Методические рекомендации

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению комплекта реагентов

для автоматического выделения РНК/ДНК
из клинического материала

«АВТО-сорб»

Методика автоматического выделения ДНК
из образцов мочи и соскобов из уретры

НАЗНАЧЕНИЕ.

Комплект реагентов предназначен для автоматического выделения ДНК из образцов мочи и соскобов из уретры с использованием прибора «X-tractor Gene» производства «Corbett Robotics», Австралия для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции.

Для выделения ДНК используется 200 мкл мочи (без предварительной обработки) или 100 мкл образца соскоба из уретры.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

Порядок работы.

Подготовка автомата «X-tractor Gene» к работе.

1.  Включить автомат «X-tractor Gene» и подготовить его к выделению ДНК/РНК, следуя инструкции к прибору.

2.  Установить в позиции, соответствующей планшету для сорбции ДНК/РНК одноразовый сепаратор или предварительно обеззараженный сепаратор, предназначенный для многоразового использования. Установить адаптер для переноса планшета для сорбции. Обеззараживание сепараторов, предназначенных для многоразового использования, следует проводить после каждой процедуры экстракции в отдельном специальном контейнере, содержащем дезинфицирующий 0,2 % раствор ДП-2Т в течение 20-24 ч. После этого сепаратор необходимо тщательно промыть водой, затем дистиллированной водой и высушить.

3.  Установить планшет для сорбции ДНК/РНК. Для выделения ДНК из образцов клинического материала из урогенитального тракта (мочи и соскобов из уретры) следует использовать планшет для сорбции Whatman GF/B или аналогичный, входящий в комплект расходных материалов для автомата «X-tractor Gene». Если для процедуры экстракции НК будут использоваться не все лунки планшета, необходимо предварительно заклеить пленкой все не используемые лунки.

4.  Установить в позиции планшета для элюции соответствующий адаптер. Поверх него установить планшет для элюции с необходимым количеством пробирок для элюции (не используемые пробирки нужно убрать), снять крышку с планшета.

5.  Установить лоток для сброса наконечников (предварительно обеззараженный, промытый водой и просушенный салфеткой) и емкость для сброса наконечников.

6.  Установить штативы с наконечниками в соответствующие позиции, снять крышки со штативов.

7.  Подготовить комплект емкостей для реагентов (2х70мл 3х170мл) с соответствующими им крышками.

Создание шаблона протокола экстракции (программирование прибора).

1.  Включить программу «X-tractor Gene» и подготовить его к выделению РНК/ДНК, следуя инструкции к прибору.

2.  Нажать кнопку на панели инструментов прибора или выбрать в меню «Wizards», затем «Vacuum DNA extraction wizard».

3.  В окне «Vacuum Extraction Wizard» поставить отметку напротив пункта «My samples are preloaded into an empty lysis block» (ручное внесение образцов в планшет для лизиса). В пункте «options» поставить 2 в строке «How many reagents are you lysing with (pre capture)?» (количество реагентов используемых при лизисе). Поставить 2 в строке «How many reagents are you washing with (post capture)?» (количество реагентов, используемых для отмывки). Нажать кнопку «Next» (далее).

4.  В окне «Table setup» проверить правильность установки типа и назначения емкостей для реагентов. Для этого навести курсор на позицию емкости, выделить ее щелчком кнопкой мыши (при этом емкость помещается в рамку красного цвета) и нажать кнопку «Set Plate». В списке слева должен быть выбран вариант «Reagents block (2x170, 2x70)». После этого нажать кнопку «Set Function» и проверить, чтобы для емкостей с реагентами была выбрана функция «Reagent» (реагент), а для планшета для лизиса с клиническими образцами «Reaction» (реакция).

Примечание - Функции позиций штативов для наконечников («Tip») и планшета для сорбции («Reaction») установлены по умолчанию и не могут быть изменены.

Нажать кнопку «Next».

