесение в композицию 1 мг/см3 коллагена приводит к задержке высвобождения антисептических компонентов на 24 часа по сравнению с контрольным вариантом (без коллагена). При концентрации коллагена 5 мг/см3 в антисептическом средстве, элиминация доксициклина, метронидазола и хлоргексидина биглюконата замедляется в два раза - с 36 часов до 72 часов. Наиболее медленно высвобождается хлоргексидин биглюконат.
4. Средство Колмедокс по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу опасности – вещества малоопасные, т. к. ЛД50 для белых мышей составляет 6667±58,5 мг/кг массы животного.
5. Антисептическое средство Колмедокс стабильно при хранении в диапазоне температур 4 – 25 оС в течение 24 месяцев.
6. Антисептические компоненты (доксициклин, метронидазол и хлоргексидин биглюконат) полностью выводятся из организма животных через 5 суток после последнего внутриматочного применения средства коровам.
7. Уровень рентабельности опытного производства комплексного антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс составил 37,08%.
Практическое использование ПОЛУЧЕННЫХ
НАУЧНЫХ результатов
Результаты исследований включены в отчет «Разработка технологии изготовления и изучение фармакотоксикологических параметров лекарственного средства Колмедокс для внутриматочного применения животным» за 2009 г по договору о творческом и научно-техническом сотрудничестве от 14.01.09.
Результаты исследований использованы при разработке проекта нормативно-технической документации на антисептическое коллагенсодержащее средство Колмедокс в ветеринарной практике (СТО 28-2009, технологический регламент и инструкция по применению).
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
1. Технология получения геля коллагена рекомендуется для производства лекарственных форм на основе коллагена.
2. Технология получения средства Колмедокс рекомендована для разработки аналогичных антисептических препаратов.
3. Новое комплексное антисептическое коллагенсодержащее средство Колмедокс может быть рекомендовано ветеринарным специалистам и владельцам животных для профилактики и лечения эндометритов крупного рогатого скота, и лечения инфицированных ран у домашних животных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. , , Костромитинов стабильности лекарственного средства Колмедокс - спрей в процессе хранения / Актуальные проблемы товароведения сырья и продуктов животного происхождения, промышленных и продовольственных товаров, экологии: межвед. юбилейный сб. науч. трудов – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ. – 2009. – С. 210 – 215.
2. , Сапожникова потребительские свойства антисептического коллагенсодержащего лекарственного средства Колмедокс // Ветеринарная медицина. – 2009. – № 4. – С. 54 – 56.
3. , , Суменкова эффективность применения лекарственного средства Колмедокс-спрей при случайных ранах у мелких домашних животных / Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии: Сб. материалов конференции ІІ съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. – Казань: ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». – 2009. – С. 108 – 111.
4. Кис коллагена на продолжительность высвобождения in vitro антимикробных компонентов из антисептического средства Колмедокс //
Ветеринарная медицина. – 2010. – № 1. – С. 14 – 17.
5. , , Костромитинов получения препаративной формы антисептического коллагенсодержащего средства Колмедокс // Сельскохозяйственная биология. – 2010. – № 2. – С. 29 – 33.
6. , Баранцева аспекты получения белоксодержащих препаратов из отходов сырья животного происхождения // Биотехнология: экология крупных городов: Сб. тезисов Московской международной научно-практической конференции. – М.: -технологии», РХТУ им. . – 2010. – С. 208 – 209.
