Инструкция

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «ЧИС» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции

(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)

Тест-система «ЧИС» для выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в одном формате:

Формат EPh – для выявления ДНК Gallus gallus и Sus scrofa методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

I. Общие положения

1 Форматы и формы выпуска тест-системы:

Формат EPh

Тест-система «ЧИС» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах комплектации:

Форма 1 включает:

-  «ДНК-сорб-С» вариант 50 – комплект реагентов для экстракции ДНК из клинического материала, продуктов питания и кормов для животных;

-  «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Gallus gallus и Sus scrofa;

-  «ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Форма 2 включает:

-  «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК Gallus gallus и Sus scrofa.

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК, амплификацию ДНК Gallus gallus и Sus scrofa и электрофоретическую детекцию.

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Gallus gallus и Sus scrofa. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

1.1 Комплект реагентов «ДНК-сорб-С» вариант 50 состоит из следующих компонентов:

Буфер для лизирующего реагента 1 флакон, 20,0 см3 (мл)

Лизирующий реагент 1 пробирка, 0,85 см3 (мл)

Раствор для отмывки 1 1 флакон, 15,0 см3 (мл)

Раствор для отмывки 2 1 флакон, 50,0 см3 (мл)

Сорбент универсальный 1 пробирка, 1,25 см3 (мл)

ТЕ-буфер для элюции ДНК 1 пробирка, 5,0 см3 (мл)

Комплект реагентов рассчитан на экстракцию ДНК из 50 проб, включая контроли.

1.2 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R состоит из следующих компонентов:

ПЦР-смесь-1-R Gallus gallus / Sus scrofa 55 пробирок по 0,005 см3 (мл)

ПЦР-смесь-1-R ВКО 55 пробирок по 0,005 см3 (мл)

ПЦР-смесь-2 blue 2 пробирки по 0,6 см3 (мл)

Минеральное масло для ПЦР 1 флакон, 4,0 см3 (мл)

К+ Gallus gallus 1 пробирка, 0,2 см3 (мл)

К+ Sus scrofa 1 пробирка, 0,2 см3 (мл)

К– 1 пробирка, 0,2 см3 (мл)

Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.

К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:

ОКО 1 пробирка, 1,6 см3 (мл)

ВКО комплексный 1 пробирка, 1,0 см3 (мл)

1.3 Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 состоит из следующих компонентов:

Трис-боратный буфер (ТБЕ)

концентрированный с бромидом этидия 1 флакон, 50 см3 (мл)

Агароза для электрофореза ДНК 2 флакона по 1,7 г

Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля – 5 рядов по 24 лунки).

2 Упаковка и маркировка.

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.

Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначения ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

3 Транспортирование и хранение.

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов «ДНК-сорб-С» (кроме лизирующего реагента) хранить при температуре от 2 до 25 °С. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» и лизирующий реагент (из комплекта реагентов «ДНК-сорб-С») хранить при температуре от 2 до 8 °С. Комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте.

4 Срок годности тест-системы – 12 месяцев с даты изготовления.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

5 Метод выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) основан на экстракции ДНК из материала совместно с ДНК экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО) и проведении амплификации полученной ДНК. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле.

6 Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать основные этапы ПЦР-анализа (экстракцию ДНК и проведение амплификации ДНК).

III. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Аналитическая чувствительность

Вид биологического материала	Комплект для экстракции ДНК	Комплект для амплификации и детекции	Аналитическая чувствительность, копий ДНК/мл
- Рыбная и мясная мука; - комбикорма для крупного и мелкого рогатого скота; - комбикорма для племенной птицы; - сухие и консервированные корма для непродуктивных животных; - сырые мясные продукты и мясные продукты, подвергшиеся кулинарной обработке.	«ДНК-сорб-С» вариант 50	«ПЦР-комплект» вариант 50 R	5х103 для последовательностей ДНК Gallus gallus и Sus scrofa

Аналитическая специфичность

Отсутствует положительная реакция при тестировании с ДНК животных, не принадлежащих к видам Gallus gallus и Sus scrofa.

IV. порядок отбора и подготовки проб

7 Тест-система предназначена для выявления и идентификации ДНК курицы домашней (Gallus gallus) и свиньи домашней (Sus scrofa) в кормах для животных и продуктах питания:

-  в рыбной и мясной муке;

-  в комбикормах для крупного и мелкого рогатого скота;

-  в комбикормах для племенной птицы;

-  в сухих и консервированных кормах для непродуктивных животных (собак, кошек);

-  в сырых мясных продуктах (частях туши, фарше и т. д.) и в мясных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке.

8 Взятие, транспортирование и хранение материала для исследования.