5.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Configuration (1)» выбрать на схеме планшета количество и положение используемых рядов лунок планшета. Нажать кнопку «Next».

Примечание - Выбор осуществляется только для вертикальных рядов с образцами, при этом количество выбранных образцов всегда кратно 8.

6.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Configuration (2)» обозначить содержание каждой емкости с реагентами. Для этого выбрать емкость на схеме щелчком мыши, в выпадающем окне детального описания «Please enter reagent details» написать название реагента в позиции «Reagent». Указать в столбце «Exrta vol» дополнительный объем 1 (1 мл). Нажать кнопку «OK». Должны быть обозначены следующие реагенты: Лизирующий раствор, Компонент В, Раствор для отмывки 5, Раствор для отмывки 6, Буфер для элюции. Нажать кнопку «Next».

Примечание - Для емкости с клиническими образцами, сорбционной плашки и наконечников эта опция не активна.

7.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Load Pre Capture Reagent 1» задать информацию о внесении реагентов для лизиса и времени инкубации. Для этого в пункте «Select the volume and location of the lysis (or equivalent)» выбрать «Reagent» - Лизирующий раствор, установить объем реагента «Reagent volume» равный 500 мкл, установить объем образца в пункте «Sample volume» - 200 мкл. В пункте «Number of time to mix» задать количество перемешиваний - 10 раз. В пункте «Incubation» (инкубация) выбрать вариант «Timed pause» и задать время инкубации после добавления реагента 10 мин – 00:10:00. Пункт «Mix during incubation» (перемешивание во время инкубации) оставить не отмеченным. Нажать кнопку «Next».

8.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Load Pre Capture Reagent 2» выбрать в пункте «Reagent» реагент Компонент В, и в пункте «Reagent volume» ввести 700 мкл. В пункте «Number of time to mix» задать количество перемешиваний - 10 раз. В пункте «Incubation» (инкубация) выбрать вариант «Timed pause» и задать время инкубации 0 – 00:00:00. Пункт «Mix during incubation» (перемешивание во время инкубации) оставить не отмеченным. Нажать кнопку «Next».

9.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Load Capture Plate» (внесение в планшет для сорбции) установить общий объем образца, переносимого на сорбционную плашку, в пункте «Load volume» ввести 1250 мкл (загрузка образца в планшет для сорбции осуществляется в два приема). В пункте «Vacuum» поставить галочку в строке «Use vacuum at the end of each step» (использование вакуума после каждого шага), указать время включения вакуумного насоса «Vacuum run-time» – 00:03:00 (3 мин), и выбрать давление вакуума - «Vacuum pressure» - 15 kPa. Пункт «Premix lysed samples (in lysis plate) before loading into capture plate» отметить галочкой, щелкнув кнопкой мыши в боксе, и в пункте «Premix iterations» ввести 4.

10.  В этом же окне пункт «Wait for user comfirmation befor turning vacuum off?» (ждать подтверждения от оператора прежде чем выключить вакуум) можно отметить галочкой, что обеспечит возможность оператору на этапе внесения лизированных образцов в планшет для сорбции проверить, прошла ли жидкость сквозь фильтр.

Примечание - При необходимости, если жидкость в какой-либо лунке, не проходит через фильтр (что может происходить при использовании, например, образцов мазков из влагалища), оператор сможет проколоть фильтр иголкой, прежде чем автомат продолжит выполнение протокола.

Нажать кнопку «Next».

11.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard –Wash step1» (отмывка шаг 1) в пункте «Reagent» выбрать реагент Раствор для отмывки 5 и задать объем в пункте «Reagent volume» - 500 мкл. В пункте «Incubation» выбрать вариант «Timed pause» и задать время инкубации 0. В пункте «Vacuum» поставить галочку в строке «Use vacuum at the end of this step» (использование вакуума после этого шага), установить время включения вакуума «Vacuum run-time» – 00:02:00 (2 мин), и выбрать давление вакуума - «Vacuum pressure» - 25 kPa. Пункт «Wait for user confirmation before turning vacuum off» (ожидание подтверждения оператора перед отключением вакуума) оставить не отмеченным. Задать количество повторов этой операции в пункте «Perform this process» задать 1. Нажать кнопку «Next».

