Инфекции дыхательных путей (стр. 1 )

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей

и благополучия человека

3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов

Методические указания

МУ 3.1.2…

Москва 2009

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

__________________________________________________________________

3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов

Методические указания

МУ 3.1.2…

Издание официальное

Москва 2009

Термины и сокращения

СП – санитарно-эпидемиологические правила

ТИФА – твердофазный иммуноферментный анализ

МУ – методические указания

МФА – метод флуоресцирующих антител

РНГА – реакция непрямой гемагглютинации

РИД – реакция иммунодифузии

РЛА - реакция латекс-агглютинации

РСК – реакция связывания комплемента

ИФА – иммуноферментный анализ

ПЦР – полимеразная цепная реакция

МПК – минимальная подавляющая концентрация

ГЗТ – реакция гиперчувствительности замедленного типа

КОЕ – колониеобразующие единицы

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 20с.

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (, ), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (, , ).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые

Исполнители от Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека:

Исполнители от ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора:

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 20с.

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (, ), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (, , ).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые

Содержание

	стр.
1 Область применения	9
2 Нормативные ссылки	9
3 Общие положения	10
3.1 Краткие сведения о возбудителях глубоких микозов	10
3.1.1 Морфологические и культурально-биохимические свойства Coccidioides spp.	13
3.1.2 Морфологические и культурально-биохимические свойства Histoplasma capsulatum	18
3.1.3 Морфологические и культурально-биохимические свойства Blastomyces dermatitidis	22
3.1.4 Морфологические и культурально-биохимические свойства Paracoccidioides brasiliensis	23
4 Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования	25
4.1 Взятие материала от человека	25
4.2 Взятие материала из объектов окружающей среды и сырья растительного происхождения	26
4.3 Направление материала на исследование	28
5 Порядок проведения исследований	29
5.1 Микроскопия и гистологическое исследование патологического материала	29
5.1.1 Coccidioides spp.	29
5.1.2 H. capsulatum	30
5.1.3 B. dermatitidis	31
5.1.4 P. brasiliensis	31
5.2 Культуральный (микологический) метод	32
5.2.1 Coccidioides spp.	32
5.2.2 H. capsulatum	33
5.2.3 B. dermatitidis	33
5.2.4 P. brasiliensis	34
5.3 Биологический метод	34
5.4 Иммуно-серологические методы исследования	36
5.4.1 Кокцидиоидомикоз	36
5.4.2 Гистоплазмоз	38
5.4.3 Бластомикоз	40
5.4.4 Паракокцидиоидомикоз	41
5.5 Молекулярно-генетические методы исследования	41
5.5.1 Обеззараживание проб для исследования методом ПЦР	41
5.5.2 Выделение ДНК	42
5.5.3 Проведение ПЦР для специфической индикации и идентификации возбудителей особо опасных микозов	45
5.6 Идентификация культур на основе фенотипических признаков	45
5.6.1 Получение микрокультур	45
6 Выдача заключений по результатам лабораторного исследования на особо опасные микозы	46
7 Режим работы в лабораториях, работающих с микромицетами II группы патогенности (опасности)	48
8 Профилактика особо опасных микозов	50
Приложение 1 (справочное). Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителей особо опасных микозов	51
Приложение 2 Приготовление рабочих растворов и реагентов для проведения ПЦР	54
Приложение 3 (справочное) Лечение особо опасных микозов	57
Приложение 4 Схема лабораторной диагностики глубоких микозов	65

1 Область применения

1.1 Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, имеющих разрешение на работу с микроорганизмами II группы патогенности, независимо от организационно-правовой формы.

1.2 В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на инфицированность возбудителями особо опасных микозов, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию микромицетами II группы патогенности.

2 Нормативные ссылки

2.1  Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». – М., 2003.

2.2 Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». – М., 1996

2.3 Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. Методические указания МУ 1.3.1794-03 . – М., 2004.

2.4 Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01. - М., 2001.

2.5 Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики. Методические рекомендации. - МЗ РФ, ЦНИИЭ. – М., 2004.