8.1 Пробы рыбной муки, сухого корма для непродуктивных животных, комбикорма, находящихся в мешках или небольших насыпях на складе, отбирают по ГОСТ 13496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб».

8.2 Консервированные корма отбирают по ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».

8.3. Каждый образец отбирают отдельным набором инструментов.

8.4 Образцы сырья, продуктов питания и кормов для животных транспортируют и хранят согласно условиям хранения, указанным производителем. Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить при температуре не выше минус 16 °C. Длительность транспортирования не должна превышать срока годности продукта.

9 Подготовка исследуемого материала.

9.1 Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, стерильные инструменты – пинцеты, скальпели, ножницы. Гомогенизацию образцов проводят с использованием стерильных ступок и пестиков или автоматических гомогенизаторов.

9.2 Пробы плотных продуктов, сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в ступку по 5 – 10 г и растирают до гомогенного состояния.

9.3 Пробу мясных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 1 ‑ 2 г, измельчают ножницами, затем растирают до гомогенного состояния.

V. Проведение ПЦР-анализа.

10 ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

10.1 ЗОНА 1 (этап 1) – для экстракции ДНК из проб:

-  стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).

-  термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

-  вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия).

-  микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, MiniSpin, Eppendorf, Германия).

-  вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

-  набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

-  одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).

-  одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, США).

-  одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).

-  штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, Axygen, США).

-  холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.

-  отдельный халат и одноразовые перчатки.

-  емкость с дезинфицирующим раствором.

-  комплект средств для обработки рабочего места.

10.2 ЗОНА 2 (этап 2) – для проведения амплификации:

-  амплификатор для пробирок 0,5 мл (например, «Терцик», ДНК-Технология», Россия, или эквивалентный); для пробирок 0,2 мл (например, GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), США, или эквивалентный).

-  ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).

-  вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

-  набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

-  одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл (например, Axygen, США).

-  штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

-  холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.

-  отдельный халат и одноразовые перчатки.

-  емкость для сброса наконечников.

-  комплект средств для обработки рабочего места.

10.3 ЗОНА 3 (этап 3) – для детекции продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле:

-  камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, SE-2, «Хеликон», Россия).

-  источник постоянного тока с напряжением 150-460 В (например, «Эльф-4», ДНК-Технология», Россия).

-  ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Латвия).

-  видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов («Биотест-1», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; BioRad, США).

-  аквадистиллятор.

-  холодильник от 2 °С до 8 °С.

-  микроволновая печь для плавления агарозы.

-  колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ ) для плавления агарозы на 250 мл.

-  мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).

-  штатив для пробирок на 0,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

-  отдельный дозатор объемом 10-40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).

-  одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).

-  пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

-  отдельный халат и одноразовые перчатки.

11 Порядок работы.

11.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала.

Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 °С до 8 °С) прогреть при температуре 64 °С до полного растворения кристаллов. Проверить сорбент – при отстаивании он должен занимать половину объема суспензии.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). В пробирки, предназначенные для исследуемых проб, внести по 10–30 мг исследуемых проб. В пробирки контролей экстракции ДНК внести по 50 мкл ОКО.

Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента. Тщательно перемешать содержимое пробирок.

Инкубировать пробирки при температуре 64 °С в течение 1 ч, периодически встряхивая на вортексе (не менее 5 раз).

Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием при 12–14 тыс об/мин в течение 5 мин.

Надосадочную жидкость в объеме 200 – 350 мкл очень аккуратно (так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отобрать отдельными наконечниками с фильтром и перенести в новые пробирки.

Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 20 мкл ВКО комплексного. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе.

Пробы прогреть 5 мин при температуре 64 °С. Еще раз перемешать и процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для сброса капель с крышки пробирки.

Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10–15 мин, перемешивая через каждые 2 мин.

Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 1 мин при 10-12 тыс об/мин на микроцентрифуге. Отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, отобрать надосадочную жидкость полностью.

Поместить пробирки в термостат при температуре 64 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 64 °С на 5–8 мин, периодически (1 раз в мин) встряхивая на вортексе.

Процентрифугировать пробирки при 12-14 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК (ДНК-проба). Указанный материал готов к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно при температуре не выше минус 16 °С.

11.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa и ПЦР-смесью-1-R ВКО для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa или ПЦР-смесью-1-R ВКО.

Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять.

В подготовленные для ПЦР пробирки под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с фильтрами, внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контроля этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa и в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО по 10 мкл К–;

б) положительный контроль (К+Gallus) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa 10 мкл К+ Gallus gallus;

в) положительный контроль (К+Sus) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa 10 мкл К+ Sus scrofa;

г) положительный контроль (К+ВКО) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО 10 мкл ВКО комплексного, разведенного в 10 раз К–.