12.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard –Wash step2» (отмывка шаг 2) в пункте «Reagent» выбрать реагент Раствор для отмывки 6 и задать объем в пункте «Reagent volume» - 500 мкл. В пункте «Incubation» выбрать вариант «Timed pause» и задать время инкубации 0. В пункте «Vacuum» поставить галочку в строке «Use vacuum at the end of this step» (использование вакуума после этого шага), установить время включения вакуума «Vacuum run-time» – 00:02:00 (2 мин), и выбрать давление вакуума - «Vacuum pressure» - 25 kPa. Пункт «Wait for user confirmation before turning vacuum off» (ожидание подтверждения оператора перед отключением вакуума) оставить не отмеченным. Задать количество повторов этой операции - в пункте «Perform this process» ввести 2. Нажать кнопку «Next».

13.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard – Dry sample» (высушивание) в пункте «Use vacuum?» поставить галочку, в пункте «Vacuum run-time:» установить 00:05:00 (5 минут), и выбрать давление вакуума - «Vacuum pressure» - 25 kPa. Пункт «Wait for user confirmation before turning vacuum off» (ожидание подтверждения оператора перед отключением вакуума) оставить не отмеченным.

14.  В следующем окне «Vacuum Extraction Wizard –Product Removal» (элюция) в пункте «Reagent» выбрать реагент Буфера для элюции и задать объем в пункте «Reagent volume» - 150 мкл. В пункте «Incubation» выбрать вариант «Timed pause» и задать время инкубации 00:10:00 (10 минут). В пункте «Vacuum» поставить галочку в строке «Use vacuum at the end of this step» (использование вакуума после этого шага), установить время включения вакуума «Vacuum run-time» – 00:02:00 (2 мин), и выбрать давление вакуума - «Vacuum pressure» - 25 kPa. Пункт «Wait for user confirmation before turning vacuum off» (ожидание подтверждения оператора перед отключением вакуума) оставить не отмеченным. Задать количество повторов этой операции - в пункте «Perform this step» ввести 1. Нажать кнопку «Next».

15.  Сохранить полученный протокол, выбрав в основном меню File, затем Save as.

Примечание - Рекомендуется однократно создать файл c шаблоном протокола экстракции и в дальнейшем использовать его для быстрого запуска протокола, редактируя только информацию о количестве образцов и их расположении.

Порядок работы c использованием готового шаблона протокола экстракции.

1.  Лизирующий раствор и раствор для отмывки 5 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60-65 °С до полного растворения кристаллов.

2.  Включить прибор «X-tractor Gene» и подготовить его к выделению ДНК/РНК, следуя инструкции к прибору и разделу «Подготовка автомата «X-tractor Gene» к работе» данного приложения к инструкции.

3.  Запустить программу CAS Robotics 4, CAS 1820 (X-tractor Gene). Выбрать в меню нужный шаблон протокола экстракции ДНК, отредактированный в соответствии с предыдущим разделом инструкции, открыть его с помощью кнопки Open.

4.  Нажать кнопку на панели инструментов прибора или выбрать в меню «Wizards», затем «Vacuum DNA extraction wizard». В открывшемся окне выбрать ряды лунок планшета, которые будут использоваться для экстракции. Если используется весь планшет, то нажать кнопку Select All. Нажать кнопку Jump to End, в следующем окне нажать кнопку Next.

5.  Установить планшет для сорбции нуклеиновых кислот. Предварительно необходимо заклеить пленкой не используемые для выделения лунки планшета. Установить планшет с пробирками для элюции с нужным числом пробирок (не используемые пробирки нужно убрать), снять крышку с плашета для элюции.