2.6 Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. Методические рекомендации МР 0100/, Москва.-2005 г.

3 Общие положения

3.1 Краткие сведения о возбудителях особо опасных микозов

Возбудители особо опасных микозов – это первичные грибные патогены. К ним относят грибы рода Coccidioides (C. immitis, C. posadasii), Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis и Paracoccidioides brasiliensis. Общим для всех особо опасных микозов является то, что они принадлежат к категории «респираторных», т. е. основной путь инфицирования – аэрогенный.

В соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами возбудители кокцидиоидомикоза (C. immitis и C. posadasii), гистоплазмоза (H. capsulatum), бластомикоза (B. dermatitidis) и паракокцидиоидомикоза – (P. brasiliensis) относятся ко второй группе патогенности (опасности).

Существующее таксономическое положение этих возбудителей представлено в таблице 1.

Таблица 1

Таксономическая систематика возбудителей особо опасных микозов

Царство	Fungi
Отдел	Ascomycota
Класс	Euascomycetes
Порядок	Onygenales
Семейство	Onygenaceae
Род	Coccidioides
Вид	анаморфа*	телеоморфа**
Coccidioides immiis [Rixford and Gilchrist, 1896]; Coccidioides posadasii [Fisher, Koenig, White et Taylor, sp. nov.]	не установлена
Род	Histoplasma
Вид	анаморфа*	телеоморфа**
Histoplasma capsulatum var. capsulatum [Darling, 1906]; H. capsulatum var. duboisii [Dubois and Vanbreuseghem, 1956]	Ajellomyces capsulatum [Kwon-Chung Vc. Ginnis and Katz, 1979]
Род	Blastomyces
Вид	анаморфа*	телеоморфа**
Blastomyces dermatitidis [Cilchrist abd Stokes, 1898]	Ajellomyces dermatitidis [Mc. Donough and Lewis, 1968]
Род	Paracoccidioides
Вид	анаморфа*	телеоморфа**
Paracoccidioides brasillensis [Splendore de Almeida, 1930]	не установлена

Примечание: * - бесполое состояние гриба;

** - половая или совершенная форма гриба

Возбудители особо опасных микозов диморфны: во внешней среде они существуют в виде мицелиальной (сапробной) формы, а в организме человека и животных из мицелиальных элементов образуются тканевые (паразитические) формы гриба.

Первичные грибные патогены занимают дискретные экологические ниши. Наиболее вирулентные из них - возбудители кокцидиоидомикоза C.immitis и C.posadasii обитают в почвах юго-запада США, в Мексике и в других странах Центральной и Южной Америки. H.capsulatum var. capsulatum регистрируется во многих странах мира, но его высокоэндемичные очаги расположены в США вдоль реки Миссисипи. Вариант гриба - H. capsulatum var. duboisii встречается, в основном, в Африке. Возбудитель бластомикоза B. dermatitidis выявляется в почвенных микроочагах многих стран мира, но обитает преимущественно в юго-восточных, центральных и средне-западных штатах США, а также в Канаде, Мексике, странах Центральной и Южной Америки. Почвенные очаги P.brasiliensis ограничены Центральной и Южной Америкой, причем наибольшее распространение возбудитель паракокцидиоидомикоза имеет в бассейне реки Амазонки.

Пыльные бури, интен­сивное земледелие, археологические раскопки, проведение полевых военных учений способствуют повышению числа инфицированных и, соответственно, клинически выраженных случаев. Пребывание в эндемичной зоне туристов обусловливает вынос инфекции на другие территории, в том числе за пределы эндемичных очагов. Однако, передача особо опасных микозов от человека человеку не происходит, образование новых почвенных очагов не зафиксировано, по­этому вне эндемичных зон болезнь не укореняется.

Истинную встречаемость в мире особо опасных микозов сложно опре­делить в связи с трудностью их диагностики, однако предполагается, что ежегодная инфицированность этими возбудителями людей в эндемичных районах составляет сотни тысяч человек.

Необходимо подчеркнуть, что аэрогенный способ заражения особо опасными микромицетами является естественным, поэтому использование аэрозоля спор этих грибов обеспечивает заражение большого количества людей. Инфекциозность спор очень высокая, однако развитие первичной легочной инфекции напрямую зависит от инфицирующей дозы возбудителя.

Входными воротами инфекции являются легкие. Внедрение возбудите­лей особо опасных микозов приводит к формированию очага воспаления. Первичный процесс в легких у большинства инфицированных заканчивается самопроизвольным выздоровлением с рубцеванием гранулёмы. У большинства больных выздоровление не сопровождается какими-либо оста­точными явлениями в легких, но у 2-5 % регистрируются узелки или полос­ти.

При гематогенной диссеминации Coccidioides spp. чаще пора­жаются кожа, кости, суставы, оболочки головного мозга, а также селезенка, печень, почки, надпочечники.

Диссеминированный гистоплазмоз встречается очень редко и развива­ется у больных с иммунодефицитом, детей и ослабленных пожилых лиц. Для диссеминированной формы африканского гистоплазмоза характерно дли­тельное течение с преобладанием поражений костей и ко­жи.

При бластомикозе наиболее характерна диссеминация в кожу. Часто отмечается поражение костей, реже — органов мочевыводящей и половой систем, центральной нервной системы.

При паракокцидиоидомикозе вторичная диссеминация с поражением различных органов отмечается у 79 % взрослых больных. Наиболее харак­терны поражения слизистых оболочек и кожи, а также шейная лимфоаденопатия.

Человек не обладает естественным иммунитетом к данным грибам, поэтому восприимчивость населения считается всеобщей. Эффективность иммунного ответа на инфицирование грибами зависит от защитых факторов макроорганизма, важная роль в которых принадлежит факторам Т-клеточного иммунитета.

Гуморальные (комплементсвязывающие, преципитирующие) антитела не являются показателями защиты, а лишь характеризуют ответную реакцию иммунной системы на попадание в организм антигенов грибов. Более того, выраженный гуморальный ответ в виде специфических иммуноглобулинов (особенно IgG) свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания.

Продолжительность болезни широко варьирует от нескольких недель до одного года. Описаны формы продолжительностью 4-8 и даже 16 лет. Длительность и интенсивность лечения зависят от формы заболевания, в особо тяжелых случаях прием антифунгальных препаратов – пожизненный.

Установление лабораторного диагноза микозов связано с длительным процессом культивирования грибов и их идентификации путем доказательст­ва диморфизма (получение мицелиальной и тканевой фаз).

3.1.1 Морфологические и культурально-биохимические свойства Coccidioides spp.

Грибы рода Coccidioides характеризуются продукцией нитчатых (мицелиальных) форм в период развития сапробной фазы во внешней среде (преимущественно, в почве) или при выращивании в условиях пониженной температуры (ниже 30 0С) на питательных средах. Конверсия в дрожжеподобную форму (сферулы) происходит во время паразитической фазы, т. е. после внедрения в организм животного (человека) или при инкубации на обогащенных питательных средах в условиях повышенной температуры (34-41 0С) и наличия углекислого газа.

Мицелиальная форма Coccidioides характеризуется образованием септированных гиф и толстостенных артроконидий (артроспор) диаметром 2-4 мкм, которые образуются по длине гиф внутри самого мицелия. Артроконидии обычно разделены «пустыми» тонкостенными, хрупкими клетками-разобщителями, образуемыми путем аутолиза чередующихся конидий внутри гифы. Таким способом артроконидии легко высвобождаются в воздух при нарушении верхних слоев почвы и ветре. При ингаляции в легкие или в редких случаях после чрезкожной имплантации в ткани каждая артроконидия трансформируется в новую многоядерную, округлую структуру, называемую сферулой. Сферулы увеличиваются в размерах и формируют толстую наружную стенку. По мере роста сферула начинает разделяться внутри путем инвагинации и образования разделяющих бороздок, что приводит к продукции многочисленных одноядерных эндоспор. Сферулы варьируют в размерах от 60 до 100 мкм и более в диаметре, тогда как размеры эндоспор остаются в пределах 2-5 мкм. Зрелые сферулы могут содержать от 800 до 1000 эндоспор, которые высвобождаются в ткани при разрыве сферулы. В своей паразитической фазе каждая эндоспора вырастает в новую сферулу.

Сферулы могут быть получены in vitro на специальных питательных средах (например, среда Конверса) в атмосфере повышенного содержания углекислого газа. Добавление к специальным питательным средам поверхностно-активных веществ, а также биотина, тирозина, фенилаланина, триптофана и пирокатехина ускоряет созревание сферул. Тем не менее, культуральные сферулы, как правило, гораздо меньше тканевых (до 30 мкм, реже 50 мкм) и содержат небольшое количество эндоспор.

Спороносный аппарат состоит из прямоугольных или бочонкообразных, длиной 3-6 мкм, диаметром 2-3 мкм артроспор (артроконидий), образующихся из концевых ветвей мицелия в процессе уплотнения отдельных клеток. Иногда по ходу мицелия или на его концах встречаются крупные (диаметром 8-24 мкм) хламидоспоры. Однако, этот тип спороношения не характерен для рода Coccidioides. Скорость образования артроспор на плотных средах варьирует от 4-5 до 15 дней и больше; встречаются слабо спорулирующие штаммы. В подходящих условиях из артроспоры в течение 1 сут развивается ветвящийся, септированный мицелий с характерным спорообразованием в дальнейшем.

Культуры рода Coccidioides хорошо растут на плотных и жидких средах с углеводами, на овощных и синтетических средах. При температуре 37 0С на щелочных (рН 7,2-7,4), богатых белками субстратах вырастают кожистые, почти лишенные воздушного мицелия мягкие, желтовато-коричневого цвета колонии. На более кислых средах (рН 6,5-6,8) при 28-30 0С хорошо развивается воздушный мицелий; колонии выглядят пушистыми, беловатыми, а на высоте спорообразования – мучнистыми. В некоторых колониях наблюдают концентрические зоны пушистого мицелия. Вариации колоний гриба были описаны как внутри одного штамма на разных средах, так и между разными штаммами на одной и той же среде.

В качестве источников питания возбудитель кокцидиоидомикоза использует моно-, ди - и полисахариды, окисляя, но не сбраживая их. Растет на средах с солями молочной и уксусной кислот, но при этом рост сильно угнетен; лимонную, щавелевую и виннокаменную кислоты практически не усваивает; клетчатку не разлагает. Хорошо развивается на средах, содержащих олеиновые кислоты, свиной жир, оливковое масло; использует этиловый спирт. Растет на белковых субстратах, свернутой сыворотке, на кровяном агаре, нередко с гемолизом; усваивает пептон и многие аминокислоты: аспарагин, цистин, аланин; глицерин и др.; растет на средах с мочевиной, сульфатом или хлоридом аммония. Протеолитическая активность гриба довольно яркая: он интенсивно разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку; пептонизирует и коагулирует молоко. Не восстанавливает нитраты в нитриты; не образует индола и сероводорода. Гриб растет на минеральных питательных средах с различными источниками азотистых веществ и углерода; развивается на водных вытяжках из различных образцов почвы, растет на овощах и увлажненных кусочках дерева. Дрожжевой экстракт как единственный источник питания в агаровых средах стимулирует рост и более раннее образование артроспор.

Гриб устойчив к воздействию практически всех антибактериальных антибиотиков. Это свойство используют в практической микологии для освобождения от микробной флоры подлежащих исследованию объектов внешней среды и материала от больных.

Оптимальным рН для гриба является 6,8, но диапазон, при котором он растет, варьирует от 6,5 до 7,4. Температура инкубации также может колебаться от комнатной до 41 0С, оптимум – 25-30 0С, однако, даже при 4 0С отмечается медленный рост гриба и созревание артроспор.