Б. Проведение амплификации

Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1 и 2). Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (при использовании амплификатора GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) – 93 °С), поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1–3 с).

Таблица 1. Программа амплификации ДНК Gallus gallus, Sus scrofa

(ПЦР-смесь-1-R Gallus gallus/Sus scrofa)

	Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):	Амплификаторы с матричным регулированием температуры: «Ампли-3» («Биоком»); Biometra; MiniCycler, PTC-100 (MJ Research)
«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»); Omn-E (Hibaid)	GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)
цикл	температура	время	циклы	температура	время	циклы	температура	время	циклы
0	95 °С	пауза	93 °С	пауза	95 °С	пауза
1	95 °С	5 мин	1	93 °С	5 мин	1	95 °С	5 мин	1
2	95 °С	10 с	40	93 °С	10 с	40	95 °С	1 мин	40
65 °С	10 с	65 °С	25 с	65 °С	1 мин
72 °С	10 с	72 °С	25 с	72 °С	1 мин
3	72 °С	1 мин	1	72 °С	1 мин	1	72 °С	1 мин	1
4	10 °С	хранение	4 °С	хранение	10 °С	хранение

Таблица 2. Программа амплификации ДНК ВКО (ПЦР-смесь-1-R ВКО)

	Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):	Амплификаторы с матричным регулированием температуры: «Ампли-3» («Биоком»); Biometra; MiniCycler, PTC-100 (MJ Research)
«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»); Omn-E (Hibaid)	GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)
цикл	температура	время	циклы	температура	время	циклы	температура	время	циклы
0	95 °С	пауза	93 °С	пауза	95 °С	пауза
1	95 °С	5 мин	1	93 °С	5 мин	1	95 °С	5 мин	1
2	95 °С	10 с	42	93 °С	10 с	42	95 °С	1 мин	42
63 °С	10 с	63 °С	25 с	63 °С	1 мин
72 °С	10 с	72 °С	25 с	72 °С	1 мин
3	72 °С	1 мин	1	72 °С	1 мин	1	72 °С	1 мин	1
4	10 °С	хранение	4 °С	хранение	10 °С	хранение

После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР (зону 3).

Образцы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в течение недели при температуре от 2 °С до 8 °С и длительно при температуре не выше минус 16 °С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).

11.3 ЭТАП 3 (зона 3). Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле.

Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.

А. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трис-боратного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие бромид этидия, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).

Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл готового рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65–70 °С.

Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры. Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть около 0,6 см.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Б. Порядок работы

Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10–15 мкл проб и внести в лунки геля (необходимо использовать новый наконечник для каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE-2 («Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» ( ДНК технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18-20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.

По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину длины геля – 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.

Внимание! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены маской или стеклянной пластиной!

В. Дезактивация буфера и гелей.

Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

VI. Учет результатов

12. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК:

Gallus gallus – 219 п.н.

Sus scrofa – 380 п.н.

ВКО комплексный – 750 п. н.

В образце обнаружена ДНК Gallus gallus, если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa присутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 219 п. н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

В образце обнаружена ДНК Sus scrofa, если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa присутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 380 п. н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

В образце не обнаружены ДНК Gallus gallus и Sus scrofa, если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa отсутствуют специфические светящиеся полосы на уровне 219 и 380 п. н. и присутствует полоса внутреннего контроля на уровне 750 п. н. на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

Если в дорожке какого-либо образца отсутствуют все полосы (219, 380 и 750 п. н.), то результат анализа по данной пробе считается невалидным. Требуется повторно провести исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Таблица 3. Интерпретация результатов анализа

Результат ПЦР-анализа	Специфическая полоса с ПЦР-смесью-1-R ВКО	Специфическая полоса с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa
полоса 750 п. н.	полоса 380 п. н.	полоса 219 п. н.
Обнаружена ДНК Sus scrofa	Есть/Нет	Есть	Нет
Обнаружена ДНК Gallus gallus	Есть/Нет	Нет	Есть
Обнаружены ДНК Sus scrofa и ДНК Gallus gallus	Есть/Нет	Есть	Есть
Не обнаружены ДНК Sus scrofa и ДНК Gallus gallus	Есть	Нет	Нет
Невалидный	Нет	Нет	Нет

Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. табл. 4).

Таблица 4. Результаты постановки контролей

Контрольный образец	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Специфическая полоса на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО	Специфическая полоса на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa
полоса 750 п. н.	полоса 380 п. н.	полоса 219 п. н.
ОК	Экстракция ДНК	Есть	Нет	Нет
К+Sus	ПЦР	Амплификация не проводится	Есть	Нет
К+Gallus	ПЦР	Нет	Есть
К+ВКО	ПЦР	Есть	Амплификация не проводится	Амплификация не проводится
К–	ПЦР	Нет	Нет	Нет

Если для положительного контроля ПЦР (К+ Gallus gallus) отсутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 219 п. н., необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Gallus gallus.

Если для положительного контроля ПЦР (К+ Sus scrofa) отсутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 380 п. н., необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Sus scrofa.

Появление специфической полосы (219 или 380 п. н.) на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R Gallus gallus / Sus scrofa в любом из отрицательных контрольных образцов (ОК, К–) или 750 п. н. на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО в отрицательном контроле ПЦР (К–) указывает на контаминацию реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам с соответствующей ПЦР-смесью-1-R ВКО считаются недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

VII. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

13 Работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом ветеринарии.

14 Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории.

15 Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами.

16 Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром.

17 Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

18 Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты), использованные для гомогенизации, выдерживаются в растворе дезинфицирующего средства (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в течение 30 минут, моется водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и после отмывания в проточной и деионизованной воде высушиваются в сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 °С.

19 Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.

20 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или защитной маской.

21 Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ( а).

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
28.03.08	По всему тексту	Уточнены названия реагентов.
Удален прибор «GeneAmp PCR System 2400», «Applied Biosystems».
п. Транспортирование и хранение	Уточнены условия хранения тест-системы.
п. Порядок проведения ПЦР	Уточнены материалы и оборудование, требуемые для работы.
24.11.08	По всему тексту	Комплект реагентов «АмплиСенс» заменен на «ПЦР - комплект». Уточнены термины и сокращения.
25.02.09	п. Состав	Описание ОКО - прозрачная бесцветная жидкость
23.10.09	п. Проведение амплификации	В программе амплификации увеличено время денатурации с 2 до 5 минут.
16.03.10	Нижний колонтитул	Уточнены каталожные номера: VET-26-R0,2; VET-26-R0,5 (вместо VET-26-R)
25.01.13 VN	По тексту	«Выделение» заменено на «Экстракция»
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на «В–»
Удален регистрационный номер и печати
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Общие положения	Добавлены формы комплектации 1 и 2
Изменены единицы измерения объемов реагентов с мл на см3 (мл)
Нижний колонтитул	Изменены каталожные номера VET-26-R0,2-К; VET-26-R0,5-К вместо каталожных номеров VET-26-R0,2; VET-26-R0,5
23.07.13 FN	По тексту	Инструкция приведена в соответствие с шаблоном
		Выделение заменено на экстракцию
		Название раздела «Принцип проведения реакции» изменено на «Принцип метода», раздел актуализирован
		Срок годности тест-системы заменен на 12 месяцев
		Изменена нумерация разделов
		Добавлен раздел «Аналитические характеристики»
		Название раздела «Отбор и подготовка материала для исследования» изменено на «Порядок отбора и подготовки проб»
		ВКО-Л заменен на ВКО комплексный
		ПЦР-смесь-1-R Свинина-курятина заменена на ПЦР-смесь-1-R Gallus gallus / Sus scrofa
		ПЦР-смесь-1-R ВКО-Л заменена на ПЦР-смесь-1-R ВКО
		ПКО ДНК Gallus gallus заменен на К+ Gallus gallus
		ПКО ДНК Sus scrofa заменен на К+ Sus scrofa
		ДНК-буфер заменен на К–
		Название раздела «Меры личной профилактики» заменено на «Меры предосторожности», раздел актуализирован
	Проведение ПЦР-анализа	Раздел приведен в соответствие с шаблоном и актуализирован
	Микропробирки заменены на пробирки
	Аэрозольный барьер заменен на фильтр
	Емкость с дезинфицирующим раствором заменена на емкость для сброса наконечников
	Температура морозильной камеры изменена с «не выше минус 16 °С» на «от минус 24 °С до минус 16 °С»
	Удалены кавычки из следующих названий: MiniSpin, Eppendorf, Axygen, SE-2, BioRad, GeneAmp PCR System 2700, Applied Biosystems, Biometra, MiniCycler, PTC-100, MJ Research, Omn-E, Hibaid
	Учет результатов	Раздел актуализирован
	Нижний колонтитул	«Кат. №№: Формат EPh Форма 2» заменено на «Формат EPh Форма 2 Кат. №№»
31.07.13 FN	Проведение ПЦР-анализа. Проведение амплификации	В таблице 1 количество циклов для амплификатора «Терцик» исправлено с 42 на 40