Примечание - Перед установкой планшетов убедитесь, что в соответствующих им позициях уже находятся нужные адаптеры: сепаратор, адаптер для переноса нланшета для сорбции и адаптер для планшета для элюции (Rizer block).

6.  В отдельной емкости смешать необходимое количество Лизирующего раствора, RT-G, Компонента А и ВКО-FL (см. табл. 1). Тщательно перемешать раствор, покачивая емкость.

Таблица 1

Схема приготовления реакционных смесей

Количество проб:	8	16	24	32	40	48	56	64	72	80	88	96
Рядов в планшете	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Лизирующий раствор, мл	5	9	13	17	21	25	29	33	37	41	45	50
RT-G, мл	0,24	0,43	0,62	0,82	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0	2,2	2,4
Компонент А, мл	0,12	0,22	0,31	0,41	0,51	0,60	0,70	0,80	0,90	1,0	1,1	1,2
ВКО-FL, мл	0,20	0,36	0,52	0,68	0,84	1,00	1,16	1,32	1,48	1,64	1,80	2,0

7.  В соответствующие емкости для реагентов внести реактивы для экстракции в нужном объеме. Необходимый объем реактивов рассчитывается программой автоматически и указывается в выпадающем окошке при установке курсора на изображении соответствующей емкости в окне программы.

Внимание! Все емкости для реагентов рекомендуется закрывать соответствующими крышками. Раствор для отмывки 5 и Лизирущий раствор рекомендуется наливать в емкость не ранее чем за 15 минут перед началом выполнения протокола экстракции ДНК.

8.  Установить емкости для реактивов в нужные позиции в соответствии со схемой в выбранном протоколе. Установить штативы с наконечниками в позиции «Tip».

9.  В планшет для лизиса в каждую лунку внести соответствующую пробу – 200 мкл мочи или 100 мкл соскоба из уретры, или отрицательный контроль выделения. Если планшет используется не полностью, то пустые лунки необходимо заклеить пленкой.

10.  Установить планшет для лизиса в прибор «X-tractor Gene» и запустить выполнение протокола экстракции ДНК.

11.  Если при программировании шаблона протокола пункт «Wait for user comfirmation befor turning vacuum off?» (ждать подтверждения от оператора прежде чем выключить вакуум) отмечен галочкой, то после выполнения переноса лизированных образцов в планшет для сорбции автоматически включится режим паузы при включенном вакуумном насосе, при этом прибор будет издавать периодический звуковой сигнал. В этот момент необходимо проверить (открыв крышку прибора), что жидкость прошла сквозь фильтры и в лунках планшета для сорбции не осталось существенного количества жидкости. Убедившись в этом, закрыть крышку и нажать кнопку OK, чтобы продолжить выполнение протокола. При необходимости, если жидкость в какой-либо лунке не проходит через фильтр (что может происходить при использовании, например, образцов мазков из влагалища), проколоть фильтр иголкой, чтобы жидкость была удалена вакуумным насосом, прежде чем продолжить выполнение протокола.

12.  После завершения протокола экстракции ДНК, извлечь планшет с пробирками для элюции из прибора (закрыв его крышкой). В пробирках для элюции содержатся очищенные растворы ДНК, готовые для постановки реакции ПЦР-амплификации.

13.  Убрать все использованные планшеты и емкости для реагентов.

При завершении работы с автоматом, следуя инструкции по работе с ним, удалить адаптеры и промыть трубку вакуумного насоса. Для этого налить 50 мл воды в позицию для планшета для сорбции и нажать в главной панели инструментов программы кнопку «Clean vacuum station» (очистить автомат). После этого протереть чистой сухой салфеткой. Рекомендуется обработать поверхности в автомате с помощью УФ-лампы.
Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
29.05.12 IvI	Нижний колонтитул	«Каталожный номер» и «дата изменения» заменены на соответствующие символы
10.09.13 GA	Титульный лист	Добавлена отсканированная печать и подпись директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора